本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種積雪草酸替諾福韋二吡呋酯的化合物，包含其制備方法，還涉及該化合物的藥用用途。
背景技術(shù)：
：富馬酸替諾福韋二吡呋酯(tenofovirdisoproxilfumarate,tdf)由美國吉利德科學(xué)公司開發(fā)，是一種新型核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nrtis)，是替諾福韋的口服前體藥物，能夠有效抑制hiv-1、hiv-2病毒和肝dna病毒，具有顯著的抗病毒能力，孕婦也可使用，是國內(nèi)外臨床治療hiv病毒和hbv病毒的主要用藥。其具體結(jié)構(gòu)式如下：其中，美國吉利德科學(xué)公司在中國申請專利cn2007101962653、cn988074354和cn971974608，分別公開了富馬酸替諾福韋的化合物、劑型、合成方法及鹽式化合物。專利cn101870713a和專利103641858b報道了兩種改良的富馬酸替諾福韋二吡呋酯的合成工藝，專利cn101781335b公布了富馬酸替諾福韋酯的一種晶型及制備方法，專利cn204502513公開了一種制備富馬酸替諾福韋二吡呋酯的工藝。關(guān)于富馬酸替諾福韋二吡呋酯的專利在國內(nèi)外都有了相應(yīng)的申請。盡管富馬酸替諾福韋酯的市場價值非常大，但隨著越來越多的應(yīng)用臨床，其仍然存在一些副作用，例如，嚴(yán)重肝腫大伴脂肪變性和急性腎衰等。富馬酸替諾福韋二吡呋酯經(jīng)患者腎臟代謝造成的腎臟損傷和hiv/hbv共感染患者的治療不確定性也逐漸顯現(xiàn)。綜上，尋求比富馬酸替諾福韋二吡呋酯更少健康損傷且更良好藥效的藥物是有必要的。積雪草酸(asiaticacid，aa)又名亞細(xì)亞酸，具有烏蘇烷型骨架，是中藥積雪草提取物中的五環(huán)三萜烯類組分。專利cn101176731b公開了積雪草酸在抗纖維化方面的應(yīng)用，而專利cn103816164b則公開了一種積雪草酸鹽在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用。其結(jié)構(gòu)式如下：近年研究表明，aa具有廣泛的藥理活性，如肝保護(hù)、腎保護(hù)、抗抑郁、治療皮膚創(chuàng)傷、慢性潰瘍等。一方面，積雪草酸能夠減輕大小鼠酒精肝、d-氨基半乳糖/脂多糖(d-galn/lps)和高血脂等造成的肝損傷、減緩肝纖維化進(jìn)程；另一方面，積雪草酸又能夠減輕高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，緩解高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷以及減少細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，對糖尿病腎病大鼠起腎保護(hù)作用的同時又能緩解腎組織纖維化進(jìn)程。積雪草酸與藥物聯(lián)用成鹽也有良好的前景。專利cn102755330b，cn102755329b和cn102755328b公布了積雪草酸鹽氣霧劑、顆粒劑和微乳膠囊等劑型的制備方法。例如，將aa與13-正辛基小蘗堿(13-b-8-aa)和13-正辛基巴馬汀(b-aa)成鹽，作用于小鼠白血病細(xì)胞l1210、人慢性髓原細(xì)胞k562及人肺腺癌細(xì)胞a549，發(fā)現(xiàn)成鹽后的化合物抑制腫瘤生長的作用增強(qiáng)；aa與有抗炎、殺菌、抗癌活性的稀土硝酸鹽1∶1配合后對腫瘤細(xì)胞抑制率顯著增加。如上，替諾福韋二吡呋酯具有顯著的抗乙肝病毒的能力，積雪草酸具有肝保護(hù)、腎保護(hù)、抗抑郁、抑制腫瘤細(xì)胞等功效，然而將兩者結(jié)合起來用于藥用的相關(guān)報道卻沒有見到。本發(fā)明人出于尋求更有效地藥物和更有利于患者的目的，將二者通過合成方式有機(jī)的結(jié)合起來，驗證了本發(fā)明的設(shè)想。綜上，用積雪草酸替代富馬酸與替諾福韋酯聯(lián)合成鹽，可將富馬酸替諾福韋改良成更具潛力的具有保肝保腎功能的抗hiv病毒和hbv病毒的藥物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種積雪草酸替諾福韋二吡呋酯的化合物，即積雪草酸替諾福韋酯，其具體結(jié)構(gòu)式如下所示：式(iii)中x＝1-2，即x值可為1至2之間的任意值，其中本發(fā)明優(yōu)選值為1。本發(fā)明的另一個目的是提供上述活性化合物積雪草酸替諾福韋二吡呋酯的制備方法，其具體制備方法如下：將積雪草酸和替諾福韋二吡呋酯以適當(dāng)比例加熱攪拌溶于適當(dāng)溶劑后，升至一定溫度反應(yīng)，反應(yīng)完畢后冷卻至一定溫度，攪拌析晶一定時間，過濾，并用適當(dāng)溶劑洗滌濾餅，干燥即獲得積雪草酸替諾福韋二吡呋酯。上述制備方法中所述的溶劑沒有特殊限制，以能溶解積雪草酸和替諾福韋二吡呋酯，同時又能使積雪草酸替諾福韋酯析出為佳，本發(fā)明選用的溶劑包括異丙醇、丙酮、甲醇、dmso等單一或者混合溶劑，出于經(jīng)濟(jì)與環(huán)保的考慮，本發(fā)明特別優(yōu)選溶劑為異丙醇。上述制備方法中所述的適當(dāng)投料比例，其特征在于積雪草酸：替諾福韋二吡呋酯為1-4:1，本發(fā)明特別優(yōu)選的比例為1：1。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)替諾福韋可以與積雪草酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的鹽，而且對替諾福韋的純度要求不高，且收率高，產(chǎn)品穩(wěn)定性好、純度高。在制備工藝上也容易做到。為更好地說明本發(fā)明的制備工藝的可操作性和穩(wěn)定性，利用實施例1的樣品，按照吉利德公司的富馬酸替諾福韋酯(商品名：viread)的處方制備樣品1的相應(yīng)制劑，與市售的富馬酸替諾福韋酯原料藥、viread進(jìn)行穩(wěn)定性實驗比對，具體比對數(shù)據(jù)如下：樣品0天10天30天60天實施例199.85％99.85％99.82％99.78％外購原料藥99.90％99.88％99.82％99.75％實施例1制劑99.84％99.83％99.81％99.79％viread99.87％99.84％99.80％99.75％由上表可以看出，積雪草酸替諾福韋二吡呋酯原料與其制備的制劑皆較富馬酸替諾福韋二吡呋酯具有較好的穩(wěn)定性。本發(fā)明的目的還在于提供上述活性化合物的功效和用途，其特征在于其既有抗hbv病毒能力，又有保肝保腎的保健功效。為了更好說明上述功效，本發(fā)明通過以下實驗進(jìn)行驗證:1、通過hepg2.2.15細(xì)胞的hbsag和hbeag抑制率實驗來檢測積雪草酸替諾福韋酯的抗病毒能力。杜制可改良的尹格爾培養(yǎng)基(dmem,gibco):胎牛血清(gibco)，g418(gibo)0.38g/l，hepcs(sigma公司產(chǎn)品)2.38g/l，0.3％l-谷氨酰胺；，噻唑蘭(mtt)(sigma公司產(chǎn)品)用dmem配成0.4g/l，二甲基亞砜(dmso)(如臬市化學(xué)試劑廠)，hbeag，hbsag固相放射免疫試劑測定盒(北京北方生物技術(shù)研究所)，2.2.15細(xì)胞(引自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所)。將長滿hepg2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)瓶用0.06％胰蛋白酶-edta消化2-3min，棄消化液，加培養(yǎng)液輕輕吹打,將細(xì)胞配制成1×104/ml種于細(xì)胞培養(yǎng)板中,24孔板1ml/孔，于37℃，5％co2培養(yǎng)48h，貼壁后用于實驗。將積雪草酸、富馬酸替諾福韋和積雪草酸替諾福韋酯分別用培養(yǎng)基配成1.25，5，20μg/ml、3種濃度,分別加于24孔板,1ml/孔,每種濃度3孔,另設(shè)正常對照,培養(yǎng)于37℃,5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)，每4天收取培養(yǎng)液,并換加原濃度藥液繼續(xù)培養(yǎng)，將收集的培養(yǎng)液-20℃凍存，于第12天收集完培養(yǎng)液，即進(jìn)行hbsag和hbeag放射免疫測定，將第4、8、12天收集的培養(yǎng)液同時測定,用γ計數(shù)器測定每孔藥液cpm值。實驗重復(fù)3次。計算公式:藥物對抗原抑制百分率(％)＝細(xì)胞對照cpm-給藥組cpm/細(xì)胞對照cpm-空白對照cpm×100％。表1積雪草酸替諾福韋酯對hepg2.2.15細(xì)胞hbsag和hbeag分泌抑制率的影響上述實驗結(jié)果表明，積雪草酸基本無抗病毒活性，而所合成的積雪草酸替諾福韋酯hepg2.2.15細(xì)胞hbsag和hbeag的抑制率與富馬酸替諾福韋非常相近，說明積雪草酸與替諾福韋成鹽后對替諾福韋的抗病毒能力影響較小。2、通過對給藥小鼠alt，ast，sod和gsh-px體內(nèi)含量檢測來檢驗積雪草酸替諾福韋酯的保肝能力。肝細(xì)胞損傷時，肝細(xì)胞滲透性增加，ast和alt血清標(biāo)志物酶從細(xì)胞質(zhì)中滲透到血液中，使得血液中ast和alt濃度急劇升高。sod是機(jī)體清除活性氧的重要的抗氧化酶，其活力可反映機(jī)體抗氧化能力。sod，gsh-px活性的降低導(dǎo)致活性自由基在肝臟中的積累，也會產(chǎn)生有害的影響導(dǎo)致肝損傷和腎臟損傷。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)，丙二醛(mda)，超氧化物歧化酶(sod)，谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。60只大鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為正常對照組，aa對照組，富馬酸替諾福韋治療組和積雪草酸替諾福韋酯治療組。aa對照組，富馬酸替諾福韋治療組和積雪草酸替諾福韋酯治療組分別灌胃給予:8mg/kgaa，富馬酸替諾福韋和積雪草酸替諾福韋酯，每日1次。正常對照組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)8周。最后給藥1.5小時后，將大鼠用鹽酸氯胺酮麻醉處死(30mg/kg，iv)。肝素抗凝管(50u/ml)收集血樣。解剖摘取肝組織，并立即用冰生理鹽水洗盡表面血液，立即存儲于-80℃以供后期分析。取血樣，按照試劑盒說明書測定alt和ast血清水平。其結(jié)果如表1所示。表2積雪草酸替諾福韋酯對小鼠血清ast,alt的影響(x±s,n＝10)由上述實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，積雪草酸和成鹽后的積雪草酸替諾福韋酯能夠略微下調(diào)小鼠血清中alt，ast的含量，但富馬酸替諾福韋治療組alt，ast的含量卻有較為明顯的升高。肝組織加入冰tris-hcl(5mmol/l的含有2mmolledta，ph7.4)進(jìn)行勻漿，勻漿后4℃下1000rpm離心15min。取上清液立即用于測定sod，gsh-px。其結(jié)果如表2所示。表3積雪草酸替諾福韋酯對小鼠sod,gsh-px的影響(x±s,n＝10)檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，積雪草酸和成鹽后的積雪草酸替諾福韋酯治療組其肝臟細(xì)胞中sod和gsh-px的含量略高于正常對照組。但富馬酸替諾福韋治療組肝臟細(xì)胞中sod和gsh-px的含量則有所下降。綜上，本發(fā)明活性藥物分子積雪草酸替諾福韋酯不僅具有與富馬酸替諾福韋相近的抗hbv病毒能力，又能夠在維持體內(nèi)血清alt，ast含量的穩(wěn)定的同時清除肝損傷大鼠體內(nèi)氧自由基預(yù)防肝損傷，凸顯了積雪草酸的保肝保腎的保健功效。對于人體內(nèi)alt,ast,sod等含量的調(diào)節(jié)，有助于人體過度飲酒所致的酒精肝、長期性化學(xué)性肝損傷、肝纖維化以及肝細(xì)胞星狀病變等肝臟疾病的治療和保健，同時也對患有糖尿病腎病的患者的腎臟保健有益，是一個具有良好前景的藥物。本發(fā)明另一方面目的是提供將藥物活性分子積雪草酸替諾福韋酯制備成相應(yīng)的制劑。其中所述的制劑，其特征在于包含各種口服劑型，本發(fā)明優(yōu)選的制劑為片劑、膠囊劑。所述的藥物活性分子積雪草酸替諾福韋酯的單一制劑含量為10-500mg，本發(fā)明優(yōu)選10-300mg。附圖說明：圖1：積雪草酸替諾福韋二吡呋酯的化合物結(jié)構(gòu)具體實施方式下面通過幾個具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，對于實施例中涉及的具體數(shù)據(jù)和操作等并不構(gòu)成本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限制。實施例1：將積雪草酸(20g，41mmol)溶于100ml異丙醇,攪拌溶解后，加入替諾福韋二吡呋酯(21g，41mmol)，升溫至75℃，攪拌反應(yīng)6小時，冷卻至20℃，再攪拌2小時。過濾，用適量異丙醇洗滌濾餅，真空干燥后獲得獲得白色固體37.6g，即優(yōu)選的積雪草酸替諾福韋二吡呋酯(1:1)，純度99.85％，收率88％。其結(jié)構(gòu)解析如下：目標(biāo)化合物的ms和1h-nmr數(shù)據(jù)解析如下：ms(m/z)：[m+h+]＝1008.53。備注：積雪草酸替諾福韋酯的理論分子量為1007.52。1h-nmr(dmso)δ:11.08(brs,1h),8.72(s,1h),8.14(s,1h),6.42(s,4h),6.18(s,2h),5.31(s,1h),4.31(q,j＝8.8hz,2h),4.04(s,1h),4.00(s,1h),3.88(d,j＝9.7hz,2h),3.67(s,1h),3.45(d,j＝8.6hz,2h),3.25(q,j＝9.5hz,1h),3.20-3.23(m,1h),2.99-3.03(m,1h),2.77(s,1h),2.46(t,j＝9.1hz,1h),2.08(s,1h),1.93(t,j＝9.2hz,2h),1.64(q,j＝10.4hz,2h),1.60(d,j＝11.0hz,2h),1.52(d,j＝10.2hz,2h),1.49(t,j＝10.4hz,2h),1.39-1.41(m,6h),1.35-1.33(m,14h),1.28(s,3h),1.25(t,j＝10.1hz,2h),1.22(d,j＝9.7hz,3h),1.17(s,6h),1.14(s,3h),1.07(d,j＝10.5hz,6h).從以上數(shù)據(jù)可得知，目標(biāo)化合物的ms和1h-nmr譜圖所示結(jié)構(gòu)均與優(yōu)選積雪草酸替諾福韋酯(1:1)的結(jié)構(gòu)相符。實施例2：將積雪草酸(80g，16.4mmol)溶于200ml異丙醇,攪拌溶解后，加入替諾福韋二吡呋酯(42g，8.0mmol)，升溫至90℃，攪拌20小時，冷卻至室溫，再攪拌2小時。過濾，用異丙醇洗滌濾餅，真空干燥后獲得獲得白色固體67.7g，即積雪草酸替諾福韋二吡呋酯(2：1)，純度99.5％，收率84％。實施例3：取放大實施例1制備獲得的積雪草酸替諾福韋二吡呋酯300g，乳糖50g，微晶纖維素25g、微粉硅膠2g，硬脂酸鎂2.5g填充入空心膠囊。上述積雪草酸替諾福韋二吡呋酯膠囊的制備方法包括下列工藝步驟：(1)稱取上述質(zhì)量積雪草酸替諾福韋二吡呋酯、乳糖、微晶纖維素、微粉硅膠過80目篩；(2)將過完篩的積雪草酸替諾福韋二吡呋酯、乳糖、微晶纖維素、微粉硅膠置于烘箱中，85～90℃干燥4h；(3)將乳糖、微晶纖維素和微粉硅膠混合均勻，然后加入積雪草酸替諾福韋二吡呋酯再次混合均勻；(4)使用干法制粒機(jī)進(jìn)行干法制粒，將所得顆粒過100目篩，收集20目～60目的干顆粒；(5)將20目以上的物料進(jìn)行再粉碎后和60目以下的物料進(jìn)行第二次干法制粒，將適宜大小(20目～60目)的干顆粒合并；(6)將合并后的顆粒加入上述質(zhì)量的硬脂酸鎂，混合均勻，獲得混合粒；(7)通過膠囊填充機(jī)將混合粒填充入空心膠囊，獲得積雪草酸替諾福韋二吡呋酯膠囊1000粒，每粒含活性成分積雪草酸替諾福韋二吡呋酯300mg。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12