本發(fā)明屬于植物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羥基甲氧基取代聯(lián)苯類化合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

藤黃科(Garcinia L.)植物全球約 450 種，產(chǎn)亞洲、非洲南部及波利尼西亞西部，我國有 21 種，分布于廣東、廣西、云南等南部省區(qū)。藤黃科植物還是天然呫噸酮（xanthones）類成分的主要資源之一，富含異戊烯基取代的呫噸酮（xanthones），這類成分結(jié)構(gòu)新穎多樣，且具有廣泛的藥理活性，尤以藤黃酸(gambogic acid)最具代表性，具有廣譜強(qiáng)效的抗腫瘤活性，是近年來抗腫瘤天然產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)之一，我國學(xué)者正在開發(fā)其注射液為抗腫瘤一類新藥。除呫噸酮（xanthone）類外，苯甲酮類(benzophenones)、雙黃酮類(bioflavonoids)和聯(lián)苯類(biphenyls)等化合物也是本科植物的特征性成分，也具有多種生物活性。為了更有效地利用我國藤黃科植物資源，從中尋找具有開發(fā)前景的活性成分，我們選擇對藤黃科植物開展較系統(tǒng)的活性成分研究工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是提供一種聯(lián)苯類化合物；第二目的在于提供所述聯(lián)苯類化合物的制備方法；第三目的在于提供所述聯(lián)苯類化合物在制備抗輪狀病毒藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的聯(lián)苯類化合物是以干燥的藤黃科喬木枝條、葉或果實(shí)為原料，經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜分離得到的，該化合物分子式為C₁₃H₁₂O₄，命名為[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol，具有下述結(jié)構(gòu)式：

。

本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的聯(lián)苯類化合物的制備方法，是以干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)為原料，經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜分離獲得，具體為：

A、浸膏提?。簩⑻冱S科喬木枝條、葉或果實(shí)粗粉碎到 20~40 目，用有機(jī)溶劑超聲提取 2~4 次，每次 40~60min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮提取液至 1/4 ~ 1/2 體積時，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏a；

B、有機(jī)溶劑萃取：浸膏 a 中加入重量比 1~2 倍量的水，用與水等體積的有機(jī)溶劑萃取 3~5 次，合并有機(jī)溶劑萃取相，減壓濃縮成浸膏b；

C、硅膠柱層析：將浸膏 b 用重量比 1.5~2.5 倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的100~200目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析，裝柱硅膠為 200~300目，用量為浸膏 b 重量 6~8 倍量；用體積比為 1:0~0:1 的混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng) TLC 監(jiān)測，合并相同的部分；

D、反相柱層析：將以 4:1 配比的有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫得到的洗脫液上反相柱層析，反相柱是用反相材料C-8、C-18、ODS或MCI裝柱；用體積含量為 20~100% 的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng) TLC 監(jiān)測，合并相同的部分；

E、高效液相色譜分離：將以體積含量 45~75% 甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液經(jīng)高效液相色譜分離純化，即得所述的聯(lián)苯類化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol；

F、E步驟所述的高效液相色譜分離純化是以50~70% 的甲醇為流動相，流速10~14 mL/min，21.2′ 250 mm，5 mm 的反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為 254 nm，每次進(jìn)樣 45~60 mL，收集 15~35min的色譜峰，多次累加后蒸干。即得所述的聯(lián)苯類化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

本發(fā)明聯(lián)苯類化合物是首次被分離出來的，通過核磁共振和其他波譜技術(shù)測定方法確定為聯(lián)苯類化合物，并表征其具體結(jié)構(gòu)為：

化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol，為橙黃色膠狀物；紫外光譜（溶劑為甲醇），λ_max（log e）：568 (1.79), 270 (3.43), 206 (3.80)nm；紅外光譜（溴化鉀壓片）n_max 3 409, 1 612, 1 508, 1 464, 1 440, 1 317, 1 251, 1 204, 1 177, 1 104, 962, 821, 663, 590, 540, 525 cm^–1； HRESIMS顯示本發(fā)明化合物準(zhǔn)分子離子峰 m/z232.0731 [M]⁺（計算值為232.0736），結(jié)合¹³C和¹H NMR譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖3）給出其分子式為 C₁₃H₁₂O₄。¹H NMR（CD₃OD，500 MHz）和¹³C NMR（CD₃OD，125 MHz）數(shù)據(jù)，見圖3。

HRESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為 232.0731 [M]⁺，結(jié)合¹³C NMR譜確定分子式為 C₁₃H₁₂O₄。紅外吸收光譜在 3409 cm^-1表明羥基的存在。¹³C NMR（表 1）和 DEPT譜顯示 13 個碳信號,其中包括 1 個甲氧基、 6 個次甲基、 6 個芳香碳。¹H-NMR 數(shù)據(jù)顯示有兩個間位芳香質(zhì)子信號 [δ_H 6.64 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2) 和 6.65 (1H, d, J =1.9 Hz, H-6)] 和一個對二取代的苯環(huán)質(zhì)子信號 [δ_H 7.35 (2H, d, J =8.5 Hz, H-2’, H-6’) 和 6.80 (2H, d, J =8.5 Hz, H-3’, H-5’)],表明它是一個聯(lián)苯結(jié)構(gòu)。在 HMBC中，根據(jù)甲氧基的氫在 δ_H 3.87 (J =10.8, 5.6 Hz) 和 C-3（δ_C 149.9）相關(guān)，可證實(shí)甲氧基取代在C-3。在HMBC中，H-2 和 H-6 與 C-1’ 相關(guān)，H-2’ 和 H-6’ 與C-1相關(guān)，也證實(shí)了聯(lián)苯結(jié)構(gòu)。根據(jù)碳信號為季碳的 C-4, C-5, C-4’ 和它的分子式，三個羥基分別位于 C-4、C-5 和 C-4’。因此，化合物 1 的結(jié)構(gòu)如圖 1 所示,并將其命名為 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的聯(lián)苯類化合物在制備抗輪狀病毒藥物中的應(yīng)用。經(jīng)抗輪狀病毒活性實(shí)驗，選用病毒唑作為對照，[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol對輪狀病毒的 CC₅₀和 EC₅₀值分別為185.5 和 12.6 μmol/L，其具有較好的抗輪狀病毒活性。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡單活性好，可作為抗輪狀病毒藥物的先導(dǎo)性化合物，有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖 1 為化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol的核磁共振碳譜（¹³C NMR）。

圖 2 為化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol的核磁共振氫譜（¹H NMR）。

圖3 為化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)歸屬（溶劑為CD₃OD）(125 and 500 MHz)。

圖4為化合物的抗輪狀病毒活性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述的聯(lián)苯類化合物是以干燥的藤黃科喬木的枝條、葉或果實(shí)為原料，經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜分離得到的，該化合物分子式為 C₁₃H₁₂O₄，命名為[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol，具有下述結(jié)構(gòu)式：

。

本發(fā)明所述的聯(lián)苯類化合物的制備方法，其特征在于是以干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)為原料，經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜分離獲得，具體為：

A、浸膏提?。簩⑻冱S科喬木枝條、葉或果實(shí)粗粉碎到 20~40 目，用有機(jī)溶劑超聲提取 2~4 次，每次 30~60 min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮提取液至 1/4 ~ 1/2 體積時，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏 a；

B、有機(jī)溶劑萃?。航?a 中加入重量比 1~2 倍量的水，用與水等體積的有機(jī)溶劑萃取 3~5 次，合并有機(jī)溶劑萃取相，減壓濃縮成浸膏 b；

C、硅膠柱層析：將浸膏 b 用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重 0.8~1.2 倍的 100~200 目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析，裝柱硅膠為 200~300 目，用量為浸膏 b 重量 6~8 倍量；用體積比為 1:0~0:1 的混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng) TLC 監(jiān)測，合并相同的部分；

D、反相柱層析：將以 9:1 配比的有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫得到的洗脫液上反相柱層析，反相柱是用反相材料 C-18 裝柱；用體積含量為 20~100% 的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng) TLC 監(jiān)測，合并相同的部分；

E、高效液相色譜分離：將以體積含量 45~75% 甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液經(jīng)高效液相色譜分離純化，即得所述的聯(lián)苯類化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol；

F、E步驟所述的高效液相色譜分離純化是以 50~70% 的甲醇為流動相，流速10~14 mL/min，21.2′ 250 mm，5 mm 的Zorbax PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為 254 nm，每次進(jìn)樣 45~60 mL，收集 15~35 min的色譜峰，多次累加后蒸干。即得所述的聯(lián)苯類化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol；

A步驟所述的有機(jī)溶劑為 70~100% 的丙酮、乙醇或甲醇；

B步驟所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯；

C步驟所述的混合有機(jī)溶劑為正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；

C步驟所述的混合有機(jī)溶劑的體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1；

本發(fā)明所述的聯(lián)苯類化合物在制備抗輪狀病毒藥物中的應(yīng)用；

本發(fā)明所述的藤黃科植物不受地區(qū)和品種限制，均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

實(shí)施例1

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí) 5.8 kg，粗粉碎至 40 目，用 70% 的丙酮超聲提取 4 次，每次 60min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的 1/4；靜置，濾除沉淀物，濃縮成 368 g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 500g 水，用與水等體積的氯仿萃取 5 次，合并萃取相，減壓濃縮成 247 g 浸膏 b；用 200 目硅膠 1600g 裝柱，在浸膏 b 中加入 600g 的丙酮溶解，然后加入 100 目硅膠 250g 拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為 1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1 的氯仿-甲醇混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分，得到8個部分，體積比 9:1 的氯仿-甲醇混合有機(jī)溶劑的洗脫液 c 為 63 g；用反相材料 C-18 裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70%甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以60%的甲醇為流動相，流速10mL/min，21.2′250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254 nm，每次進(jìn)樣50mL，收集18min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

實(shí)施例2

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)3 kg，粗粉碎至20目，用100% 的乙醇超聲提取2次，每次60 min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/3；靜置，濾除沉淀物，濃縮成276 g浸膏a；在浸膏a中加入460 g的水，用與水等體積的氯仿萃取 3次，合并萃取相，減壓濃縮成158 g浸膏b；用100~200目硅膠1200 g裝柱，在浸膏b中加入320g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠160 g 拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的正己烷-丙酮混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為73 g；用反相材料C-8裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70% 甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以68% 的甲醇為流動相，流速14 mL/min，21.2′250 mm，5 mm的Zorbax PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254 nm，每次進(jìn)樣45 mL，收集27 min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

實(shí)施例3

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)6 kg，粗粉碎至30目，用80%的甲醇超聲提取4次，每次30 min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/2；靜置，濾除沉淀物，濃縮成532 g浸膏a；在浸膏a中加入700g的水，用與水等體積的乙醚萃取4次，合并萃取相，減壓濃縮成392g浸膏b；用180目硅膠 2900g 裝柱，在浸膏b中加入600g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠 400 g拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為45 g；用反相材料ODS裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70% 甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以55%的甲醇為流動相，流速12 mL/min，21.2 ′ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254 nm，每次進(jìn)樣50 mL，收集23 min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

實(shí)施例4

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)5.3 kg，粗粉碎至40目，用90% 的乙醇超聲提取3次，每次45 min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，濃縮成473 g浸膏a；在浸膏a中加入780 g的水，用與水等體積的石油醚萃取4次，合并萃取相，減壓濃縮成265g 浸膏b；用160目硅膠1450 g裝柱，在浸膏b中加入390 g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠265g 拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的石油醚-丙酮混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為52 g；用反相材料MCI裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100% 的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70 % 甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以70% 的甲醇為流動相，流速10 mL/min，21.2 ′ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254 nm，收集17 min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

實(shí)施例5

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)10 kg，粗粉碎至20目，用70%的甲醇超聲提取4次，每次35 min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/2；靜置，濾除沉淀物，濃縮成879g浸膏a；在浸膏a中加入1700g的水，用與水等體積的苯萃取5次，合并萃取相，減壓濃縮成445g浸膏b；用200目硅膠3330 g裝柱，在浸膏b中加入900 g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠580g拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的石油醚-乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為105 g；用反相材料C-18裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100% 的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70% 甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以50%的甲醇為流動相，流速12 mL/min，21.2 ′250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254 nm，收集36 min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

實(shí)施例6

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)8.1 kg，粗粉碎至20目，用100%的丙酮超聲提取4次，每次30 min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/2；靜置，濾除沉淀物，濃縮成638g浸膏a；在浸膏a中加入1200g的水，用與水等體積的苯萃取5次，合并萃取相，減壓濃縮成362g浸膏b；用200目硅膠2400 g裝柱，在浸膏b中加入500 g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠400g拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的石油醚-乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為87 g；用反相材料ODS裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100% 的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70% 甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以62%的甲醇為流動相，流速12 mL/min，21.2 ′250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254 nm，收集27 min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

實(shí)施例7

取實(shí)施例1制備的化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol，為橙黃色膠狀物；測定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)：

（1）紫外光譜（溶劑為甲醇），λ_max（log e）：568 (1.79), 270 (3.43), 206 (3.80) nm；

（2）紅外光譜（溴化鉀壓片）3409, 1612, 1508, 1464, 1440, 1317, 1251, 1204, 1177, 1104, 962, 821, 663, 590, 540, 525 cm^–1；

（3）HRESIMS顯示本發(fā)明化合物準(zhǔn)分子離子峰m/z 232.0731 [M]⁺（計算值為232.0736），結(jié)合¹³C 和¹H NMR譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖3）給出其分子式為C₁₃H₁₂O₄。¹H NMR（CD₃OD，500 MHz）和¹³C NMR（CD₃OD，125 MHz）數(shù)據(jù)，見圖3。

HRESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為232.0731 [M]⁺，結(jié)合¹³C NMR譜確定分子式為 C₁₃H₁₂O₄。紅外吸收光譜在3409 cm^-1 表明羥基的存在。¹³C NMR（圖1）和 DEPT譜顯示13個碳信號,其中包括1個甲氧基、6個次甲基、6個芳香碳。¹H-NMR 數(shù)據(jù)顯示有兩個間位芳香質(zhì)子信號[δ_H 6.64 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2) 和 6.65 (1H, d, J =1.9 Hz, H-6)] 和一個對二取代的苯環(huán)質(zhì)子信號[δ_H 7.35 (2H, d, J =8.5 Hz, H-2’, H-6’) 和 6.80 (2H, d, J =8.5 Hz, H-3’, H-5’)],表明它是一個聯(lián)苯結(jié)構(gòu)。在 HMBC中，根據(jù)甲氧基的氫在 δ_H3.87 (J =10.8, 5.6 Hz) 和 C-3（δ_C 149.9）相關(guān)，可證實(shí)甲氧基取代在C-3。在HMBC中，H-2 和 H-6 與 C-1’ 相關(guān)，H-2’ 和 H-6’ 與C-1相關(guān)，也證實(shí)了聯(lián)苯結(jié)構(gòu)。根據(jù)碳信號為季碳的C-4, C-5, C-4’和它的分子式，三個羥基分別位于C-4、C-5和C-4’。因此，化合物1的結(jié)構(gòu)如圖1所示,并將其命名為 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

實(shí)施例8

取實(shí)施例2制備的化合物，為橙黃色膠狀物；按實(shí)施例6中的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實(shí)施例6，分子式為C₁₃H₁₂O₄。確認(rèn)實(shí)施例2制備的化合物為所述的聯(lián)苯類化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)歸屬見圖3所示。

實(shí)施例9

取實(shí)施例3制備的化合物，為橙黃色膠狀物；按實(shí)施例6中的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實(shí)施例6，分子式為C₁₃H₁₂O₄。確認(rèn)實(shí)施例3制備的化合物為所述的聯(lián)苯類化合物 [1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

實(shí)施例10

取實(shí)施例4制備的化合物，為橙黃色膠狀物；按實(shí)施例6中的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實(shí)施例6，分子式為C₁₃H₁₂O₄。確認(rèn)實(shí)施例4制備的化合物為所述的聯(lián)苯類化合物[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol。

實(shí)施例11

取實(shí)施例1~6所制備的任一聯(lián)苯類化合物進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測試驗，試驗情況如下：

細(xì)胞株：恒河猴腎細(xì)胞系(MA-104)

實(shí)驗設(shè)計: MA-104細(xì)胞與不同濃度化合物溫育72小時, 每株細(xì)胞的實(shí)驗均重復(fù)一次, 用兩次實(shí)驗的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 采用改良MTT 法評價化合物對細(xì)胞增殖的抑制程度, 計算抑制率, 根據(jù)抑制率采用Logit方法計算IC₅₀, 比較化合物的體外抗腫瘤活性。

EC₅₀ 即指半數(shù)有效濃度，是指引起50％ 試驗動物產(chǎn)生某一特定反應(yīng)，或是某反應(yīng)指標(biāo)被抑制一半時的濃度。

CC₅₀ 即指半數(shù)細(xì)胞毒性濃度，是指對半數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用所需濃度。在本實(shí)驗中，指致50％ 細(xì)胞死亡所需的藥物濃度。

化合物細(xì)胞毒性測定

化合物用二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶解，于微波消毒 10 min，用 MEM 配成 l mg/mL 的母液備用，MEM 溶液稀釋成所需濃度。96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加 l × 10⁵ /mL 濃度的 MA-104 細(xì)胞懸液，100 ul/孔，37℃、5% CO₂ 孵箱培養(yǎng) 24h，在生長良好的單層細(xì)胞上分別加入濃度分別為 l mg/mL、0.2 mg/mL、40 ug/mL、8 ug/mL、1.25 ug/mL 的化合物;100 ul/孔，每個濃度設(shè) 3 個復(fù)孔，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。置于 37℃，5% CO₂ 孵箱繼續(xù)培養(yǎng) 24h 后，MTT 法檢測細(xì)胞存活率。

化合物對病毒感染預(yù)防作用

以濃度為 10⁴/mL，每孔 l00ul 接種細(xì)胞于 96 孔板中，培養(yǎng) 24 小時，見細(xì)胞長成單層并生長狀況良好，用濃度分別為 100 ug/mL、75 ug/mL、50 ug/mL、25 ug/mL、l ug/mL 的化合物在 37℃ 孵箱預(yù)先作用細(xì)胞 1.5 h，PBS 洗滌后以100TCID 50/mL 的輪狀病毒每孔 100ul 吸附 1h 后棄去，加 MEM 培養(yǎng)基 100 ul/孔 維持，置 37℃、5% CO₂ 孵箱，每日觀察細(xì)胞病變情況。48h 后以 MTT 法檢測病毒抑制率。

細(xì)胞存活率測定

采用 MTT 法，在培養(yǎng) 48h 的細(xì)胞中加入 5mg/mL 甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) 20 ul，繼續(xù)培養(yǎng) 3-4 h，棄上清，加入 DMSO 每孔 100 ul，振蕩使孔內(nèi)結(jié)晶完全溶解后立即在 490 nm 波長下測定吸光度 A 值：

細(xì)胞存活率=藥物組平均 A 值/細(xì)胞對照組 A 值× 100%

病毒抑制率=[實(shí)驗組平均 A 值一病毒對照組平均A值]/[細(xì)胞對照組平均A 值一病毒對照組平均 A 值] × 100%

治療指數(shù)(TI)=半數(shù)毒性濃度(CC₅₀)/半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

實(shí)驗結(jié)果

實(shí)驗結(jié)果表明：經(jīng)抗輪狀病毒活性實(shí)驗，選用病毒唑作為對照，[1,1’-biphenyl]-3-methoxy-4,4’,5-triol對輪狀病毒的 CC₅₀和 EC₅₀值分別為 185.5 和 12.6 μmol/L，其具有較好的抗輪狀病毒活性（如圖4所示）。