1.一種含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的分析方法,其特征在于,具體步驟如下:
S1、采用酶法或堿法方法提取動(dòng)物組織中的多糖;
S2、將步驟S1制得的多糖用陰離子交換樹脂處理,分別用1.3M和3M的NaCl溶液洗脫,收集的洗脫液超濾脫鹽、冷凍干燥,得到含糖醛酸多糖;
S3、將步驟S2制得的含糖醛酸多糖用1.3M三氟乙酸在105℃水解3h,加入甲醇或水除酸并干燥,得到二糖產(chǎn)物;
S4、將步驟S3制得的二糖產(chǎn)物用水溶解,然后依次加入還原胺試劑溶液、氰基硼氫化鈉溶液,得到混合溶液,所述混合溶液中二糖產(chǎn)物與還原胺試劑、氰基硼氫化鈉的最終摩爾濃度比為1:1~4:1~4;
所述還原胺試劑為3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基苯甲酸乙酯、4-氨基苯腈、7-氨基-4-甲基香豆素、2-氨基苯腈、2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺或2-氨基吖啶酮中的任意一種;
所述還原胺試劑溶液的濃度為0.1~0.4M,所述氰基硼氫化鈉溶液的濃度為0.2~1.0M;所述二糖產(chǎn)物水溶液的濃度為0.05~0.1M;
再加入占所述混合溶液總體積5~10%的冰乙酸,50~80℃水浴1~4h,制備含糖醛酸多糖二糖的還原胺衍生物,冷卻至室溫,濃縮或氮吹至干燥,加水溶解,所述還原胺衍生物的濃度為0.01M~0.05M,用氨水調(diào)pH至8~10;加入等體積的氯仿萃取,收集水相,重復(fù)三次,收集的水相作為供試液;
S5、采用配備反相色譜柱的高效液相色譜-多級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)步驟S4制得的供試液,指認(rèn)目標(biāo)色譜峰,根據(jù)不同還原胺衍生試劑的特征離子信號(hào)分析二糖還原胺衍生物,進(jìn)而得出含糖醛酸二糖的種類;
色譜條件:
Hypersil GOLD C18(150×2.1mm,5μm)色譜柱,柱溫30℃,流動(dòng)相20mmol乙酸銨-乙腈(85:15,V/V),流速0.5mL/min;
質(zhì)譜條件:
離子源ESI源,噴霧電壓4.5kV,毛細(xì)管溫度為275℃,毛細(xì)管電壓為37V,鞘氣:40AU,輔助氣:10AU,正離子模式檢測(cè),掃描方式為全掃描(Full Scan),掃描范圍為100-2000(m/z)。
2.權(quán)利要求1所述含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:
T1、采用酶法或堿法方法提取動(dòng)物組織中的多糖;
T2、將步驟T1制得的多糖用陰離子交換樹脂處理,分別用1.3M和3M的NaCl溶液洗脫,收集的洗脫液超濾脫鹽、冷凍干燥,得到含糖醛酸多糖;
T3、將步驟T2制得的含糖醛酸多糖用1.3M三氟乙酸在105℃水解3h,加入甲醇或水除酸并干燥,得到二糖產(chǎn)物;
T4、將步驟T3制得的二糖產(chǎn)物用水溶解,然后依次加入還原胺試劑溶液、氰基硼氫化鈉溶液,得到混合溶液,所述混合溶液中二糖產(chǎn)物與還原胺試劑、氰基硼氫化鈉的最終摩爾濃度比為1:1~4:1~4;
所述還原胺試劑為3-氨基-9-乙基咔唑、4-氨基苯甲酸乙酯、4-氨基苯腈、7-氨基-4-甲基香豆素、2-氨基苯腈、2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺或2-氨基吖啶酮中的任意一種;
所述還原胺試劑溶液的濃度為0.1~0.4M,所述氰基硼氫化鈉溶液的濃度為0.2~1.0M;所述二糖產(chǎn)物水溶液的濃度為0.05~0.1M;
再加入占所述混合溶液總體積5~10%的冰乙酸,50~80℃水浴1~4h,制備含糖醛酸多糖二糖的還原胺衍生物,冷卻至室溫,濃縮或氮吹至干燥,加水溶解,所述還原胺衍生物的濃度為0.01M~0.05M,用氨水調(diào)pH至8~10;加入等體積的氯仿萃取,收集水相,重復(fù)三次,收集的水相作為供試液;
T5、以體積濃度為15~40%的甲醇水溶液為流動(dòng)相,采用制備型ODS反相色譜柱進(jìn)行分離步驟T4制得的供試液,通過保留時(shí)間判斷并收集含糖醛酸二糖還原胺衍生物的流份,在45℃、800rpm條件下真空冷凍離心濃縮至干燥,得到含糖醛酸二糖還原胺衍生物;
色譜條件:半制備液相色譜系統(tǒng)(依利特);Sino Chrome ODS-BP(10×300mm,5μm)色譜柱;柱溫30℃;流速5mL/min;流動(dòng)相為水(A)/甲醇(B)=80/20等度洗脫;
T6、向步驟T5制得的含糖醛酸二糖還原胺衍生物中加入由水、乙酸、體積濃度為30%的H2O2水溶液按體積比5~10:1:1混合制得的溶液,所述含糖醛酸二糖還原胺衍生物的終濃度為0.05~10mg/ml;30~70℃孵育12~24h,濃縮蒸發(fā)或氮吹至干燥;加水溶解并用等體積的氯仿萃取,收集水層、濃縮蒸發(fā)干燥,得到固相即為含糖醛酸二糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的制備方法,其特征在于,步驟T1所述酶解或堿解提取多糖的處理方法為:
首先將動(dòng)物組織預(yù)處理,攪碎或斬拌;
所述酶解的具體過程為:將經(jīng)過預(yù)處理的動(dòng)物組織按質(zhì)量體積比1:5~30(g/ml)置于pH=8的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液,加入所述磷酸鹽緩沖溶液10~20%體積的0.05mol/L半胱氨酸-EDTA-2Na溶液,再加入占所述動(dòng)物組織質(zhì)量0.5%的胰蛋白酶,37℃水浴震蕩酶解4h,之后加入占所述動(dòng)物組織質(zhì)量0.5%的木瓜蛋白酶,65℃水浴震蕩酶解3h,100℃滅酶,10000rpm離心20min,收集上清液,加入3倍體積的無水乙醇,醇沉,收集固相即為動(dòng)物組織中的多糖;
使用堿解的具體過程為:將經(jīng)過預(yù)處理的動(dòng)物組織置于2~5倍質(zhì)量的水中,用NaOH溶液調(diào)pH至9,55℃加熱攪拌2h,10000rpm離心20min,收集上清液,加入3倍體積無水乙醇,醇沉,收集固相即為動(dòng)物組織中的多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的制備方法,其特征在于,步驟T2具體為:取步驟T1制備的多糖溶于水,采用強(qiáng)陰離子大孔吸附樹脂處理,先用1.3M的NaCl溶液洗脫3~5個(gè)柱體積,收集洗脫液;再用3M的NaCl溶液洗脫3~5個(gè)柱體積,收集洗脫液;將兩次收集的洗脫液分別用截留分子量為3000~10000Da的超濾膜超濾脫鹽,冷凍干燥截留部分,得到含糖醛酸多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的制備方法,其特征在于,步驟T3具體為:取步驟T2制得的含糖醛酸多糖溶于1.3M的三氟乙酸溶液中,所述含糖醛酸多糖的終濃度為0.1~40mg/mL,105℃水解3h;加入甲醇或水除酸,重復(fù)三次,干燥,得到水解物。