本發(fā)明涉及一種二糖的分析及制備方法，更具體，涉及含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的分析方法及制備方法。
背景技術(shù)：
動物組織中存在一些由糖醛酸與氨基己糖或己糖交替連接構(gòu)成的含糖醛酸多糖。如肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖，都是由糖醛酸與氨基己糖連接而成的重復(fù)二糖片段構(gòu)成。此外，在一些貝類等生物中還發(fā)現(xiàn)了糖醛酸與己糖連接而成的重復(fù)二糖片段構(gòu)成的多糖，如鮑魚性腺硫酸多糖AGSP等。已有研究證實，這些含糖醛酸多糖具有多種功能活性。由于具有顯著的功能活性，一些含糖醛酸多糖已經(jīng)被開發(fā)為藥品和保健品等；此外，一些食品中存在的含糖醛酸多糖也被證實具有增強免疫力等生物活性。為了對含糖醛酸多糖產(chǎn)品進行質(zhì)量控制和營養(yǎng)評價，有必要開發(fā)這些糖醛酸多糖的檢測方法，而分析降解產(chǎn)生的二糖片段是實現(xiàn)這些多糖定性定量檢測的有效途徑。相對于多糖，寡糖分子量小，易于吸收，可能產(chǎn)生更顯著的生理活性。但由于寡糖極性大，分子結(jié)構(gòu)差別細微，因此對于寡糖的分離純化技術(shù)仍具有挑戰(zhàn)性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于實現(xiàn)含糖醛酸二糖的高效分析及制備，其中含糖醛酸二糖具體是指糖醛酸通過糖苷鍵連于己糖或氨基己糖構(gòu)成的二糖。
為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的分析方法，具體步驟如下：
S1、采用酶法或堿法方法提取動物組織中的多糖；
S2、將步驟S1制得的多糖用陰離子交換樹脂處理，分別用1.3M和3M的NaCl溶液洗脫，收集的洗脫液超濾脫鹽、冷凍干燥，得到含糖醛酸多糖；
S3、將步驟S2制得的含糖醛酸多糖用1.3M三氟乙酸在105℃水解3h，加入甲醇或水除酸并干燥，得到二糖產(chǎn)物；
S4、將步驟T3制得的二糖產(chǎn)物用水溶解，然后依次加入還原胺試劑溶液、氰基硼氫化鈉溶液，得到混合溶液，所述混合溶液中二糖產(chǎn)物與還原胺試劑、氰基硼氫化鈉的最終摩爾濃度比為1:1～4:1～4；
所述還原胺試劑為3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、4-氨基苯甲酸乙酯(p-ABEE)、4-氨基苯腈(p-ABN)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、2-氨基苯腈(o-ABN)、2-氨基苯甲酸(o-ABA)、2-氨基苯甲酰胺(o-ABAD)或2-氨基吖啶酮(AMAC)中的任意一種；
所述還原胺試劑溶液的濃度為0.1～0.4M，所述氰基硼氫化鈉溶液的濃度為0.2～1.0M；所述二糖產(chǎn)物水溶液的濃度為0.05～0.1M；
上述二糖產(chǎn)物多為二糖片段，是一種混合物，所述摩爾濃度根據(jù)所稱多糖的重量除以一個二糖的分子量(按糖醛酸+己糖-水計算)得到的物質(zhì)的量除以溶解用的水的體積粗略計算；
再加入占所述混合溶液總體積5～10％的冰乙酸，50～80℃水浴1～4h，制備含糖醛酸多糖二糖的還原胺衍生物，冷卻至室溫，濃縮或氮吹至干燥，加水溶解，所述還原胺衍生物的濃度為0.01M～0.05M，用氨水調(diào)pH至8～10；加入等體積的氯仿萃取，收集水相，重復(fù)三次，收集的水相作為供試液；
S5、采用配備反相色譜柱的高效液相色譜-多級質(zhì)譜(HPLC-MSn)檢測步驟S4制得的供試液，指認目標色譜峰，根據(jù)不同還原胺衍生試劑的特征離子信號分析二糖還原胺衍生物，進而得出含糖醛酸二糖的種類；
色譜條件：
Hypersil GOLD C18(150×2.1mm,5μm)色譜柱，柱溫30℃，流動相20mmol乙酸銨-乙腈(85:15，V/V)，流速0.5mL/min；
質(zhì)譜條件：
離子源ESI源，噴霧電壓4.5kV，毛細管溫度為275℃，毛細管電壓為37V，鞘氣：40AU，輔助氣：10AU，正離子模式檢測，掃描方式為全掃描(Full Scan)，掃描范圍為100-2000(m/z)。
不同還原胺衍生試劑的特征離子信號如表1所示。
表1
為達到上述目的，本發(fā)明還提供了上述含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的制備方法，包括如下步驟：
T1、采用酶法或堿法方法提取動物組織中的多糖；
T2、將步驟T1制得的多糖用陰離子交換樹脂處理，分別用1.3M和3M的NaCl溶液洗脫，收集的洗脫液超濾脫鹽、冷凍干燥，得到含糖醛酸多糖；
T3、將步驟T2制得的含糖醛酸多糖用1.3M三氟乙酸在105℃水解3h，加入甲醇或水除酸并干燥，得到二糖產(chǎn)物；
T4、將步驟T3制得的二糖產(chǎn)物用水溶解，然后依次加入還原胺試劑溶液、氰基硼氫化鈉溶液，得到混合溶液，所述混合溶液中二糖產(chǎn)物與還原胺試劑、氰基硼氫化鈉的最終摩爾濃度比為1:1～4:1～4；
所述還原胺試劑為3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、4-氨基苯甲酸乙酯(p-ABEE)、4-氨基苯腈(p-ABN)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、2-氨基苯腈(o-ABN)、2-氨基苯甲酸(o-ABA)、2-氨基苯甲酰胺(o-ABAD)或2-氨基吖啶酮(AMAC)中的任意一種；
所述還原胺試劑溶液的濃度為0.1～0.4M，所述氰基硼氫化鈉溶液的濃度為0.2～1.0M；所述二糖產(chǎn)物水溶液的濃度為0.05～0.1M；
上述二糖產(chǎn)物多為二糖片段，是一種混合物，所述摩爾濃度根據(jù)所稱多糖的重量除以一個二糖的分子量(按糖醛酸+己糖-水計算)得到的物質(zhì)的量除以溶解用的水的體積粗略計算；
再加入占所述混合溶液總體積5～10％的冰乙酸，50～80℃水浴1～4h，制備含糖醛酸多糖二糖的還原胺衍生物，冷卻至室溫，濃縮或氮吹至干燥，加水溶解，所述還原胺衍生物的濃度為0.01M～0.05M，用氨水調(diào)pH至8～10；加入等體積的氯仿萃取，收集水相，重復(fù)三次，收集的水相作為供試液；
上述還原胺衍生物的物質(zhì)的量根據(jù)二糖產(chǎn)物的物質(zhì)的量判斷。
T5、以體積濃度為15～40％的甲醇水溶液為流動相，采用制備型ODS反相色譜柱進行分離步驟T4制得的供試液，根據(jù)色譜峰收集含糖醛酸二糖還原胺衍生物的流份，在45℃、800rpm條件下真空冷凍離心濃縮至干燥，得到含糖醛酸二糖還原胺衍生物；
色譜條件：半制備液相色譜系統(tǒng)(依利特)；Sino Chrome ODS-BP(10×300mm，5μm)色譜柱；柱溫30℃；流速5mL/min；流動相為水(A)/甲醇(B)＝80/20等度洗脫；
T6、向步驟T5制得的含糖醛酸二糖還原胺衍生物中加入由水、乙酸、體積濃度為30％的H2O2水溶液按體積比5～10:1:1混合制得的溶液，所述含糖醛酸二糖還原胺衍生物的終濃度為0.05～10mg/ml；30～70℃孵育12～24h，濃縮蒸發(fā)或氮吹至干燥；加水溶解并用等體積的氯仿萃取，收集水層、濃縮蒸發(fā)干燥，得到固相即為含糖醛酸二糖。
此步驟先烘干再溶解，干燥時可達到除乙酸的目的，同時，減少氯仿用量。
優(yōu)選方式下，步驟T1所述酶解或堿解提取多糖的處理方法為：
首先將動物組織預(yù)處理，攪碎或斬拌；
所述酶解的具體過程為：將經(jīng)過預(yù)處理的動物組織按質(zhì)量體積比1:5～30(g/ml)置于pH＝8的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，加入所述磷酸鹽緩沖溶液10～20％體積的0.05mol/L半胱氨酸-EDTA-2Na溶液，再加入占所述動物組織質(zhì)量0.5％的胰蛋白酶，37℃水浴震蕩酶解4h，之后加入占所述動物組織質(zhì)量0.5％的木瓜蛋白酶，65℃水浴震蕩酶解3h，100℃滅酶，10000rpm離心20min，收集上清液，加入3倍體積的無水乙醇，醇沉，收集固相即為動物組織中的多糖；
使用堿解的具體過程為：將經(jīng)過預(yù)處理的動物組織置于2～5倍質(zhì)量的水中，用NaOH溶液調(diào)pH至9，55℃加熱攪拌2h，10000rpm離心20min，收集上清液，加入3倍體積無水乙醇，醇沉，收集固相即為動物組織中的多糖。
優(yōu)選方式下，步驟T2具體為：取步驟T1制備的多糖溶于水，采用強陰離子大孔吸附樹脂處理，先用1.3M的NaCl溶液洗脫3～5個柱體積，收集洗脫液；再用3M的NaCl溶液洗脫3～5個柱體積，收集洗脫液；將兩次收集的洗脫液分別用截留分子量為3000～10000Da的超濾膜超濾脫鹽，冷凍干燥截留部分，得到含糖醛酸多糖。
優(yōu)選方式下，步驟T3具體為：取步驟S2制得的含糖醛酸多糖溶于1.3M的三氟乙酸溶液中，所述含糖醛酸多糖的終濃度為0.1～40mg/mL，105℃水解3h；加入甲醇或水除酸，重復(fù)三次，干燥，得到水解物。
上述制備方法中步驟T1～T3的優(yōu)選方案同樣適用于分析方法中的步驟S1～S3。
根據(jù)含糖醛酸多糖原料的不同，制備得到的含糖醛酸二糖還原胺衍生物的結(jié)構(gòu)可為：
己糖醛酸-(1→X)-C6H13O4N-NH-R或己糖醛酸-(1→Y)-C6H12O5-NH-R其中X可為3-6，Y可為2-6，還原胺衍生基團R如下所示：
本發(fā)明的有益效果是：
1、本發(fā)明采用酸降解，與酶法降解相比酸水解法成本低，操作簡單，而且對各種多糖都有降解作用；用氨水替代常用的NaOH，因為氨水可揮發(fā)，易于除去，利于后期的質(zhì)譜分析。
2、本發(fā)明方法適用于分析和制備己糖醛酸-氨基己糖和己糖醛酸-己糖這兩種類型的二糖。通過分析這些降解產(chǎn)生的二糖能夠?qū)崿F(xiàn)對含糖醛酸多糖的檢測分析，這些含糖醛酸多糖包括肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖，以及其他一些由糖醛酸與己糖連接而成的重復(fù)二糖片段構(gòu)成的多糖。
3、本發(fā)明采用還原胺類衍生試劑，與常用的吡唑啉酮試劑類的衍生化試劑相比，生成的二糖衍生物化學穩(wěn)定，可長期存放，并為二糖衍生物的分離制備提供了條件。
4、本發(fā)明利用糖醛酸多糖的降解產(chǎn)物分離制備己糖醛酸-氨基己糖和己糖醛酸-己糖這兩種類型的二糖，相對于選擇性控制合成的化學方法，本發(fā)明不需要復(fù)雜且冗長繁瑣的反應(yīng)步驟。
5、本發(fā)明的方法制備得到的二糖可應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和功能食品等領(lǐng)域。
附圖說明
圖1是實施例1中由青蛤多糖獲得的二糖的選擇離子色譜圖
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的分析方法及制備方法，具體步驟如下：
一種含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的分析方法：
S1、采用雙酶法酶解后醇沉提取樣品中的多糖；
S2、將所提多糖樣品溶于水，陰離子交換樹脂處理，分別用1.3M和3M的NaCl溶液洗脫，然后將收集的洗脫液分別用超濾膜(截留分子量為3000—10000Da)超濾脫鹽，截留部分為酸性多糖，最后冷凍干燥得含糖醛酸多糖。
S3、將S2所得含糖醛酸多糖溶于1.3M三氟乙酸溶液，105℃水解3h；加入甲醇，氮吹吹干，重復(fù)三次，達到除酸目的；
S4、將S3所得水解物溶于去離子水，然后加入0.2M～0.4M還原胺試劑溶液，0.2M～0.4M氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)水溶液，5％～10％冰乙酸，在70℃水浴1h；
S5、冷卻至室溫，氮吹吹干；然后加入水和等體積的氯仿，震蕩后靜置，去有機層，重復(fù)萃取三次，水層作為供試液；
S6、采用配備反相色譜柱的HPLC-MS指認目標色譜峰，分析二糖還原胺衍生物。
一種含糖醛酸二糖基于還原胺衍生化的制備方法：
S1、采用雙酶法酶解后醇沉提取樣品中的多糖；
S2、將所提多糖樣品溶于水，陰離子交換樹脂處理，分別用1.3M和3M的NaCl溶液洗脫，然后將收集的洗脫液分別用超濾膜(截留分子量為3000—10000Da)超濾脫鹽，截留部分為酸性多糖，最后冷凍干燥得含糖醛酸多糖。
S3、將S2所得含糖醛酸多糖溶于1.3M三氟乙酸溶液，105℃水解3h；加入甲醇，氮吹吹干，重復(fù)三次，達到除酸目的；
S4、將S3所得水解物溶于去離子水，然后加入0.2M～0.4M還原胺試劑溶液，0.2M～0.4M氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)水溶液，5％～10％冰乙酸，在70℃水浴1h；
S5、冷卻至室溫，氮吹吹干；然后加入水和等體積的氯仿，震蕩后靜置，去有機層，重復(fù)萃取三次，水層作為供試液；
S6、以15％～40％的甲醇水溶液為流動相，采用制備型ODS反相色譜柱進行分離，收集含糖醛酸二糖還原胺衍生物的流份，在45℃800rpm條件下真空冷凍離心濃縮。
S7、加入水：乙酸：30％H2O2(v/v)＝5～10:1:1的混合物，在30℃孵育24h，濃縮蒸發(fā)干燥，然后溶解萃取并濃縮蒸發(fā)水層干燥得含糖醛酸二糖。
實施例1
(1)將新鮮青蛤(Cyclina sinensis)清洗、去殼、攪碎，取10g置于100mL pH＝8的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，加入25mL 0.05mol/L的半胱氨酸-EDTA-2Na溶液，然后加入0.5％(m/m)的胰蛋白酶，37℃水浴震蕩酶解4h，再向其中加入0.5％(m/m)的木瓜蛋白酶65℃水浴震蕩酶解3h。之后100℃滅酶5min。在12300×g條件下離心20min。取上清液，向其中加入1.5倍無水乙醇醇沉過夜，7800×g離心15min，取沉淀。揮干乙醇，加去離子水復(fù)溶后低溫冷凍干燥得粗多糖。
(2)準確稱取粗多糖干粉2.0g溶于50mL水，強陰離子交換樹脂處理，分別用1.3M和3M的NaCl溶液洗脫，然后將收集的洗脫液分別用超濾膜(截留分子量為3000—10000Da)超濾脫鹽，最后冷凍干燥得含糖醛酸多糖。
(3)稱取(2)所得含糖醛酸多糖約10mg溶于1.0mL 1.3M三氟乙酸溶液，105℃水解3h；
(4)冷卻至室溫，氮吹吹干，然后加入0.5mL甲醇，氮吹吹干，重復(fù)三次。
(5)加入1.0mL 0.4M的3-氨基-9-乙基咔唑甲醇溶液，1.0mL 0.4M的氰基硼氫化鈉水溶液，0.2mL冰乙酸，在70℃水浴1h，冷卻至室溫，氮吹吹干；然后加入1.0mL水溶解并用氨水調(diào)pH為9.0，再加入1.0mL的氯仿，震蕩后靜置，除去有機層，重復(fù)萃取三次，水層作為供試液；
(6)采用配備反相色譜柱的HPLC-MS指認目標色譜峰，與標準品對比分析二糖還原胺衍生物，檢測到一個氨基己糖與糖醛酸組成的二糖的衍生物，且色譜峰的保留時間不同于現(xiàn)有的糖胺聚糖標準品(肝素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素)的二糖衍生物，因此說明青蛤樣品中含有新的糖胺聚糖類似物。
色譜條件：
Hypersil GOLD C18(150×2.1mm,5μm)色譜柱，柱溫30℃，流動相20mmol乙酸銨-乙腈(85:15，V/V)，流速0.5mL/min；
質(zhì)譜條件：
離子源ESI源，噴霧電壓4.5kV，毛細管溫度為275℃，毛細管電壓為37V，鞘氣：40AU，輔助氣：10AU，正離子模式檢測，掃描方式為全掃描(Full Scan)，掃描范圍為100-2000(m/z)。
實施例2
(1)將新鮮青蛤(Cyclina sinensis)清洗、去殼、攪碎，取10g置于100mL pH＝8的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，加入25mL 0.05mol/L的半胱氨酸-EDTA-2Na溶液，然后加入0.5％(m/m)的胰蛋白酶，37℃水浴震蕩酶解4h，再向其中加入0.5％(m/m)的木瓜蛋白酶65℃水浴震蕩酶解3h。之后100℃滅酶5min。在12300×g條件下離心20min。取上清液，向其中加入1.5倍無水乙醇醇沉過夜，7800×g離心15min，取沉淀。揮干乙醇，加去離子水復(fù)溶后低溫冷凍干燥得粗多糖。
(2)準確稱取粗多糖干粉2.0g溶于50mL水，強陰離子交換樹脂處理，分別用1.3M和3M的NaCl溶液洗脫，然后將收集的洗脫液分別用超濾膜(截留分子量為3000—10000Da)超濾脫鹽，最后冷凍干燥得含糖醛酸多糖。
(3)稱取(2)所得含糖醛酸多糖約0.4g溶于10.0mL 1.3M三氟乙酸溶液，105℃水解3h；
(4)冷卻至室溫，氮吹吹干，然后加入5mL甲醇，氮吹吹干，重復(fù)三次。
(5)加入10.0mL 0.4M的3-氨基-9-乙基咔唑甲醇溶液，10.0mL 0.4M的氰基硼氫化鈉水溶液，2.0mL冰乙酸，在70℃水浴1h，冷卻至室溫，氮吹吹干；然后加入5.0mL水溶解并用氨水調(diào)pH為9.0，再加入5.0mL的氯仿，震蕩后靜置，除去有機層，重復(fù)萃取三次，水層作為供試液；
(6)以15％～40％的甲醇水溶液為流動相，采用制備型ODS反相色譜柱進行分離，色譜條件：半制備液相色譜系統(tǒng)(依利特)；Sino Chrome ODS-BP(10×300mm，5μm)色譜柱；柱溫30℃；流速5mL/min；流動相為水(A)/甲醇(B)＝80/20等度洗脫，收集含糖醛酸二糖還原胺衍生物的流份，濃縮干燥。
(7)加入水：乙酸：30％H2O2(v/v)＝10:1:1的混合物，在30℃孵育24h，濃縮蒸發(fā)，然后溶解萃取并濃縮蒸發(fā)水層干燥得二糖。
圖1是實施例1中由青蛤多糖獲得的二糖的選擇離子色譜圖。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。