1.一種利用常規(guī)試劑提取RNA的方法,其特征在于:包括以下步驟:
(1)試劑配制:
0.1%DEPC水的配制:將1mL DEPC原液加入到999mL雙蒸水中,渦旋混合8~12h后,滅菌備用;
1M Tris/HCl溶液的配制:取Tris溶于0.1%DEPC水中,利用鹽酸調(diào)節(jié)PH值到8.0,用0.1%DEPC水定容,高溫高壓滅菌備用;
4M LiCl溶液的配制:取LiCl溶于0.1%DEPC水中,用0.1%DEPC水定容,高溫高壓滅菌備用;
10%SDS溶液的配制:取SDS溶于0.1%DEPC水中,用0.1%DEPC水定容,高溫高壓滅菌備用;
0.5M Na2EDTA溶液的配制:取Na2EDTA溶于0.1%DEPC水中,用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0,用0.1%DEPC水定容,高溫高壓滅菌備用;
3M醋酸鈉溶液的配制:取醋酸鈉溶于0.1%DEPC水中,冰醋酸調(diào)節(jié)PH到5.2,用0.1%DEPC水定容,高溫高壓滅菌備用;
(2)混合試劑配制:
取1M Tris/HCl溶液、4M LiCl溶液、10%SDS溶液和0.5M Na2EDTA溶液加入容量瓶中,鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,并用0.1%DEPC水定容,配制成混合試劑,滅菌備用,所述的混合試劑中Tris的濃度為0.1M、LiCl的濃度為0.4M、SDS的濃度為1%、Na2EDTA的濃度為10mM;
(3)待提取物準備:
取待提取的鮮嫩植物組織樣品置于裝有液氮的冷研缽中,液氮保護下快速將組織樣品研磨成組織粉末;將研磨好的組織粉末迅速轉(zhuǎn)移至提前預冷的離心管中,-80℃貯藏備用;
(4)RNA提?。?/p>
將步驟(3)貯藏的裝有組織粉末的離心管轉(zhuǎn)移到液氮中;將步驟(2)配制的混合試劑和PH<7的水飽和酚按照1:1的比例混合為RNA提取液,在80℃水浴中預熱;吸取1體積份RNA提取液迅速加入到裝有組織粉末的離心管中,充分震蕩至組織粉末充分溶解,繼續(xù)渦旋震蕩30秒后,加入0.5體積份氯仿-異戊醇混合液,繼續(xù)渦旋震蕩30秒;然后在4℃溫度下離心5min,上層水相轉(zhuǎn)移到另一個離心管中,加入同等體積的氯仿-異戊醇混合液,繼續(xù)渦旋震蕩30秒,再在4℃溫度下離心5min,上層水相轉(zhuǎn)移到另一個離心管中,加入同等體積濃度為4M的LiCl溶液,充分上下顛倒混勻后在4℃溫度下溫育8~12h;
取出溫育的樣品,在4℃溫度下離心20min,棄去上清液,加入1mL 70%的酒精,離心5mim漂洗沉淀,棄去上清液,在通風櫥中晾干;加入0.15體積份DNA酶處理液,冰浴15~30min使沉淀溶解,然后37℃水浴30min,加入0.15體積份0.1%DEPC水,再加入等體積PH<5.0的苯酚-氯仿-異戊醇混合液,渦旋混勻,離心5min;將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中,加入等體積氯仿-異戊醇混合液,渦旋混勻,離心5min;將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中,再加入0.1體積份PH為5.2的3M醋酸鈉溶液和2.5體積份無水乙醇,將處理好的離心管-20℃冰箱中放置8~12h或在-80℃冰箱中放置至少1h;
取出冰箱中的樣品在4℃溫度下離心20min,棄去上清液,加入1體積份70%的酒精,離心5mim漂洗沉淀,棄去上清液,通風櫥充分晾干;加入0.02~0.05體積份0.1%DEPC水,冰浴或37℃水浴使沉淀溶解,然后在4℃溫度下離心5min,轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中,即為RNA樣品液,在-80℃溫度下保存;
所述的氯仿-異戊醇混合液中氯仿與異戊醇的體積比為24:1;所述的苯酚-氯仿-異戊醇混合液中苯酚、氯仿、異戊醇的體積比為25:24:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用常規(guī)試劑提取RNA的方法,其特征在于:70%的酒精的配制方法為:向0.1%DEPC水浸泡過的容器內(nèi)加入30mL無水乙醇和70mL DEPC水,充分混勻。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用常規(guī)試劑提取RNA的方法,其特征在于:步驟(3)和步驟(4)所述的離心管都在使用前預先在冰上或液氮中預冷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用常規(guī)試劑提取RNA的方法,其特征在于:步驟(4)中離心的速度為14000rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用常規(guī)試劑提取RNA的方法,其特征在于:步驟(4)所述的DNA酶處理液是3體積份10×DNase buffer、1體積份DNase-RNase-free和26體積份0.1%DEPC水的混合液。