本發(fā)明涉及植物組織中RNA的提取技術(shù)，具體是一種利用常規(guī)試劑提取RNA的方法。

背景技術(shù)：

RNA是一種可以作為信使、酶和結(jié)構(gòu)組分的多功能分子。RNA與DNA、蛋白質(zhì)，甚至RNA本身都能發(fā)生相互作用，在生命活動(dòng)的各個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要功能。隨著大量非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)功能多樣性的揭示，一個(gè)嶄新的“RNA世界”已經(jīng)呈現(xiàn)在人們眼前。人們認(rèn)識(shí)到RNA的研究在揭示生命的本質(zhì)和疾病防治方面都有著不可或缺的意義。RNA以信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)的形式存在。高質(zhì)量RNA提取是進(jìn)行Northern blotting、體外翻譯和建立cDNA文庫(kù)等分子生物學(xué)研究的前提。

早期高質(zhì)量RNA的提取有很大難度，因?yàn)樘崛∵^(guò)程較繁復(fù)，RNA極易被RNA酶水解。慶幸的是，隨著隨后提出的異硫氰酸胍一步法提取RNA以來(lái)，該狀況有了很大的改善，異硫氰酸胍一步法提取RNA的核心是采用RNA酶的抑制劑(異硫氰酸胍和巰基乙醇)抑制RNA酶的活性。在pH為5.3的酸性環(huán)境中，DNA和RNA分別主要分配在有機(jī)相和水相中，蛋白則經(jīng)有機(jī)溶劑變性而除去，因此，含RNA、DNA和蛋白的水溶液經(jīng)有機(jī)溶劑變性和分相一步處理，DNA主要游離進(jìn)入有機(jī)相，而蛋白則變性。水相剩下有RNA、RNA酶的抑制劑、未變性的蛋白和少量DNA。水相再經(jīng)重復(fù)的變性和分相處理，就只剩下RNA和RNA酶的抑制劑，經(jīng)醇沉淀可獲得高質(zhì)量的RNA。

目前提取RNA的方法都以破壞或裂解細(xì)胞、釋放RNA進(jìn)入溶液以防止RNA被內(nèi)源RNA酶降解，裂解將RNA、DNA和蛋白質(zhì)一道釋放出來(lái)，然后再?gòu)闹蟹蛛xRNA。分離RNA的方法有許多種，然而這些方法存在許多弊端：首先，目前的RNA提取步驟很多，操作麻煩，而且許多方法要求RNA提取當(dāng)天必須完成，如果RNA提取的樣品數(shù)過(guò)大，如果要求當(dāng)天完成，則工作量較大，很難保證提取的RNA的質(zhì)量；其次，目前的方法提取RNA產(chǎn)量較低，如果進(jìn)行RNA純化試驗(yàn)后，RNA產(chǎn)量更少，很難保證后期基因分離、表達(dá)和建庫(kù)中對(duì)于RNA量的需求；再者，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，許多生物公司開(kāi)發(fā)出RNA提取試劑盒，雖然提取RNA質(zhì)量高、速度快，然而RNA產(chǎn)量仍然較低，并且試劑盒價(jià)格昂貴，如果植物樣品數(shù)較多時(shí)，試劑花費(fèi)驚人，很難大批量的應(yīng)用。因此，必須尋找一種低成本的RNA提取方法，既可以保證RNA提取的質(zhì)量，又可以增加RNA提取的產(chǎn)量，還能盡量減少RNA提取每天工作量，適應(yīng)大批量RNA樣品的提取。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用常規(guī)試劑提取RNA的方法，該方法利用常規(guī)試劑對(duì)植物組織中的RNA進(jìn)行提取，提取率高，RNA不易污染降解，而且試劑簡(jiǎn)單易得，成本較低，提取步驟分階段性，過(guò)程靈活機(jī)動(dòng)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種利用常規(guī)試劑提取RNA的方法，包括以下步驟：

(1)試劑配制：

0.1％DEPC水的配制：將1mL DEPC原液加入到999mL雙蒸水(DD水)中，渦旋混合8～12h后，滅菌備用；

1M Tris/HCl溶液的配制：取Tris(三羥甲基氨基甲烷，分子量為121.14)溶于0.1％DEPC水(用焦炭酸二乙酯DEPC處理過(guò)并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水，不含核糖核酸酶RNase、脫氧核糖核酸酶Dnase和蛋白酶Proteinase)中，利用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到8.0，用0.1％DEPC水定容，高溫高壓滅菌備用；

4M LiCl溶液的配制：取LiCl(分子量為42.39)溶于0.1％DEPC水中，用0.1％DEPC水定容，高溫高壓滅菌備用；

10％SDS溶液的配制：取SDS(十二烷基硫酸鈉，分子量為288.38)溶于0.1％DEPC水中，用0.1％DEPC水定容，高溫高壓滅菌備用；

0.5M Na₂EDTA溶液的配制：取Na₂EDTA(乙二胺四乙酸二鈉，分子量為372.24)溶于0.1％DEPC水中，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，用0.1％DEPC水定容，高溫高壓滅菌備用；

3M醋酸鈉溶液的配制：取醋酸鈉溶于0.1％DEPC水中，冰醋酸調(diào)節(jié)PH到5.2，用0.1％DEPC水定容，高溫高壓滅菌備用；

(2)混合試劑配制：

取1M Tris/HCl溶液、4M LiCl溶液、10％SDS溶液和0.5M Na₂EDTA溶液加入容量瓶中，鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，并用0.1％DEPC水定容，配制成混合試劑，滅菌備用，所述的混合溶液中Tris的濃度為0.1M，LiCl的濃度為0.4M，SDS的濃度為1％，Na₂EDTA的濃度為10mM；

(3)待提取物準(zhǔn)備：

取待提取的鮮嫩組織樣品置于裝有液氮的冷研缽中，液氮保護(hù)下快速將組織樣品研磨成組織粉末；將研磨好的組織粉末迅速轉(zhuǎn)移至提前預(yù)冷的離心管中，-80℃貯藏備用；

(4)RNA提?。?/p>

將步驟(3)貯藏的裝有組織粉末的離心管轉(zhuǎn)移到液氮中；將步驟(2)配制的混合試劑和PH<7的水飽和酚按照1:1的比例混合為RNA提取液，在80℃水浴中預(yù)熱；吸取1體積份RNA提取液迅速加入到裝有組織粉末的離心管中，充分震蕩至組織粉末充分溶解，繼續(xù)渦旋震蕩30秒后，加入0.5體積份氯仿-異戊醇混合液，繼續(xù)渦旋震蕩30秒；然后在4℃溫度下離心5min，上層水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，加入同等體積的氯仿-異戊醇混合液，繼續(xù)渦旋震蕩30秒，再在4℃溫度下離心5min，上層水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，加入同等體積濃度為4M的LiCl溶液，充分上下顛倒混勻后在4℃溫度下溫育8～12h；

取出溫育的樣品，在4℃溫度下離心20min，棄去上清液，加入1mL 70％的酒精，離心5mim漂洗沉淀，棄去上清液，在通風(fēng)櫥中晾干；加入0.15體積份DNA酶處理液，冰浴15～30min使沉淀溶解，然后37℃水浴30min，加入0.15體積份0.1％DEPC水，再加入等體積PH<5.0的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，渦旋混勻，離心5min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等體積氯仿-異戊醇混合液，渦旋混勻，離心5min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，再加入0.1體積份PH為5.2的3M醋酸鈉溶液和2.5體積份無(wú)水乙醇，將處理好的離心管-20℃冰箱中放置8～12h或在-80℃冰箱中放置至少1h；

取出冰箱中的樣品在4℃溫度下離心20min，棄去上清液，加入1體積份70％的酒精，離心5mim漂洗沉淀，棄去上清液，通風(fēng)櫥充分晾干；加入0.02～0.05體積份DEPC水，冰浴或37℃水浴使沉淀溶解，然后在4℃溫度下離心5min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中，即為RNA樣品液，在-80℃溫度下保存；

所述的氯仿-異戊醇混合液中氯仿與異戊醇的體積比為24:1；所述的苯酚-氯仿-異戊醇混合液中苯酚、氯仿、異戊醇的體積比為25:24:1。

70％的酒精的配制方法為：向DEPC水浸泡過(guò)的容器內(nèi)加入30mL無(wú)水乙醇和70mL DEPC水，充分混勻。

步驟(3)和步驟(4)所述的離心管都在使用前預(yù)先在冰上或液氮中預(yù)冷。

步驟(4)中離心的速度為14000rpm。

步驟(4)所述的DNA酶處理液是3體積份10×DNase buffer、1體積份DNase-RNase-free和26體積份0.1％DEPC水的混合液。

為簡(jiǎn)單說(shuō)明問(wèn)題起見(jiàn)，以下對(duì)本發(fā)明所述的利用常規(guī)試劑提取RNA的方法均簡(jiǎn)稱(chēng)為本方法。

本方法在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了RNA提取的步驟，具有如下優(yōu)點(diǎn)：本方法提取步驟簡(jiǎn)易，操作程序簡(jiǎn)單易懂，科研人員很容易掌握、實(shí)施RNA的提取工作；本方法所用的試劑全部為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑，購(gòu)買(mǎi)方便，價(jià)格相對(duì)低廉，RNA提取的成本較低，試劑配置簡(jiǎn)單易行，適合多樣品、對(duì)批次、大范圍工作人員提取RNA產(chǎn)品時(shí)使用；本方法是在常規(guī)沉淀法的基礎(chǔ)上，改良RNA提取步驟，而且采用分時(shí)間段分離RNA樣品，可以輕松解決實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于RNA樣品數(shù)目過(guò)大，工作量繁重，一天之內(nèi)難以結(jié)束RNA提取任務(wù)的難題，且此方法RNA提取質(zhì)量好，RNA產(chǎn)出率大，很容易保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA質(zhì)量和產(chǎn)量的要求。

附圖說(shuō)明

圖1是提取的RNA樣品的瓊脂糖凝膠(1.5％)電泳檢測(cè)圖片。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范以下通過(guò)下面給出的實(shí)施例可以進(jìn)一步清楚地了解本發(fā)明，但它們不是對(duì)本發(fā)明的限定。

利用常規(guī)試劑提取RNA的方法，包括以下步驟：

(1)試劑配制：

0.1％DEPC水的配制：將1mL DEPC原液加入到999mL雙蒸水中，渦旋混合過(guò)夜(12h)后，121℃連續(xù)滅菌三次，每次15min，備用；

1M Tris/HCl溶液的配制：稱(chēng)取12.141g Tris溶于0.1％DEPC水中，利用鹽酸調(diào)節(jié)PH值到8.0，用0.1％DEPC水定容至100mL，高溫高壓滅菌備用；

4M LiCl溶液的配制：稱(chēng)取16.956g LiCl溶于0.1％DEPC水中，用0.1％DEPC水定容至100mL，高溫高壓滅菌備用；

10％SDS溶液的配制：稱(chēng)取10g SDS溶于0.1％DEPC水中，用0.1％DEPC水定容至100mL，高溫高壓滅菌備用；

0.5M Na₂EDTA溶液的配制：稱(chēng)取18.612g Na₂EDTA溶于0.1％DEPC水中，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，用0.1％DEPC水定容至100mL，高溫高壓滅菌備用；

3M醋酸鈉溶液的配制：稱(chēng)取40.824g醋酸鈉溶于0.1％DEPC水中，冰醋酸調(diào)節(jié)PH到5.2，用0.1％DEPC水定容至100mL，高溫高壓滅菌備用；

(2)混合試劑配制：

準(zhǔn)確量取25mL濃度為1M的Tris/HCl溶液、6.25mL濃度為4M的LiCl溶液、25mL濃度為10％的SDS溶液和5mL濃度為0.5M的Na₂EDTA溶液加入到容量瓶中，鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，并用0.1％DEPC水定容至250mL，配制成混合試劑，滅菌備用，所述的混合溶液中Tris的濃度為0.1M，LiCl的濃度為0.4M，SDS的濃度為1％，Na₂EDTA的濃度為10mM；

(3)待提取物準(zhǔn)備：

取待提取的鮮嫩植物組織樣品置于裝有液氮的冷研缽中，液氮保護(hù)下快速將植物組織樣品研磨成組織粉末；將研磨好的組織粉末迅速轉(zhuǎn)移至2mL提前預(yù)冷的離心管中(大約1/3～1/2容量即可)，-80℃貯藏備用；

(4)RNA提?。?/p>

第一天：將步驟(3)貯藏的裝有組織粉末的離心管轉(zhuǎn)移到液氮中；將步驟(2)配制的混合試劑和PH<7的水飽和酚按照1:1的比例混合為RNA提取液，在80℃水浴中預(yù)熱；吸取1mL RNA提取液迅速加入到裝有組織粉末的離心管中，立刻充分渦旋震蕩至組織粉末充分溶解，繼續(xù)渦旋震蕩30秒后，加入0.5mL氯仿-異戊醇(體積比為24:1)混合液，繼續(xù)渦旋震蕩30秒；然后在4℃溫度下，以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的2mL離心管中，加入同等體積(1mL)的氯仿-異戊醇(體積比為24:1)混合液，繼續(xù)渦旋震蕩30秒，再在4℃溫度下，以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，上層水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的2mL離心管中，加入同等體積步驟(1)配制的濃度為4M的LiCl溶液，充分上下顛倒混勻后在4℃溫度下溫育過(guò)夜(12h)；

第二天：取出溫育過(guò)夜的樣品，在4℃溫度下，以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心20min，棄去上清液，加入1mL 70％的酒精(配制方法為：向0.1％DEPC水浸泡過(guò)的容器內(nèi)加入30mL新開(kāi)封的無(wú)水乙醇和70mL DEPC水，充分混勻)，離心5mim漂洗沉淀，棄去上清液，在通風(fēng)櫥中晾干；加入150μL DNA酶處理液(15μL 10×DNase buffer、5μL DNase-RNase-free和130μL 0.1％DEPC水的混合液)，冰浴15～30min使沉淀溶解，然后37℃水浴30min，加入150μL 0.1％DEPC水，再加入等體積PH<5.0的苯酚-氯仿-異戊醇(體積比為25:24:1)混合液，渦旋混勻，高速離心5min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，加入等體積氯仿-異戊醇(體積比為24:1)混合液，渦旋混勻，高速離心5min；將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的1.5mL離心管中，再加入0.1mL PH為5.2的3M醋酸鈉溶液和2.5mL無(wú)水乙醇，將處理好的離心管-20℃冰箱中放置過(guò)夜(12h，如果想當(dāng)天完成RNA的提取，也可在-80℃溫度下至少放置1h)；

第三天：取出放置的樣品在4℃溫度下，以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心20min，棄去上清液，加入1mL 70％的酒精，離心5mim漂洗沉淀，棄去上清液，通風(fēng)櫥充分晾干；加入20～50μL 0.1％DEPC水，冰浴1h至沉淀溶解(如果沉淀沒(méi)有充分溶解，可以在37℃水浴中放置5min幫助溶解)，然后在4℃溫度下，以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，轉(zhuǎn)移上清液到新的1.5mL離心管中，即為RNA樣品液，在-80℃溫度下保存。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所用器皿及工具均須在使用前在0.1％DEPC水中浸泡2天，離心管還須在使用前預(yù)先在冰上或液氮中預(yù)冷，離心機(jī)提前4℃預(yù)冷。所有步驟都要在冰上操作，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

吸取1μg RNA樣品，利用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量，結(jié)果如圖1所示，從圖1可以看出，RNA樣品兩條帶型單一，沒(méi)有拖尾彌散，說(shuō)明RNA提取質(zhì)量較好，然后利用Nanodrop測(cè)定RNA樣品在A260/A280nm波長(zhǎng)下的比值，判斷是否可以進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)：如果比值為1.8～2.0，表明RNA樣品液中雜質(zhì)較少，基本沒(méi)有發(fā)生降解，RNA樣品純度較好，可以進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)；如果比值小于1.8，說(shuō)明溶液中蛋白或者其它有機(jī)物的污染比較明顯；如果比值大于2.2，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。經(jīng)測(cè)定，本實(shí)施例提取的RNA樣品在A260/A280nm波長(zhǎng)下的比值為2.1，進(jìn)一步證明本實(shí)施例提取的RNA樣品的純度較好，滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。