技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體及其篩選方法。

背景技術(shù)：

指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)是一種能獲取與靶物質(zhì)特異結(jié)合的寡核苷酸的篩選技術(shù)，篩選得到的單鏈DNA或RNA分子稱為核酸適配體。核苷酸不僅有儲存和傳遞遺傳信息的作用，還可以通過自身特有的空間結(jié)構(gòu)與其它分子相互作用。在適宜條件下，單鏈DNA或RNA分子會發(fā)生適應(yīng)性折疊，形成發(fā)夾、凸環(huán)、四分體等結(jié)構(gòu)，從而與靶物質(zhì)緊密結(jié)合。因此，近年來，具有高特異性、高親和力、高穩(wěn)定性、低免疫原性、低分子量、易于合成等特點的核酸適配體，得到了廣泛的應(yīng)用。核酸適配體篩選方法也多種多樣，如毛細(xì)管法、親和層析、磁珠分離、微孔板法等。毛細(xì)管法是利用毛細(xì)管電泳作為分離方法的一種技術(shù)，與靶物質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列和未與靶物質(zhì)結(jié)合的序列在毛細(xì)管中的遷移率不同，從而使結(jié)合序列與未結(jié)合序列分離；該方法具有快速、微量等特點，但需要特殊的儀器(毛細(xì)管電泳儀)，且比較適于篩選分子量大的分子。親和層析分離是將靶分子通過共價鍵或非共價鍵偶聯(lián)至玻璃株或樹脂上，與文庫作用后，結(jié)合序列會留在樹脂上而不結(jié)合序列通過層析柱流走，從而達(dá)到分離的目的；該方法要求靶分子必須要有能與玻璃珠或樹脂偶聯(lián)的親和標(biāo)記或功能基團(tuán)。微孔板法是將靶分子通過物理吸附作用結(jié)合于微孔板上，加入適配體文庫孵育后棄去未結(jié)合的適配體，洗脫與靶分子結(jié)合的適配體即可；該方法適用靶分子廣，對靶分子性狀要求不嚴(yán)格，凡是能特吸附至微孔板的物質(zhì)均可進(jìn)行篩選。然而，對于不同的靶物質(zhì)應(yīng)采用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，以便快速、準(zhǔn)確地篩選到親和力高、特異性強(qiáng)的適配體。為了得到牛副流感病毒3型HN蛋白高結(jié)合力和特異性的核酸適配體，我們采用了較為傳統(tǒng)的微孔板法，進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體及其篩選方法，對牛副流感病毒3型核酸適配體篩選方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，該篩選方法具有適用靶分子廣，對靶分子要求不嚴(yán)格，操作簡便，節(jié)約成本等優(yōu)點。同時運用該方法篩選獲得的HN蛋白核酸適配體，為后續(xù)檢測 BPIV3抗原或抗體的酶聯(lián)適配體法的建立奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，包括如下步驟：

步驟一：設(shè)計和合成初始寡核苷酸文庫及用于PCR擴(kuò)增的上游引物和下游引物；

步驟二，包被：吸取HN蛋白溶液包被于微孔板中；

步驟三，洗板：甩去包被液，洗滌微孔板，甩干；

步驟四，封閉：向微孔中加入含BSA的HEPES液，孵育；

步驟五，加核酸適配體文庫：甩去封閉液，用HEPEST洗滌，甩干，將溶解的初始寡核苷酸文庫(使用時溶于400μL HEPES緩沖液，95℃孵育10min，迅速冰浴10min后備用)加入到封閉好的微孔中，孵育；

步驟六，洗板：甩去寡核苷酸文庫，洗滌微孔板，拍干孔中殘留的洗滌液；

步驟七，洗脫：向微孔中加入核酸洗脫液，孵育；

步驟八，提?。何鱿疵撘?，提取洗脫液中的核酸適配體；

步驟九，PCR：對步驟八提取的核酸適配體分別進(jìn)行一輪對稱PCR和一輪非對稱PCR；

步驟十，膠回收：回收PCR產(chǎn)物；

步驟十一，反篩：從第5輪起開始進(jìn)行反篩，封閉后，將非對稱PCR回收的核酸適配體加入反篩孔，孵育后將上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育。

更進(jìn)一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟一種所述初始寡核苷酸文庫的序列如SEQ ID NO.1所示，上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示.

更進(jìn)一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟二中包被具體為：吸取100μL HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜；步驟三中的洗板具體為：甩去包被液，用300μL HEPEST洗滌微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST為含0.05％Tween 20的HEPES。

更進(jìn)一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟四中所述封閉具體為：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。

更進(jìn)一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中 步驟五中所述加核酸適配體文庫具體為：甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干，將100uL溶解的初始寡核苷酸文庫加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h。

更進(jìn)一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟六中所述洗板具體為：甩去寡核苷酸文庫，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液；步驟七中所述洗脫具體為：向微孔中加入100μL核酸洗脫液，80℃孵育10min。

更進(jìn)一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟八中所述提取具體為：吸出洗脫液，采取酚抽提法，用25:24:1的酚：氯仿：異戊醇提取洗脫液中的核酸適配體。

更進(jìn)一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟九中所述對稱PCR具體為：2×Mix 25μL，WZ-03 1μL，WZ-04 1μL，適配體3μL，去離子水20μL，反應(yīng)條件為95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，15個循環(huán)，72℃、5min；所述非對稱PCR具體為2×Mix 25μL，WZ-03 1μL，WZ-04 0.02μL，適配體5μL，去離子水19μL，反應(yīng)條件為95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，28個循環(huán)，72℃、5min。

更進(jìn)一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟十中所述膠回收具體為：用Bioteke短片段DNA膠回收試劑盒按照說明書要求回收PCR產(chǎn)物。

更進(jìn)一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟十一中所述反篩具體為：從第5輪起開始進(jìn)行反篩，即微孔板包被HN蛋白的同時包被無HN蛋白的包被液反篩孔，同樣條件封閉后，將非對稱PCR回收的核酸適配體加入反篩孔，37℃孵育30min后將上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育1h

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明對傳統(tǒng)的微孔板法進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，得到了與牛副流感病毒3型HN蛋白具有高結(jié)合力和特異性的核酸適配體。其中微孔板分離利用了ELISA酶標(biāo)板能吸附靶分子的功能從而達(dá)到分離的目的。將靶分子通過物理吸附作用結(jié)合于微孔板上，與適配體文庫孵育后棄去未結(jié)合的適配體，加入變性溶液從微孔板內(nèi)洗脫下與靶分子結(jié)合的核酸適配體。該方法適用靶分子廣，對靶分子性狀要求不嚴(yán)格，凡是能特吸附到微孔板的物質(zhì)均可進(jìn)行篩選。此外，該方法不需要使用特殊儀器設(shè)備和材料，操作簡便，節(jié)約成本。

附圖說明

圖1為第1輪篩選的對稱PCR與非對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中，1：對稱PCR樣品；2：非對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖2為第2輪篩選的對稱PCR與非對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中，1：對稱PCR樣品；2：非對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖3為第9輪篩選的對稱PCR與非對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中1：對稱PCR樣品；2：非對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖4為第10輪篩選的對稱PCR與非對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中，1：對稱PCR樣品；2：非對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖5為第11輪篩選的對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中，1：對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖6為不同輪次適配體庫的結(jié)合率測定結(jié)果；

圖7為轉(zhuǎn)化子菌液PCR鑒定結(jié)果，其中，M：低分子量marker；N：陰性對照；其余孔為樣品；

圖8為Sigma Plot10.0繪制不同濃度適配體的擬合曲線；

圖9為適配體W-32二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果；

圖10為適配體W-33二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果；

圖11為適配體W-34二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果；

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。

實施例1 篩選

HN蛋白溶液，由本實驗室原核表達(dá)和保存；

初始寡核苷酸文庫序列：5’-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC C-(N)₄₀-C TGC AGG TCG ACG CAT GCG CCG，由上海生工生物工程股份公司合成。合成方式：單管合成20OD，摩爾量為24nmol。使用時溶于400μL HEPES緩沖液，95℃ 孵育10min。迅速冰浴10min后備用。

PCR引物序列：上游引物WZ03:5’-BIO-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC；下游引物WZ04：CGGCGCATGCGTCGACCTGCAG。

具體篩選方法如下：

步驟一，包被：吸取100μL HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜。

步驟二，洗板：甩去包被液，用300μL HEPEST(含0.05％Tween 20的HEPES)洗滌微孔板三次，甩干。

步驟三，封閉：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。

步驟四，加核酸適配體文庫：甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干。將100uL溶解的初始寡核苷酸文庫加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h。

步驟五，洗板：甩去寡核苷酸文庫，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液。

步驟六，洗脫：向微孔中加入100μL核酸洗脫液，80℃孵育10min。

步驟七，提?。何鱿疵撘海扇》映樘岱?，用25:24:1的酚：氯仿：異戊醇提取洗脫液中的核酸適配體。

步驟八，PCR：對上述步驟提取的核酸適配體分別進(jìn)行一輪對稱PCR和一輪非對稱PCR；

對稱PCR具體為：2×Mix 25μL，WZ-03 1μL，WZ-04 1μL，適配體3μL，去離子水20μL，反應(yīng)條件為95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，15個循環(huán)，72℃、5min；

非對稱PCR具體為2×Mix 25μL，WZ-03 1μL，WZ-04 0.02μL，適配體5μL，去離子水19μL，反應(yīng)條件為95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，28個循環(huán)，72℃、5min。

步驟九，膠回收：用Bioteke短片段DNA膠回收試劑盒按照說明書要求回收PCR產(chǎn)物。

步驟十，反篩：從第5輪起開始進(jìn)行反篩，即微孔板包被HN蛋白的同時包被無HN蛋白的包被液反篩孔，同樣條件封閉后，將非對稱PCR回收的核酸適配體加入反篩孔，37℃孵育30min后將上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育1h。反篩目的是避免篩選到與微孔板和BSA非特異結(jié)合的核酸適配體。

在每輪篩選循環(huán)中，自微孔板洗脫液中獲得的適配體溶液，用體積比為25：24：1的酚：氯仿：異戊醇抽提，用Bioteke短片段DNA回收試劑盒回收適配體候選物，然后以回收產(chǎn)物為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，之后再進(jìn)行一輪非對稱PCR擴(kuò)增，獲得目的條帶大小約為84bp的單鏈核苷酸分子，用于下一輪篩選。篩選進(jìn)行到第11輪，將對稱PCR產(chǎn)物連接到T載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、克隆和測序。第1輪篩選電泳結(jié)果如圖1所示，第2輪篩選電泳結(jié)果如圖2所示，第9輪篩選電泳結(jié)果如圖3所示，第10輪篩選電泳結(jié)果如圖4所示，第11輪篩選電泳結(jié)果如圖5所示。

實施例2 核酸適配體庫結(jié)合率監(jiān)測

篩選進(jìn)行11輪后，使用生物素標(biāo)記的WZ03引物對第5輪、第9輪、第10輪、第11輪核酸適配體庫進(jìn)行非對稱PCR擴(kuò)增，膠回收非對稱PCR產(chǎn)物得到生物素標(biāo)記的核酸適配體(Bio-aptamer)，分別用HEPEST溶液調(diào)整各輪次Bio-aptamer濃度至200nM。采用間接酶聯(lián)適配體法(i-ELAA)測定其與HN蛋白的結(jié)合率。

間接酶聯(lián)適配體法具體步驟如下：

步驟一，包被：吸取100μL HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜。

步驟二，洗板：甩去包被液，用300μL HEPEST(含0.05％Tween 20的HEPES)洗滌微孔板三次，甩干。

步驟三，封閉：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。

步驟四，加核酸適配體：甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干。將100uL各輪次Bio-aptamer加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h。

步驟五，加二抗：甩去Bio-aptamer，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，向孔中加入100μL 1:8000稀釋的HRP-SA，37℃孵育1h。

步驟六，顯色：甩去二抗，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，將顯色液A、顯色液B等體積混合，吸取100μL顯色液加入到微孔中，37℃顯色10min。

步驟七，終止：每孔加入終止液2M H₂SO₄ 50μL終止顯色。

步驟八，讀數(shù)：使用自動酶標(biāo)檢測儀讀取每孔在450nm波長處生物吸光度 值(OD)。

經(jīng)11輪篩選后，對適配體初始文庫、第5輪、第9輪、第10輪、第11輪獲得的適配體與HN蛋白的結(jié)合力進(jìn)行了評價。采用間接ELAA方法，即使用相同濃度的生物素標(biāo)記適配體庫與相同濃度的蛋白孵育后測定吸光度值。OD₄₅₀值越高，說明適配體與HN蛋白的結(jié)合率越高，結(jié)合力越強(qiáng)，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，隨著篩選次數(shù)的增加，適配體與HN蛋白結(jié)合量增多，OD₄₅₀值越來越高。從第11輪開始，OD₄₅₀值不再增加，表明與HN蛋白特異性結(jié)合的適配體單一性達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

實施例3 測序

將最后一輪擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物連接T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性樣品送往北京擎科新業(yè)生物有限公司進(jìn)行序列測定。

1、連接轉(zhuǎn)化

將第11輪回收的核酸適配體進(jìn)行一輪對稱PCR，得到dsDNA，連接pEASY-T1載體。嚴(yán)格按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃溫箱過夜培養(yǎng)。可見白色和藍(lán)色菌落，白色菌落即為轉(zhuǎn)化成功的感受態(tài)細(xì)胞。

2、轉(zhuǎn)化子的增菌培養(yǎng)、鑒定及測序

增殖：無菌挑取白色菌落于1mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)18h。

PCR鑒定及質(zhì)粒提?。河胮EASY-T1載體通用引物對增殖的菌落進(jìn)行PCR鑒定。用艾德萊的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

測序：將提取的陽性質(zhì)粒送北京擎科新業(yè)生物有限公司測序。

將第11輪篩選的微孔板洗脫液為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板挑選轉(zhuǎn)化子，共挑取轉(zhuǎn)化子106個，增殖后經(jīng)PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子104個，部分PCR結(jié)果如圖7所示。將目的條帶回收后送樣測序，共測序成功104條適配體，其中W-32、W-33和W-34分別重復(fù)出現(xiàn)7、11和9次(如表1)，提示W(wǎng)-32、W-33和W-34被最大程度地富集，因此其特異性結(jié)合HN蛋白的可能性最大。

表1 核酸適配體測序結(jié)果

實施例4 間接酶聯(lián)適配體法測定核酸適配體的KD值

選擇篩選重復(fù)次數(shù)較多的三條適配體W-32、W-33和W-34，化學(xué)合成5’端生物素標(biāo)記的單一適配體，采用間接酶聯(lián)適配體法測定各適配體的KD值。測定程序如下：

步驟一，包被：吸取100μL HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜。

步驟二，洗板：甩去包被液，用300μL HEPEST(含0.05％Tween 20的HEPES)洗滌微孔板三次，甩干。

步驟三，封閉：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。

步驟四，加適配體：甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干。分別吸取100uL適配體W-32、W-33和W-34加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h。

步驟五，加二抗：甩去適配體，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，分別向孔中加入100μL 1:8000稀釋的HRP-SA，37℃孵育1h。

步驟六，顯色：甩去二抗，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，將顯色液A、顯色液B等體積混合，吸取100μL顯色液加入到微孔中，37℃顯色10min。

步驟七，終止：每孔加入50μL終止液(2M H₂SO₄)終止顯色。

步驟八，讀數(shù)：用自動酶標(biāo)檢測儀讀取每孔在450nm波長處的吸光度值(OD)。

步驟九，計算：根據(jù)公式Y(jié)＝B_maxX/(K_d+X)來計算每條適配體的KD值。其中，Y代表OD₄₅₀平均值，Bmax代表最大OD₄₅₀值，X代表適配體濃度。

選擇上述測序結(jié)果中重復(fù)出現(xiàn)頻次較高的核酸適配體W-32、W-33和W-34，根據(jù)其序列分別合成生物素標(biāo)記的單鏈核苷酸，用I-ELAA法測定3條適配體與HN蛋白的結(jié)合力。測定結(jié)果分別見表2、表3和表4，結(jié)果顯示3條適配體均能與HN蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合。

表2 I-ELAA法測適配體W-32結(jié)合力OD₄₅₀值

表3 I-ELAA法測適配體W-33結(jié)合力OD₄₅₀值

表4 I-ELAA法測適配體W-34結(jié)合力OD₄₅₀值

使用軟件Sigma Plot 10.0分析上述數(shù)據(jù)如圖8所示，根據(jù)公式Y(jié)＝Bmax X/(Kd+X)計算適配體W-32、W-33和W-34的KD值分別為56.57±2.7nM、24.64±2.84nM和31.3±3.32nM，結(jié)果表明3條適配體的KD值均達(dá)到納摩爾級別，其中適配體W-33結(jié)合力略高于另外兩條適配體。

實施例5 適配體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用在線核酸結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件MFOLD分析篩選出的三條核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)，軟件網(wǎng)址為：http://mfold.rit.albany.edu。

通過在線網(wǎng)站，預(yù)測適配體W-32、W-33和W-34的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果分別見圖9、圖10、圖11。從圖9至圖11可見，3條核酸適配體均具有穩(wěn)定的頸環(huán)狀或發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，在一定條件下能與靶標(biāo)分子HN蛋白形成穩(wěn)定的結(jié)合。

因此，本發(fā)明通過微孔板法不同輪次篩選獲得多條HN蛋白的核酸適配體候選物。選擇測序結(jié)果出現(xiàn)頻次較高的適配體，用I-ELAA法測定了其與HN蛋白的 結(jié)合力，三條適配體W-32、W-33和W-34的KD值分別為56.57±2.7nM、24.64±2.84nM和31.3±3.32nM，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示核酸適配體均具有穩(wěn)定的頸環(huán)狀或發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，說明本次篩選的三條適配體均能與HN蛋白特異、穩(wěn)定的結(jié)合，可用于后續(xù)檢測BPIV3抗原或抗體的酶聯(lián)適配體法的建立。

本發(fā)明中涉及到的序列如下表5所示：

表5 序列表

本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。