本發(fā)明涉及一種PCR模板的制備方法，具體涉及一種煙草葉組織PCR模板的制備方法，尤其是應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因煙草葉片組織。
背景技術(shù)：
：：煙草(Nicotianatabacum)目前是國內(nèi)一種重要的經(jīng)濟作物。培育優(yōu)質(zhì)、低害、抗病抗逆、適產(chǎn)的煙草品種是目前煙草育種的主要目標。隨著分子生物學的快速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐漸成熟，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為煙草育種的重要方法。近年來，隨著Crispr-Cas9技術(shù)的發(fā)展，在煙草基因組中定點突變一個或多個基因甚至是整個基因家族成為可能。該技術(shù)能夠?qū)δ繕诵誀钸M行精確改良，通過篩選得到穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)基因株系，不僅能夠縮短作物的育種周期，還能夠解決傳統(tǒng)育種方法不易解決的問題，如有害性狀與優(yōu)良性狀的緊密連鎖不易打破分離。這給煙草的轉(zhuǎn)基因育種帶來了新的機遇。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，生物技術(shù)的研究領(lǐng)域逐漸拓展到生物科學的各個方面，核酸水平的研究是分子生物學研究的重要內(nèi)容，PCR技術(shù)作為研究核酸的主要工具，在分子生物學領(lǐng)域扮演著越來越重要的角色。在植物研究領(lǐng)域諸如突變體的鑒定，轉(zhuǎn)基因植株的鑒定，基因擴增等均需要利用到PCR技術(shù)，PCR擴增技術(shù)需要DNA作為模板。針對于煙草等作物的檢驗，為了降低假陽性的存在，在抗性培養(yǎng)基上長出的轉(zhuǎn)基因苗還需進行進一步的檢驗。目前，多采用簡便快捷，靈敏度高的PCR方法進行這一檢測。而要進行PCR檢測則首先需對被檢測樣品進行DNA提取。目前，在眾多植物種類中應(yīng)用最廣泛的提取DNA的方法是采用商業(yè)化的試劑盒或是基于CTAB/SDS裂解后的酚即氯仿抽提法或者是由此為基礎(chǔ)衍生而來的改良法。然而，這些方法都需要在液氮或是冷凍干燥條件下將樣品粉碎，緊接而來的是很多繁瑣的步驟進行DNA的純化。這些方法不僅用到很多有害試劑和昂貴的試劑儀器，并且用到的植物組織多，步驟繁瑣費時，因此當需要檢測的轉(zhuǎn)基因植株較多時，這些方法顯得不太適用。在植物領(lǐng)域也有一些快速提取DNA的方法報道。然而，所有這些建立在堿液裂解基礎(chǔ)上的快速提取方法模板在進行PCR之前都需要進行加熱/煮沸或者加入中和液(TE或者Tris-HCl)進行中和。這一些額外的步驟顯然會增加樣品之間的交叉污染，樣品多時也會耗費大量時間。技術(shù)實現(xiàn)要素：根據(jù)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種煙草葉組織PCR模板的制備方法，該方法使用儀器少，樣品消耗少，快速、簡便、成本低，沒有交叉污染，能夠在短時間內(nèi)處理大量樣品。本發(fā)明所述的一種煙草葉組織PCR模板的制備方法，其特征在于：以NaOH溶液為提取液，將提取液與植物葉片組織放入到離心管中，直接在磨樣機上磨樣，得到的上清液直接作為模板進行PCR反應(yīng)。其中優(yōu)選方案如下：所述的NaOH溶液的摩爾濃度為0.01mol/L～0.1mol/L，更優(yōu)選為0.01mol/L。所述的磨樣機的工作轉(zhuǎn)速頻率為20～25Hz，磨樣時間為1.5～3min，更優(yōu)選為工作轉(zhuǎn)速頻率23Hz，磨樣時間2min。綜上所述，本發(fā)明可以按照以下步驟進行：將直徑0.25mm的鋼珠和250μL摩爾濃度為0.01mol/L的NaOH溶液加入2mL的離心管中，再取8～12mm2植物葉片組織放入，然后在磨樣機上以23Hz頻率磨樣2分鐘，取1μL上清液即可直接作為模板進行PCR反應(yīng)。應(yīng)用本發(fā)明制備方法得到的模板進行PCR擴增程序：PCR擴增體系采用20μL反應(yīng)體系，包括2×PCRMix10μL，前引物和后引物各6pmol，DNA模板1μL，用ddH2O補齊體積。PCR擴增程序如下：94℃條件下預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，36個循環(huán)；最后72℃延伸10min。取6μLPCR產(chǎn)物在150V電壓，1.5％瓊脂糖凝膠中電泳15min檢測擴增情況。凝膠用EB進行染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。本發(fā)明所具有的優(yōu)點在于：(1)建立了一種快速高效的制備轉(zhuǎn)基因煙草樣品DNA的方法，此方法采用0.01mol/L的NaOH溶液為提取液，破碎轉(zhuǎn)基因煙草葉片組織后無需經(jīng)過加熱煮沸中和等步驟，上清液可直接用作PCR反應(yīng)的模板；(2)用此方法制備的DNA模板PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定、準確、重復(fù)性好，與傳統(tǒng)SDS提取法和試劑盒提取法獲得的DNA相比，PCR結(jié)果沒有明顯差異；(3)該方法還可以應(yīng)用于小麥、高粱、水稻、玉米等作物上，同樣取得了很好的實驗效果；(4)該方法使用儀器少，樣品消耗少，快速、簡便、成本低，沒有交叉污染，能夠在短時間內(nèi)處理大量樣品，因此能夠?qū)Υ罅康霓D(zhuǎn)基因煙草樣品進行DNA的快速提取和鑒定。附圖說明圖1為實施例1中采用不同濃度NaOH溶液制備DNA模板進行PCR擴增的電泳分析圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1：1mol/LNaOH溶液；2：0.5mol/LNaOH溶液；3：0.25mol/LNaOH溶液；4：0.1mol/LNaOH溶液；5：0.05mol/LNaOH溶液；6：0.01mol/LNaOH溶液；7：0.001mol/LNaOH溶液)；圖2為實施例3中采用不同品牌PCRMix進行PCR擴增的電泳分析圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1：全式金AS111PCRMix；2：ThermoScientificK1081PCRMix；3：擎科梓熙TSE004PCRMix；4：MDBioP002PCRMix；A：引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-S擴增結(jié)果；B：引物Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR擴增結(jié)果)；圖3為實施例4中采用不同DNA提取方法進行PCR擴增的電泳分析比較圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1：Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR擴增結(jié)果；2：Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR擴增結(jié)果；3：Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR擴增結(jié)果；4：Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR擴增結(jié)果；A：SDS方法提取DNA模板；B：實施例2方法提取DNA模板)；圖4為實施例5中通過Crispr-Cas9技術(shù)編輯的煙草木糖基轉(zhuǎn)移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的陽性植株進行PCR擴增的電泳分析圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1-2：非轉(zhuǎn)基因K326對照；3-6：Crispr-Cas9載體陽性但gDNA未編輯植株；7-8：Crispr-Cas9載體陽性且gDNA編輯植株，A：Crispr-Cas9技術(shù)編輯Ntab0067020基因植株；B：Crispr-Cas9技術(shù)編輯Ntab0104030基因植株)；圖5為實施例5中A1，A3，A7，A8植株的測序結(jié)果(圖中黑色陰影顯示的為Crispr-Cas9技術(shù)編輯的基因靶點序列)；圖6為實施例5中B1，B3，B7，B8植株的測序結(jié)果(圖中黑色陰影顯示的為Crispr-Cas9技術(shù)編輯的基因靶點序列)；圖7為實施例6中不同作物應(yīng)用不同DNA提取方法進行PCR擴增的電泳分析比較圖(圖中：M：Trans2KDNAMarker；1：小麥；2：高粱；3：煙草；4：棉花；5：水稻；6：玉米，A：試劑盒法提取DNA；B：實施例2所述的方法提取DNA)。具體實施方式以下結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明。以下實施例中所用到的引物說明：實施例1：針對NaOH提取液適宜濃度篩選試驗：如圖1所示，0.01mol/L到0.1mol/L之間的NaOH溶液制備的DNA模板均能擴增出條帶，說明NaOH溶液粗提物可以直接作為PCR反應(yīng)的模板。0.001mol/L的NaOH溶液提取的模板雖然也能擴增出條帶，但條帶亮度較弱，而高于0.25mol/L(包含0.25mol/L)的NaOH溶液制備的DNA模板則不能擴增出條帶。從擴增效果和節(jié)約試劑的角度最終選擇0.01mol/L的NaOH溶液作為提取液進行實驗。實施例2：一種煙草葉組織PCR模板的制備方法，將直徑0.25mm的鋼珠和250μL摩爾濃度為0.01mol/L的NaOH溶液加入2mL的離心管中，再取10mm2左右的植物葉片組織放入，然后在磨樣機上以23Hz頻率磨樣2分鐘，取1μL上清液即可直接作為模板進行PCR反應(yīng)。根據(jù)此方法，應(yīng)用于實施例3～6中。實施例3：采用不同品牌PCRMix擴增結(jié)果：如圖2所示，常用的4種不同品牌PCRMix對0.01MNaOH濃度制備的模板用引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-S和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR進行擴增，4種PCRMix均能擴增出明亮單一的條帶，擴增結(jié)果之間沒有明顯的差異。實施例4：不同DNA提取方法擴增結(jié)果比較：對用傳統(tǒng)SDS方法提取的DNA作為模板和實施例2所述方法提取的DNA模板進行PCR擴增的結(jié)果進行比較。如圖3所示，4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因特異引物Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR，Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR，Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在SDS法和實施例2所述方法提取的DNA模板上進行擴增均能擴增出條帶清晰，明亮的條帶。兩種方法制備的模板PCR擴增結(jié)果沒有顯著差異。實施例5：在鑒定煙草轉(zhuǎn)基因植株上的應(yīng)用：對實驗室已經(jīng)確認的兩個通過Crispr-Cas9技術(shù)編輯的煙草木糖基轉(zhuǎn)移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的陽性植株在編輯位點附近設(shè)計了兩個基因的特異引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR，采用實施例2所述的方法獲得模板進行PCR擴增、測序驗證。如圖4所示，引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在對照和轉(zhuǎn)基因植株上均能擴增出明亮單一的條帶。對PCR產(chǎn)物直接進行測序，測序結(jié)果如圖5、圖6所示，以A1，A3，A7，A8和B1，B3，B7，B8植株的測序結(jié)果為例：A3和B3植株為已知轉(zhuǎn)入Crispr-Cas9載體但未能在基因組上成功編輯的植株，基因特異引物擴增測序結(jié)果分別與對照A1和B1一致；而A7，A8和B7，B8是在基因組上成功編輯的植株，可以看到在這4株植株上擴增的片段在各自的靶位點上都進行了編輯，存在堿基的插入/缺失，與之前的鑒定結(jié)果一致。說明本方法提取的DNA模板可以用來對通過Crispr-Cas技術(shù)編輯的轉(zhuǎn)基因植株進行陽性苗的鑒定。實施例6：在其他作物上的應(yīng)用：如圖7所示，對小麥、高粱、煙草、棉花、水稻及玉米等作物的幼葉用試劑盒及實施例2所述方法制備的模板進行ACTIN基因的擴增。結(jié)果表明，通過試劑盒方法制備的模板能在5種作物上擴出條帶，而通過實施例2所述方法制備的模板在棉花中的擴增失敗，但在其他4種作物上均能夠擴增出條帶，且與試劑盒擴增的效果基本一致，在煙草和水稻中甚至能擴增出長達1.5kb的片段。綜和上述所有實施例所述，本方法可以適用于大量轉(zhuǎn)基因煙草陽性株的鑒定工作，節(jié)約時間成本。建立的DNA提取方法簡單快速，粗提上清液可以直接用來作為PCR反應(yīng)的模板，能夠有效的對煙草轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定。利用此方法進行DNA模板制備，一個工作人員在一個小時之內(nèi)就可以提取至少600個樣品，提高了工作效率。此方法與之前建立的很多一步法堿裂解DNA提取方法相比，最大的改進是上清液不經(jīng)加熱或中和就可以直接用來作為模板，這樣盡最大的可能節(jié)省了時間、降低了費用并且還能有效的避免不同樣品之間的交叉污染。另外，此方法只利用大約10mm2的植物材料就可以提取足夠200次PCR反應(yīng)的模板溶液，大大減少了對植物材料的浪費。因此，篩選可以在植株生長的早期進行，加速實驗進程。雖然傳統(tǒng)的SDS提取法和試劑盒提取的DNA量多質(zhì)優(yōu)，但是PCR技術(shù)對DNA質(zhì)量的要求并不高，只需要一點模板的存在就可以成功擴增。本方法的實驗結(jié)果證明了此方法提取的DNA在煙草及其他作物如小麥、高粱、玉米中能夠穩(wěn)定的擴增，實驗結(jié)果可靠、穩(wěn)定，在煙草和水稻中甚至能擴增出長達1.5kb長的片段。因此，此方法可以在這些作物中得到廣泛的應(yīng)用。但是用此方法制備的模板卻不能在棉花中成功擴增。文獻(XinZ，VeltenJP，OliverMJ，etal.High-throughputDNAextractionmethodsuitableforPCR[J].Biotechniques，2003，34(4)：820-827.)在快速法(有堿提取液煮沸中和的步驟)提取擴增實驗中也得到了類似的結(jié)果，煙草和高粱組織制備模板后在PCR混合體系中加與不加雜質(zhì)抑制劑BSA和PVP都能擴增出條帶，但是棉花組織卻必須加入BSA和PVP才能夠成功擴增。文獻(BurrK，HarperR，LinacreA.One-stepisolationofplantDNAsuitableforPCRamplification[J].Plantmolecularbiologyreporter，2001，19(4)：367-371.)報道超過1mm2的植物材料進行粗提時，其中的葉綠素等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)，或許棉花葉片組織中的一些物質(zhì)能夠抑制TaqDNA聚合酶的活性，從而影響擴增效果。本方法采用的NaOH法制備PCR擴增模板不需要液氮、不需要昂貴的儀器、無需離心、無需更換離心管、沒有加熱煮沸中和等步驟，粗提物可直接用作PCR反應(yīng)的模板。進行大量樣品DNA模板制備時能夠在最大程度上節(jié)省時間和實驗花費并減少樣品之間的交叉污染。此方法用來檢測轉(zhuǎn)基因煙草陽性株，實驗結(jié)果準確，穩(wěn)定，重復(fù)性好。此外，此方法的所有步驟都在室溫操作并且10mm2左右的葉子制備的DNA模板就足夠200余次PCR反應(yīng)使用，可減少對樣品的浪費并在植株生長早期即可進行檢測，加速實驗進程。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3