本發(fā)明屬于生命科學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種mRNA文庫(kù)構(gòu)建方法，特別涉及翻譯組RNC-mRNAs文庫(kù)構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：眾所周知，基因轉(zhuǎn)錄(mRNA，轉(zhuǎn)錄組)和蛋白質(zhì)翻譯(蛋白質(zhì)，翻譯組)是基因表達(dá)中非常重要的步驟，然后二者在表達(dá)豐度上并不一致且相關(guān)性較低。因此，對(duì)細(xì)胞中翻譯的mRNA進(jìn)行研究尤為重要。細(xì)胞在翻譯時(shí)，核糖體大小亞基結(jié)合在mRNA鏈上進(jìn)行移動(dòng)，并根據(jù)mRNA密碼子信息合成蛋白質(zhì)多肽鏈(nascent-chain)，從而形成核糖體-新生肽鏈復(fù)合物(RNC，RibosomeNascent-chainComplex)。其中，結(jié)合在復(fù)合物上mRNA鏈稱為RNC-mRNAs(ribosomenascent-chaincomplex-boundmRNAs，RNC-mRNAs)。早在2001年，Pradet-Balade等人提出假說(shuō)：翻譯中的mRNA的豐度更能反映蛋白質(zhì)的豐度。隨后研究表明，這種二元相關(guān)性仍然較低，R2在0.4以下。因此，從mRNA到蛋白質(zhì)的定量傳遞關(guān)系一直是中心法則沒(méi)有解決的科學(xué)問(wèn)題。張弓教授研究表明：加入mRNA的長(zhǎng)度因素，RNC-mRNAs和蛋白質(zhì)相對(duì)豐度與mRNA的長(zhǎng)度之間存在顯著的三元對(duì)數(shù)線性相關(guān)定量關(guān)系，R2在0.94以上，亦即超過(guò)94％的蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度可以通過(guò)其翻譯中RNC-mRNAs的相對(duì)量和mRNA長(zhǎng)度計(jì)算獲得。對(duì)RNC-mRNAs測(cè)序，就可以推算蛋白質(zhì)的含量。同時(shí)，該研究首次提出了翻譯比率的概念(translationratio,TR)，(Zhangetal.TranslatingmRNAsstronglycorrelatetoproteinsinamultivariatemannerandtheirtranslationratiosarephenotypespecific.Nucleicacidsresearch41，4743-4754，2013)。另外，RNC-mRNAs測(cè)序也可用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白。(Zhangetal.Howtodiscovernewproteins-translatomeprofiling.ScienceChinaLifesciences57，358-360，2014b)。因此，高效、完整地捕獲到核糖體新生肽鏈復(fù)合物RNC(ribosomenascent-chaincomplex)，提取出RNC-RNA(ribosomenascent-chaincomplex-RNA)，并進(jìn)一步分離出帶poly(A)結(jié)構(gòu)的RNC-mRNAs尤為重要。全長(zhǎng)RNC-mRNAs進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序，對(duì)高通量測(cè)序應(yīng)用和生命科學(xué)研究都具有重要意義。用一定濃度的翻譯延伸抑制劑放線酮處理組織或細(xì)胞可以使正在翻譯的核糖體停滯在mRNA上(固定核糖體狀態(tài))，利用蔗糖密度梯度離心法，可從新鮮細(xì)胞提取RNC。但在翻譯組延伸抑制劑濃度和作用時(shí)間不足的情況下，并不能完整固定所有的核糖體復(fù)合物。由于原有的超速離心平臺(tái)的限制，單純離心環(huán)節(jié)就5個(gè)小時(shí)。同時(shí)，RNC-mRNAs含量非常微量，往往會(huì)導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄和建庫(kù)失敗，或者部分RNC-mRNAs流失。從而看來(lái)，獲得全長(zhǎng)、完整的RNC-mRNAs仍有很大的優(yōu)化空間，目前尚未有專門一種快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的翻譯組RNC-mRNAs文庫(kù)構(gòu)建方案。因此，為完整且準(zhǔn)確地捕捉反映樣本的原始生理狀態(tài)的信息，開發(fā)出一種翻譯組RNC-mRNAs文庫(kù)構(gòu)建方法極其重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)以上要解決的技術(shù)問(wèn)題，提供一種快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的翻譯組RNC-mRNAs文庫(kù)構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步驟：步驟1)：RNC-mRNAs和mRNA準(zhǔn)備，該步驟包括如下具體步驟：樣品分組；RNC捕獲；RNC-RNA和TotalRNA抽提；RNC-mRNAs和mRNA分離；步驟2)合成雙鏈cDNA，該步驟包括如下具體步驟：RNA片段化；逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；聚合第二鏈cDNA；磁珠純化雙鏈cDNA；步驟3)RNC-mRNAs和mRNA文庫(kù)構(gòu)建，該步驟包括如下具體步驟：末端修復(fù)；連接接頭；片段選擇；擴(kuò)增文庫(kù)；磁珠純化文庫(kù)；文庫(kù)質(zhì)控；步驟4)數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析上述方法中，其中步驟1)中的樣品分組的方法為：設(shè)置樣品處理組和空白對(duì)照組，每組至少兩個(gè)重復(fù)，組間與組內(nèi)務(wù)必在相同環(huán)境下培養(yǎng)，后續(xù)用于RNC-mRNAs和mRNA抽提。上述方法中，其中步驟1)中的RNC捕獲方法為：RNC固定，清洗，細(xì)胞裂解，蔗糖密度梯度離心。首先，在培養(yǎng)基上加入終濃度為200μg/mL翻譯延伸抑制劑放線酮，并迅速放回原培養(yǎng)環(huán)境。目的是高濃度的翻譯抑制劑更能穩(wěn)定地固定所有RNC。其中，根據(jù)核糖體沉降系數(shù)，采用30％蔗糖作為緩沖液的密度梯度離心法，針對(duì)于BeckmanCoulterOptimaMAX-TL超速離心機(jī)平臺(tái)，配套使用PloycarbonateThickWall3.2mL厚壁透明超離管，離心參數(shù)為4℃，110000rpm，45min。此步驟大大縮短了樣品的處理時(shí)間，更有利于保護(hù)RNC-mRNAs完整性。上述方法中，其中步驟1)中的RNC-RNA和TotalRNA抽提方法為：采用含0.1％β-巰基乙醇的TRIGene總RNA提取試劑(GenStar)。這樣可以抑制酚類物質(zhì)氧化，使核糖體蛋白質(zhì)的二硫鍵打開，破壞其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使核糖體與綁定的RNA分離。上述方法中，其中步驟2)中的RNA片段化和逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA方法為：首先用金屬離子打斷法片段化RNA，然后采用雙引物結(jié)合的反轉(zhuǎn)錄法，延伸時(shí)間僅20分鐘。對(duì)RNC-mRNAs采用物理法打斷，能保證打斷的隨機(jī)性，同時(shí)大大提高了后續(xù)酶的作用性能，縮短了時(shí)間，避免了cDNA合成時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，逆轉(zhuǎn)錄延伸缺口的現(xiàn)象。這是保證RNC-mRNAs和mRNA由RNA到DNA全長(zhǎng)、完整的轉(zhuǎn)換關(guān)鍵一步。其中，金屬離子打斷法為：采用對(duì)5XRNCFirstRTBuffer中加入終濃度為1mMMg2+，高溫94℃，15分鐘，將RNA片段化至主峰為200nt的片段大小，反轉(zhuǎn)錄時(shí)加入基因轉(zhuǎn)錄抑制劑ActinomycinD(0.1μg/μl)。這樣可以有效防止殘存的DNA再次轉(zhuǎn)錄成RNA。其中雙引物含組分體積比為RandomHexamerprimer(100pM)∶Oligo(dT)18primer(100pM)＝3∶1。(即配4μl的反應(yīng)液需要3μlRandomHexamerprimer和1μlOligo(dT)18primer。下文中若出現(xiàn)含組分體積比，則同理表示)。反轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選為一種改良M-MLV后的PrimeScriptTMReverseTranscriptase，其具有極強(qiáng)的延伸能力、高效性、保真地合成第一鏈cDNA。上述方法中，其中步驟2)中的磁珠純化雙鏈cDNA方法為：雙鏈cDNA產(chǎn)物與AMPureXPBeads的體積比為1.8。這樣可以將50bp以上的雙鏈DNA全部完整捕獲下來(lái)。上述方法中，其中步驟3)中的末端修復(fù)方法為：將雙鏈的cDNA5’加上磷酸基團(tuán)，平末端化，將缺口補(bǔ)平。其中10XEndRepairBuffer含組分體積比：10×T4DNAPolymeraseBuffer∶0.1％BSA∶dNTPmixture，25mM＝8∶1∶1；其中EndRepairEnzymeMix含組分體積比：T4DNAPolymerase∶KlenowFragment∶T4PolynucleotideKinase＝6∶1∶1。上述方法中，其中步驟3)中的連接接頭方法為：將經(jīng)末端修飾后的DNA在5’連接上帶標(biāo)簽的DNAP1Adapter，3’加上DNAP1Adapter。用以引物結(jié)合和序列識(shí)別。其連接反應(yīng)試劑為5XLigasemasterMix，其含組分體積比為：T4DNALigase∶KlenowFragment，exo-∶10×T4DNALigaseBuffer∶dNTPmixture，25mM∶Water(HPLCGrade)＝3∶1∶20∶1∶15。上述方法中，其中步驟3)中的片段選擇方法為：首先加入雙鏈DNA連接產(chǎn)物與AMPureXPBeads，兩者體積比為0.7，磁珠結(jié)合大片段或者不需要的片段，保留的上清包含目的片段。然后加入與樣品0.15倍的AMPureXPBeads，磁珠結(jié)合目的片段，而小片段或者不需要的片段在上清中，不結(jié)合磁珠。通過(guò)本磁珠選擇法可精確獲得300-370bp范圍純化DNA文庫(kù)。上述方法中，其中步驟3)中的擴(kuò)增文庫(kù)方法為：對(duì)連接后的DNA進(jìn)行高效、保真性地文庫(kù)擴(kuò)增，用于后續(xù)文庫(kù)質(zhì)控要求和陽(yáng)性文庫(kù)富集。如何高保真，高特異性的擴(kuò)增文庫(kù)對(duì)反映RNC-mRNA原有狀態(tài)極為重要。其2XPCRSuperHigh-FidelityMix含組分體積比為PrimeSTARMaxDNAPolymerase∶PrimeSTARMaxPremix(2×)∶dNTPmixture，25mM＝1∶50∶1；反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性98℃，5min；擴(kuò)增(98℃，15sec；58℃，15sec；72℃，45sec；)10個(gè)循環(huán)；后延伸72℃，5min。上述方法中，其中步驟3)中的磁珠純化文庫(kù)方法為；擴(kuò)增后的文庫(kù)與AMPureXPBeads的體積比為0.9，將250bp以下和350bp以上的部分去掉，保留約330bp的單一主峰。上述方法中，其中步驟4)數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析方法為：采用超高精度高通量測(cè)序快速比對(duì)FANSe2算法與承啟云分析平臺(tái)，進(jìn)行翻譯組RNC-mRNAs和mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果：1)適用范圍廣：本實(shí)驗(yàn)方案及試劑專門針對(duì)于RNC-mRNAs和mRNA同步文庫(kù)構(gòu)建，也適用于常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組、TotalRNA測(cè)序。由于采用原配內(nèi)置DNA標(biāo)簽接頭，在通量允許下，還可以兼容DNA文庫(kù)同時(shí)上機(jī)測(cè)序，實(shí)現(xiàn)RNA、DNA、蛋白質(zhì)信息統(tǒng)一線上的同步挖掘。2)保證目的樣品信息完整性：從RNC捕獲、片段化、逆轉(zhuǎn)錄和文庫(kù)擴(kuò)增等環(huán)節(jié)都確保了RNC-mRNAs和mRNA的全長(zhǎng)信息和內(nèi)部狀態(tài)的完整性。通過(guò)高通量測(cè)序可以真實(shí)反映細(xì)胞原始的翻譯狀態(tài)。3)操作流程簡(jiǎn)化和實(shí)驗(yàn)時(shí)間緊湊：在RNC捕獲上，采用了先進(jìn)的BeckmanMAX-TL超速離心平臺(tái)，使超離時(shí)間濃縮為45分鐘。在cDNA合成和文庫(kù)構(gòu)建上，首先采用金屬離子高溫物理法對(duì)RNA片段化，后續(xù)才進(jìn)行cDNA合成、末端修復(fù)和磁珠片段選擇，這可以增加RNC-mRNAs信息的完整性、均一性。然后用雙引物逆轉(zhuǎn)錄法，此法大大提高了酶的效率，保證全長(zhǎng)擴(kuò)增的完整。在6個(gè)小時(shí)內(nèi)，可以實(shí)現(xiàn)從RNC捕獲到翻譯組文庫(kù)構(gòu)建整套流程。同時(shí)，反應(yīng)環(huán)節(jié)多處采用最優(yōu)化的混合Mix工作液，簡(jiǎn)化了步驟和增加了實(shí)驗(yàn)操作的一致性。4)降低測(cè)序成本：整套流程捕獲和建庫(kù)幾乎全部以國(guó)產(chǎn)試劑為原材料，通過(guò)優(yōu)化和調(diào)試配制而成，連引物和接頭也可自行定義和合成，大大降低了測(cè)序成本、擺脫了單個(gè)反應(yīng)就達(dá)800元貴價(jià)的原官方進(jìn)口RNA建庫(kù)試劑盒。5)創(chuàng)新性：本發(fā)明提供的方法，脫離了IonTorrent平臺(tái)對(duì)RNA與單雙鏈接頭雜交的官方RNA建庫(kù)方案，沿用了多年權(quán)威認(rèn)證的illumina平臺(tái)優(yōu)化后的RNA建庫(kù)實(shí)驗(yàn)思路，其測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量與官方建庫(kù)試劑盒所得數(shù)據(jù)一致。本發(fā)明提供的方法突破了高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)核酸類型的限制，實(shí)現(xiàn)DNA、RNA同時(shí)上機(jī)測(cè)序，為進(jìn)一步研究RNC-mRNAs提供了便利。6)案例實(shí)戰(zhàn)：選擇最為常見的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象，在典型的抗腫瘤藥物紫杉醇和順鉑單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥處理時(shí)，高通量測(cè)定其RNC-mRNAs和mRNA，來(lái)推測(cè)用藥選擇的效果。本發(fā)明以高通量測(cè)序?yàn)槭侄?，快速?jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效靈敏地檢測(cè)到樣品的RNC-mRNAs和mRNA的生態(tài)組成，實(shí)現(xiàn)對(duì)翻譯中RNA與蛋白質(zhì)的種類鑒定和精確定量。在臨床方面，通過(guò)翻譯組RNC-mRNAs測(cè)序，不僅能夠真實(shí)描述疾病發(fā)生、發(fā)展以及治療過(guò)程中機(jī)體代謝的狀態(tài)和變化，為臨床疾病的診斷、病理機(jī)制的探索、新治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供新的途徑和思路，還可以揭示外界環(huán)境(藥物、飲食)干擾因素對(duì)機(jī)體的影響，為藥效評(píng)價(jià)和愈前愈后實(shí)時(shí)監(jiān)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。在科學(xué)研究方面，RNC-mRNAs檢測(cè)精度遠(yuǎn)超蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以窮舉所有正在翻譯的基因，能有效地檢測(cè)極低豐度蛋白，實(shí)現(xiàn)精確蛋白質(zhì)組定量。校正人類基因組的注釋錯(cuò)誤，發(fā)現(xiàn)以往從未發(fā)現(xiàn)的新蛋白。該方法適用于各疾病和生物技術(shù)研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，具有廣闊的市場(chǎng)前景和醫(yī)學(xué)價(jià)值、社會(huì)效益，適于大范圍推廣應(yīng)用。附圖說(shuō)明圖1：Z、S、ZS、N組RNC-RNA電泳檢測(cè)結(jié)果；圖2：Z組RNC-mRNAs文庫(kù)的2100檢測(cè)結(jié)果；圖3：S組RNC-mRNAs文庫(kù)的2100檢測(cè)結(jié)果；圖4：ZS組RNC-mRNAs文庫(kù)的2100檢測(cè)結(jié)果；圖5：N組RNC-mRNAs文庫(kù)的2100檢測(cè)結(jié)果；圖6：序列質(zhì)量分布箱線圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一：本發(fā)明實(shí)施例涉及的試劑盒主要材料配比如下：1.RNC-mRNAs抽提模塊試劑：RBbindingsolution：20mg/mL(200X)cycloheximide；RBbuffer：20mM，pH7.4的HEPS-KOH、15mMMgCl2、200mMKCl、100ug/mLcycloheximide、2mMdithithreitol、雙蒸水；RBlysissolution：含1％TritonX-100的RBbuffer；RB30％sucrose：RBbuffer配制成30％蔗糖溶液；RBTrizolsolution：含0.1％β-巰基乙醇的TRIGene總RNA提取試劑(GenStar)；2.RNC-seqcDNASynthesiskit模塊試劑盒：5XRNCFirstRTBuffer含組分體積比：5×PrimeScriptBuffer∶25mMMgCl2∶dNTPmixture，25mM＝4∶1∶1；SuperReverseTrancriptase含組分體積比：PrimeScriptTMReverseTranscriptase；RNCRTPrimers含組分體積比：RandomHexamerprimer(100pM)∶Oligo(dT)18primer(100pM)＝3∶1；ActinomycinD：7-AminoactinomycinD(0.1μg/μl)；10XRNCSecondRTBuffer含組分體積比：10×E.coliDNAPolymeraseIBuffer(含0.025％BSA)∶dNTPmixture，25mM＝8∶1；3.RNC-seqDNALibraryConstructionkit模塊試劑盒：10XEndRepairBuffer含組分體積比：10×T4DNAPolymeraseBuffer∶0.1％BSA∶dNTPmixture，25mM＝8∶1∶1；EndRepairEnzymeMix含組分體積比：T4DNAPolymerase∶KlenowFragment∶T4PolynucleotideKinase＝6∶1∶1；5XLigasemasterMix含組分體積比：T4DNALigase∶KlenowFragment，exo-(5U/μL)∶10×T4DNALigaseBuffer∶dNTPmixture，25mM∶Water(HPLCGrade)＝3∶1∶20∶1∶15；2XPCRSuperHigh-FidelityMix含組分體積比：PrimeSTARMaxDNAPolymerase∶PrimeSTARMaxPremix(2×)∶dNTPmixture，25mM＝1∶50∶1；本發(fā)明實(shí)施例涉及的引物及接頭合成信息如下：1、文庫(kù)擴(kuò)增PCR引物合成方法——PCRPrimersMix試劑名稱序號(hào)(引物名稱)組分(5’-3’)堿基數(shù)PCRPrimersMix1-PCR-ACCATCTCATCCCTGCGTGTC202-PCR-P1CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG28將合成后的1—PCR-A和2-PCR-P1用10mMTrispH7.5，稀釋成20μM，然后將兩條引物等體積混合，即可配制成可直接用于反應(yīng)的PCRprimermix(10μM)試劑。2、標(biāo)簽接頭前處理——DNAABarcodeX和DNAP1Adapter注：其中上述表中序列中“*T*T”代表對(duì)序列的3‘末端的兩個(gè)T堿基進(jìn)行硫代修飾，“*”表示硫代磷酸酯鍵。序列合成的純化方式為HPLC純化方式，為帶羥基的單鏈核苷酸，需前處理成互補(bǔ)的雙鏈接頭。1)將合成的單鏈引物干粉用1×LowTE稀釋成200μM。2)DNA文庫(kù)5’端A接頭合成雙鏈法：各取稀釋好的A-BarcodeX-F20uL，A-BarcodeX-R20μL，加入20μL5×T4DNALigaseBuffer和40μL無(wú)核酸水，混合后使終濃度為40μM。在PCR儀上退火合成雙鏈接頭，反應(yīng)條件如下：95℃，5min；72℃，5min；60℃，5min；50℃，3min；40℃，3min；30℃，3min；20℃，3min；10℃，3min；4℃，∞min。最終得到40μM雙鏈接頭DNAABarcodeX(X指1-08)，置-20℃保存。3)DNA文庫(kù)3’端DNAP1Adapter接頭合成雙鏈法：同上DNAABarcodeX處理。下面通過(guò)結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。本實(shí)施例中所用的材料為廣州賽哲生物科技股份有限公司提供的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，在加入紫杉醇、順鉑藥物48小時(shí)后，對(duì)RNC-mRNAs、mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，比較單獨(dú)和聯(lián)合用藥時(shí)的表達(dá)情況。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)流程具體步驟如下。1細(xì)胞樣品準(zhǔn)備1.1藥物紫杉醇注射液(哈藥集團(tuán)生物工程有限公司，5ml∶30mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20059962)；注射用順鉑(齊魯制藥有限公司，10mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20073652)。以上藥物臨用前用RPMI1640培養(yǎng)液均配成2umol/L。1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組人乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含10％的小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，22400121)在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到70％以上，開始加藥處理。細(xì)胞傳代后分組加藥，第一組加紫杉醇(Z組)，第二組加順鉑(S組)，第三組加紫杉醇和順鉑(ZS組)，第四組是不加任何藥物的對(duì)照組(N組)。加藥處理48小時(shí)后，進(jìn)行下一步處理。Z組、S組、ZS組、N組各組至少兩個(gè)平皿進(jìn)行培養(yǎng)。抽提TotalRNA與RNC-RNA的細(xì)胞務(wù)必為同一批，相同環(huán)境下培養(yǎng)。首先選擇其中一個(gè)平皿進(jìn)行RNC捕獲，后續(xù)用于RNC-mRNAs抽提，另一平皿用于TotalRNA提取，后續(xù)用于mRNA抽提。最終，得到四組人乳腺癌MCF-7細(xì)胞特定時(shí)空下的RNC-mRNAs、mRNA產(chǎn)物。2.RNC捕獲2.1RNC固定對(duì)正在培養(yǎng)的10^6-10^7細(xì)胞，加入100ulRBbindingsolution到培養(yǎng)基，輕輕傾斜混勻，馬上放回原培養(yǎng)箱中，孵育30min。該RBbindingsolution體積為培養(yǎng)基的1/100。在培養(yǎng)基上加入翻譯延伸抑制劑放線酮的終濃度為200μg/mL。2.2清洗倒掉培養(yǎng)基，加入5mL預(yù)冷的0℃1×PBS浸沒(méi)細(xì)胞，輕柔傾斜沖洗，棄上清，沖洗兩次。最后，用槍頭將殘留液體吸干凈，置于冰上待用。2.3細(xì)胞裂解(1)加入1mLRBlysissolution，輕柔傾斜混勻，保證完全覆蓋，冰上放置30min。(2)用干凈細(xì)胞刮輕輕將細(xì)胞收集，轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的1.5mL離心管中。(3)將細(xì)胞裂解液在4℃離心機(jī)下進(jìn)行離心，16000g，10min，去除細(xì)胞碎片，保留上清。2.4蔗糖密度梯度離心(1)小心將500ul上清液轉(zhuǎn)移到已預(yù)冷且裝有2.7mLRB30％sucrose的超離管上層，對(duì)超離管編號(hào)，并根據(jù)轉(zhuǎn)頭對(duì)側(cè)編號(hào)的超離管進(jìn)行兩兩配平，要求稱量誤差小于0.01g。該RB30％sucrose與上清體積比大于或等于5∶1。(2)置于超速離心機(jī)4℃，110000rpm，45min。(3)離心結(jié)束后，迅速轉(zhuǎn)移超離管到冰上，緩慢吸走上清，務(wù)必將殘留的蔗糖去除干凈，將底部壁上帶有微黃、透明的沉淀輕柔溶解于RBlysissolution中，得到細(xì)胞RNC。下一步進(jìn)行RNC-RNA抽提。3.RNC-RNA和TotalRNA抽提TotalRNA需首先進(jìn)行樣品清洗，捕獲后RNC則直接進(jìn)行3.2樣品裂解。3.1樣品清洗用于TotalRNA抽提的細(xì)胞需先進(jìn)行樣品清洗，其他處理步驟與RNC-RNA處理同步。倒掉培養(yǎng)基，加入5mL預(yù)冷的0℃1×PBS浸沒(méi)細(xì)胞，輕柔傾斜沖洗，棄上清，沖洗兩次。最后，用槍頭將殘留液體吸干凈，置于冰上待用。3.2樣品裂解分別加入1mLRBlysissolution到上一步得到的細(xì)胞或捕獲后的RNC中，輕柔顛倒5次，冰上放置5min。3.3氯仿萃取(1)將樣品裂解液，加入200uL氯仿(裂解液∶氯仿體積比＝5∶1)，顛倒5次，冰上放置5min。(2)置4℃冷凍離心機(jī)，12000g，15min，離心后轉(zhuǎn)移上清到新的1.5mL離心管中。3.4乙醇凍存及清洗(1)加入1mL4℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇(無(wú)水乙醇∶上清體積比≥2.5∶1)，充分顛倒混勻，置于-80℃凍存1小時(shí)。(2)取出離心管，觀察無(wú)結(jié)塊后，置4℃冷凍離心機(jī)，12000g，20min，棄上清，保留白色沉淀，初步得到RNA沉淀。3.5溶解RNA加入30-60ulDEPCwater溶解RNA，-80℃保存。所得產(chǎn)物即為RNC-RNA、TotalRNA。3.6RNA質(zhì)控(1)紫外分光檢測(cè)微量紫外分光檢測(cè)，根據(jù)10^6細(xì)胞起始量，一般可達(dá)2ug總量以上，在OD260處有高吸收峰。OD260/280為1.8-2.2，OD260/230為1.8-2.2為合格。若在230處有高凸出吸收峰則常為蔗糖殘留。(2)瓊脂糖檢測(cè)跑1％瓊脂糖凝膠電泳，120V，30min，可以檢測(cè)到28S和18S條帶明亮、清澈則為質(zhì)量合格。若28S呈彌散狀則表明RNC-mRNAs、mRNA已被降解。若在膠孔處有亮條帶則常為蔗糖大分子殘留。質(zhì)控部分結(jié)果見圖1Z、S、ZS、N組RNC-RNA電泳檢測(cè)結(jié)果，圖從左往右，泳道1為Z組RNC-RNA；泳道2為S組RNC-RNA；泳道3為ZS組RNC-RNA；泳道4為N組RNC-RNA；泳道5為MakerD2000，條帶大小為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道6為人totalRNA對(duì)照。從結(jié)果顯示，四組RNC-RNA均合格，無(wú)降解。4.RNC-mRNAs和mRNA分離利用poly(A)RNA3’末端的polyA尾特點(diǎn)，使用Oligo(dT)25磁珠法從RNC-RNA、TotalRNA中分離RNC-mRNAs和mRNAs，可直接用于后續(xù)翻譯組測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建。本流程使用mRNAPurificationKit(#61006)，并對(duì)操作說(shuō)明書進(jìn)行優(yōu)化。4.1RNA變性(1)按15ugRNC-RNA、TotalRNA分別加入DEPCwater，補(bǔ)至100uL進(jìn)行稀釋。(2)混勻后，65℃變性2min以打開二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后將樣品立即置于冰上。4.2Dynabeads磁珠準(zhǔn)備(1)將50ul重懸后的Dynabeads磁珠加入到低吸附管中，置磁力架上靜置30s。(2)棄掉上清，將100ulBindingBuffer加入管中，輕輕重懸混勻，置于磁力架上2min，小心吸出上清。4.3捕獲RNC-mRNAs、mRNA(1)將磁珠重懸于100ulBindingBuffer(BindingBuffer體積∶樣品體積＝1∶1)，和第一步變性后的15ugRNC-RNA、TotalRNA分別加入管中，放置在垂直旋轉(zhuǎn)器中旋轉(zhuǎn)孵育，孵育時(shí)間從原來(lái)的5min延長(zhǎng)至15min，保證所有目的RNA都完整結(jié)合到磁珠上。(2)將管置于磁力架上靜置2min，小心吸去上清。(3)加入500ulWashingBuffer于管中，輕輕重懸混勻，置于磁力架上2min，小心吸去上清。清洗次數(shù)從原來(lái)的一次，增加至兩次。WashingBuffer體積由原來(lái)的200ul增加至500ul，保證可以完全將游離于磁珠外和管壁上的非目的RNA、DNA去除干凈。最大限度避免了核糖體RNA和DNA的污染，與傳統(tǒng)步驟相比，不需要加入DNaseI消化DNA步驟。4.4洗脫RNC-mRNAs、mRNA(1)向含磁珠的管中加入10ul10mMTris-HCl，pH7.5，80℃加熱2min，將mRNA從磁珠上洗脫下來(lái)，迅速將管轉(zhuǎn)至磁力架上，轉(zhuǎn)移mRNA到新的RNase-free管中。樣品立即置冰上，繼續(xù)進(jìn)行下一步，或者-80℃保存。4.5RNC-mRNAs、mRNA質(zhì)控RNC-mRNAs、mRNA分別僅占RNC-RNA、TotalRNA的1-5％。因此，樣品起始量和純化后RNC-mRNAs、mRNA得率應(yīng)嚴(yán)格利用Qubit熒光定量檢測(cè)?？梢宰鳛榕袛鄏RNA殘留的參考。5.雙鏈cDNA合成5.1RNA片段化依次加入以下試劑并輕柔混勻。成分體積(μl)5XRNCFirstRTBuffer4RNCRTPrimers2RNC-mRNAsormRNA5ngNuclese-freewater補(bǔ)至20Total20將樣品置于PCR擴(kuò)增儀上94℃，15min(熱蓋105℃)。反應(yīng)結(jié)束后，迅速將反應(yīng)管插入到冰上冷卻。此步反應(yīng)可以利用Mg2+金屬離子在高溫下，將RNA片段化至主峰為200nt的片段大小。5.2cDNA第一鏈合成成分體積(μl)RTreactionMix20RNaseInhibitor0.5ActinomycinD(0.1μg/μl)5SuperReverseTrancriptase2Nuclese-freewater12.5Total40將樣品置于PCR擴(kuò)增儀上(熱蓋105℃)，設(shè)置如下反應(yīng)溫度：Step125℃，10min；Step242℃，20min；Step370℃，10min；Step404℃，hold；反應(yīng)結(jié)束后，立即置于冰上，并進(jìn)行cDNA第二鏈合成反應(yīng)。5.3cDNA第二鏈合成依次加入以下試劑到cDNA第一鏈合成反應(yīng)液(40μl)中并輕柔混勻。成分體積(μl)cDNAfirststrandreactionMix4010XRNCSecondRTBuffer8SuperDNASynthesisEnzymemix4Nuclese-freewater28Total80將樣品置于PCR擴(kuò)增儀上(熱蓋關(guān)閉)，16℃，60min。反應(yīng)結(jié)束后，即可得到的產(chǎn)物為非平末端的雙鏈cDNA。接著進(jìn)行磁珠純化，去除反應(yīng)液中酶和底物等雜質(zhì)。5.4磁珠純化雙鏈cDNA1)徹底重懸AMPureXPBeads，室溫平衡30min。2)向雙鏈cDNA產(chǎn)物加入144μl(1.8X)重懸后的AMPureXPBeads到1.5mL的低吸附管中，上下吹打混勻10次。3)室溫孵育5min，孵育期間避免強(qiáng)烈震動(dòng)。4)將1.5mL的低吸附管轉(zhuǎn)移到磁力架上，使上清與磁珠分離。靜置3min，直至溶液變清澈后，小心移棄上清。磁珠中包含目的DNA，應(yīng)避免觸碰到。5)加入500μl新鮮配制的80％乙醇到磁力架的管上，利用磁力的作用，旋轉(zhuǎn)低吸附管3次，來(lái)清洗磁珠。然后室溫靜止30s，小心移棄上清。6)重復(fù)步驟5)一次，總共2次清洗。7)將低吸附管短暫離心2s，用槍頭將殘留的乙醇去除干凈。在磁力架上，打開蓋子，磁珠在室溫下干燥5min，直至磁珠表面無(wú)亮晶晶的乙醇?xì)埩簟?)將管移開到磁力架外，加入45μl1XTEbuffer洗脫，上下吹打混勻10次，室溫孵育2min。然后將管置于磁力架上，直至溶液澄清。9)將43μl上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈無(wú)核酸的0.2PCR管上。注：立即進(jìn)行下一步反應(yīng)或保存。在-20℃能保存兩周，-80℃能保存一個(gè)月。6.文庫(kù)構(gòu)建6.1末端修復(fù)1)依次加入以下試劑到雙鏈cDNA產(chǎn)物(55.5μl)中并輕柔混勻。成分體積(μl)doublestrandedcDNA4310XEndRepairBuffer5EndRepairEnzymeMix2Total502)將樣品置于PCR擴(kuò)增儀上(熱蓋105℃)，設(shè)置如下反應(yīng)溫度：Step125℃，30min；Step270℃，10min；Step34℃，hold；反應(yīng)結(jié)束后，立即置于冰上，并進(jìn)行下一步連接反應(yīng)。6.2接頭連接1)依次加入以下試劑到平末端的DNA產(chǎn)物(50μl)中并輕柔混勻。成分體積(μl)BluntendDNA505XLigasemasterMix20DNAP1Adapter1DNAABarcodeX1Nuclese-freewater28Total1002)將樣品置于PCR擴(kuò)增儀上(熱蓋105℃)，設(shè)置如下反應(yīng)溫度：Step125℃，15min；Step268℃，5min；Step34℃，hold；反應(yīng)結(jié)束后，立即置于冰上，并進(jìn)行下一步磁珠法片段選擇。6.3片段選擇與純化片段分布和文庫(kù)的產(chǎn)品很大程度上依賴于片段選擇的方法。片段選擇可以通過(guò)PippinPrep自動(dòng)化切膠法，E-Gelsizeselectgels法或者AMPureXPBeads磁珠法。針對(duì)于200bp文庫(kù)，PippinPrep自動(dòng)化切膠法選擇“tight”315bp，E-Gelsizeselectgels法選擇回收主峰為330bp，而本磁珠法選擇300-370bp范圍的片段。Step1去除大片段：磁珠結(jié)合大片段或者不需要的片段，而上清則包含目的片段。1)將連接反應(yīng)產(chǎn)物補(bǔ)Nuclese-freewater至100μl體積。徹底重懸AMPureXPBeads，室溫平衡30min。2)向反應(yīng)產(chǎn)物加入70μl(0.7X)重懸后的AMPureXPBeads到1.5mL的低吸附管中，上下吹打混勻10次。3)室溫孵育5min，孵育期間避免強(qiáng)烈震動(dòng)。4)將1.5mL的低吸附管轉(zhuǎn)移到磁力架上，使上清與磁珠分離。小心將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mL的低吸附管中，保留上清。而磁珠上包含大片段DNA，則移棄。Step2去除小片段：磁珠結(jié)合目的片段，而小片段或者不需要的片段在上清中，不結(jié)合磁珠。5)向上一步上清產(chǎn)物加入15μl(0.15X)重懸后的AMPureXPBeads到1.5mL的低吸附管中，上下吹打混勻10次。6)室溫孵育5min，孵育期間避免強(qiáng)烈震動(dòng)。7)將1.5mL的低吸附管轉(zhuǎn)移到磁力架上，使上清與磁珠分離。靜置3min，直至溶液變清澈后，小心移棄上清。磁珠中包含目的DNA，應(yīng)避免觸碰到。8)加入500μl新鮮配制的80％乙醇到磁力架的管上，利用磁力的作用，旋轉(zhuǎn)低吸附管3次，來(lái)清洗磁珠。然后室溫靜止30s，小心移棄上清。9)重復(fù)步驟5)一次，總共2次清洗。10)將低吸附管短暫離心2s，用槍頭將殘留的乙醇去除干凈。在磁力架上，打開蓋子，磁珠在室溫下干燥5min，直至磁珠表面無(wú)亮晶晶的乙醇?xì)埩簟?1)將管移開到磁力架外，加入20μl1XTEbuffer洗脫，上下吹打混勻10次，室溫孵育2min。然后將管置于磁力架上，直至溶液澄清。12)將20μl上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈無(wú)核酸的0.2mlPCR管上。6.4PCR文庫(kù)擴(kuò)增1)依次加入以下試劑到連接后DNA產(chǎn)物(40μl)中并輕柔混勻。成分體積(μl)LigatedDNA20PCRPrimersMix52XPCRSuperHigh-FidelityMix25Total502)將樣品置于PCR擴(kuò)增儀上(熱蓋105℃)，設(shè)置如下反應(yīng)溫度：反應(yīng)結(jié)束后，立即置于冰上，并進(jìn)行下一步PCR文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物純化。6.5磁珠純化文庫(kù)1)徹底重懸AMPureXPBeads，室溫平衡30min。2)向雙鏈cDNA產(chǎn)物加入45μl(0.9X)重懸后的AMPureXPBeads到1.5mL的低吸附管中，上下吹打混勻10次。3)室溫孵育5min，孵育期間避免強(qiáng)烈震動(dòng)。4)將1.5mL的低吸附管轉(zhuǎn)移到磁力架上，使上清與磁珠分離。靜置3min，直至溶液變清澈后，小心移棄上清。磁珠中包含目的DNA，應(yīng)避免觸碰到。5)加入500μl新鮮配制的80％乙醇到磁力架的管上，利用磁力的作用，旋轉(zhuǎn)低吸附管3次，來(lái)清洗磁珠。然后室溫靜止30s，小心移棄上清。6)重復(fù)步驟5)一次，總共2次清洗。7)將低吸附管短暫離心2s，用槍頭將殘留的乙醇去除干凈。在磁力架上，打開蓋子，磁珠在室溫下干燥5min，直至磁珠表面無(wú)亮晶晶的乙醇?xì)埩簟?)將管移開到磁力架外，加入20μl1XTEbuffer洗脫，上下吹打混勻10次，室溫孵育2min。然后將管置于磁力架上，直至溶液澄清。9)將20μl上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈無(wú)核酸的0.2mlPCR管上。10)最終得到的文庫(kù)需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格質(zhì)控：Qubit濃度檢測(cè)和安捷倫2100檢測(cè)，文庫(kù)定量后方可進(jìn)行模板制備、上機(jī)測(cè)序。注：文庫(kù)在-20℃能保存兩周，-80℃能保存一個(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間。使用前，應(yīng)在冰上解凍。7.文庫(kù)質(zhì)控1)取1ulDNA文庫(kù)，使用QubitdsDNAHSAssayKit熒光測(cè)定文庫(kù)濃度及總量。在20μl洗脫體系中，Z、S、ZS、N組的RNC-mRNAs文庫(kù)、mRNA文庫(kù)濃度均在2-5ng/μl之間，保持較高的擴(kuò)增效率，且不失真，符合預(yù)期1-10ng/μl范圍。2)取1μl文庫(kù)(根據(jù)上一步測(cè)定的濃度，將其稀釋至1ng/μl)，使用HighSensitivityDNAKit檢測(cè)文庫(kù)的片段大小和摩爾濃度。片段大小要求在290-370bp之間有單一凸出峰。經(jīng)2100檢測(cè)結(jié)果顯示，四組的八個(gè)文庫(kù)均在320-360bp范圍內(nèi)，符合200base文庫(kù)讀長(zhǎng)要求，文庫(kù)質(zhì)控合格。質(zhì)控合格的文庫(kù)精確定量至100pM，可直接用于模板制備。圖2、3、4、5分別表示Z、S、ZS、N組的RNC-mRNAs文庫(kù)的2100檢測(cè)結(jié)果，主峰長(zhǎng)度分別為349bp、339bp、352bp、326bp，符合要求。8.IonProton模板制備取Z、S、ZS、N組的RNC-mRNAs文庫(kù)、mRNA文庫(kù)共8個(gè)編碼文庫(kù)稀釋至100pM后等量混合。取5μL作為模板稀釋因子。根據(jù)IonPITMHi-QTMOT2200Kit模板制備試劑盒進(jìn)行乳液PCR，具體操作流程參考IonProton模板制備產(chǎn)品說(shuō)明書。9.IonProton上機(jī)測(cè)序嚴(yán)格按照儀器操作說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)序操作，本實(shí)施例中采用P1芯片進(jìn)行測(cè)序。在芯片中加入擴(kuò)增酶、引物和陽(yáng)性的文庫(kù)模板，測(cè)序時(shí)間為兩個(gè)半小時(shí)，便可獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)。10.測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控運(yùn)用IonTorrentPGM服務(wù)器系統(tǒng)TorrentSuite4.2自帶的FastQC分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控。見圖6序列質(zhì)量分布箱線圖，橫坐標(biāo)是reads堿基位置(5’-＞3’)，縱坐標(biāo)是所有reads在該位點(diǎn)堿基質(zhì)量統(tǒng)計(jì)，包括最大值、最小值、上四分位值、下四分位值、中位數(shù)(紅色實(shí)線)和平均值(藍(lán)色折線)。從圖中可知，本次測(cè)序過(guò)濾后的數(shù)據(jù)平均質(zhì)量很高(Q＞28)，基本分布在綠色區(qū)域。測(cè)序質(zhì)控在50-250bp均達(dá)到Q20標(biāo)準(zhǔn)以上，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，結(jié)果證明設(shè)計(jì)的文庫(kù)接頭引物和文庫(kù)構(gòu)建試劑盒組裝質(zhì)量合格。由此，翻譯組RNC-mRNAs文庫(kù)構(gòu)建模式初步建立。11.數(shù)據(jù)分析采用超高精度高通量測(cè)序快速比對(duì)FANSe2算法與承啟云分析平臺(tái)，對(duì)翻譯組RNC-mRNAs和mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。從分析結(jié)果顯示，第一組加紫杉醇(Z組)，第二組加順鉑(S組)，第三組加紫杉醇和順鉑(ZS組)，第四組不加任何藥物的對(duì)照組(N組)中RNC-mRNAs與mRNA的定量相關(guān)系數(shù)分別是0.52、0.68、0.75、0.63，說(shuō)明翻譯中mRNA與轉(zhuǎn)錄后的總mRNA并不相同。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，紫杉醇、順鉑處理組的TERT基因(NM_198253，端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶)和BCL2基因(NM_000633，凋亡調(diào)控因子)表達(dá)降低，聯(lián)合用藥組降低更為明顯。端粒酶，在細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒的延長(zhǎng)的一種酶，可將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端。端粒在不同物種細(xì)胞中對(duì)于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能延長(zhǎng)縮短的端粒，從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力。端粒酶在正常人體組織中的活性被抑制，在腫瘤中被重新激活，端粒酶可能參與惡性轉(zhuǎn)化。端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長(zhǎng)期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用。TERT基因(編碼端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶)，TERT基因下調(diào)將導(dǎo)致與端粒酶活性下降，從而可以抑制癌細(xì)胞增值。BCL2(編碼細(xì)胞凋亡調(diào)控因子)，可以促進(jìn)或者抑制細(xì)胞凋亡?；虮磉_(dá)下調(diào)與癌癥凋亡調(diào)控有關(guān)。綜上所述，紫杉醇和順鉑作用于MCF-7細(xì)胞阻斷了某些關(guān)鍵通路，抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，且聯(lián)合時(shí)有協(xié)同作用。最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3