本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速、簡(jiǎn)便、大量提取細(xì)菌質(zhì)粒的方法。

背景技術(shù)：

質(zhì)粒DNA的提取是分子生物學(xué)中基礎(chǔ)工作之一，而獲得足夠用量的質(zhì)粒DNA是保證后續(xù)轉(zhuǎn)基因、BAC文庫(kù)構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等研究工作的重要前提條件，只有在足夠用量質(zhì)?；A(chǔ)上，才能進(jìn)一步利用花粉管法或其他方法將外源基因?qū)雱?dòng)植物基因組中，并進(jìn)而對(duì)特定基因功能進(jìn)行研究。

現(xiàn)有技術(shù)中，為較為便捷的提取質(zhì)粒，國(guó)內(nèi)外很多生物試劑公司都研制了與提取質(zhì)粒技術(shù)相關(guān)的商品化試劑盒。但該類試劑盒均以純化柱為主，成本高，價(jià)格昂貴，并且利用其進(jìn)行大量質(zhì)粒DNA提取時(shí)，需要配置大量的培養(yǎng)液，并進(jìn)行大量的搖菌培養(yǎng)，且需要特定的離心機(jī)，耗時(shí)費(fèi)力，加大了實(shí)驗(yàn)的工作量，使得實(shí)驗(yàn)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，影響生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作效率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

就質(zhì)粒提取方法而言，現(xiàn)有技術(shù)中，利用玻璃珠懸起菌落并快速提取質(zhì)粒的方法在真核表達(dá)系統(tǒng)例如酵母菌株中有所應(yīng)用，但該方法在原核表達(dá)系統(tǒng)尤其是大腸桿菌的質(zhì)粒提取中是否能夠獲得較好的應(yīng)用效果則缺乏相關(guān)的報(bào)道，同時(shí)由于真核表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)本身的巨大差異，該方法能否應(yīng)用于原核表達(dá)系統(tǒng)也是未知的。由于原核表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用十分廣泛，因而極有必要就細(xì)菌中大量質(zhì)粒提取方法進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)，從而為相關(guān)基因研究及原核表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種簡(jiǎn)化的、較為快速的提取大量細(xì)菌質(zhì)粒的方法，從而為相關(guān)基因研究奠定良好應(yīng)用基礎(chǔ)。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案詳細(xì)介紹如下

一種大量提取細(xì)菌質(zhì)粒的方法，包括如下步驟：

（1）篩選獲得含有質(zhì)粒的重組的原核細(xì)胞，具體為：

首先，在將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞后，挑取含有質(zhì)粒的原核細(xì)胞的單菌落接種于含有抗性抗生素的液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

其次，吸取擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液涂布于含有抗性抗生素的固體培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)過(guò)夜；

最后，在平板上加入無(wú)菌水和滅菌的玻璃珠搖晃，利用玻璃珠懸起菌落；待培養(yǎng)基中無(wú)菌落殘留時(shí)，將含有菌落的無(wú)菌水吸出，置于離心管中，離心棄上清，保留沉淀，即為含有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞（原核細(xì)胞）；

本申請(qǐng)中所述原核細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，具體例如為大腸桿菌細(xì)胞；

（2）裂解細(xì)胞，具體為：

在步驟（1）中離心后沉淀中加入溶液I，震蕩重懸菌體，靜置3~5min；然后加入溶液II ，混勻后，冰上放置3~5min；再加入溶液III，混合均勻，并冰上放置3~5min；

所述溶液I，每升溶液中的組份為：1M Tris-HCL（pH=8.0）、50mL，0.5M EDTA、20mL，其余為ddH2O，pH=7.5，高溫滅菌；

所述溶液II，每升溶液的配制方法為：0.4M 的NaOH的ddH₂O溶液與質(zhì)量濃度2%的SDS的ddH₂O溶液的等體積混合液；0.4M 的NaOH的ddH₂O溶液可由8g NaOH 溶于500mL的ddH₂O中配制而成，質(zhì)量濃度2%的SDS的ddH₂O溶液可由10g SDS溶于500mL的ddH₂O中配制而成；需要強(qiáng)調(diào)的是，溶液II需現(xiàn)配現(xiàn)用；

所述溶液III，每升溶液的制備方法為：在600mL的ddH₂O中依次加入129.69g的KAc和100mL冰乙酸，溶解并混合均勻后，乙酸調(diào)節(jié)pH=4.8，然后用ddH₂O定容至1L，并最終調(diào)節(jié)pH=4.8；

（3）提取質(zhì)粒，具體為：

將步驟（2）中冰上放置后溶液離心，棄沉淀，取上清液于離心管中，加入等體積量的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，放置15~25min；所述氯仿-異戊醇混合液中，以體積比計(jì)，氯仿：異戊醇=24：1；

將放置后混合液離心，取上清液置于預(yù)先加有無(wú)水乙醇的離心管中，離心，棄上清，再用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇漂洗沉淀后，即為所提取的質(zhì)粒；離心管中預(yù)先加入的無(wú)水乙醇的量?jī)?yōu)選為上清液2倍體積的量，所加入無(wú)水乙醇優(yōu)選為-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇；

所提取的質(zhì)粒在干燥后，可溶于TE緩沖液中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本申請(qǐng)通過(guò)對(duì)細(xì)菌中質(zhì)粒提取操作流程的優(yōu)化，結(jié)果表明，利用玻璃珠懸起菌落并快速提取質(zhì)粒的方法在原核表達(dá)系統(tǒng)中具有較好的應(yīng)用效果，可較為快速的獲得大量質(zhì)粒，為轉(zhuǎn)基因、BAC文庫(kù)構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。由于該方法不需大量搖菌培養(yǎng)，操作較為方便，因而操作成本較為低廉；同時(shí)由于不需要大型的高速低溫離心機(jī)的使用，且能夠較為快速的大量提取質(zhì)粒，因而對(duì)于縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率具有較好地應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為玻璃珠懸起菌落圖；

圖2為本發(fā)明的質(zhì)粒提取方法和常規(guī)大提質(zhì)粒試劑盒的提取方法在提取重組質(zhì)粒pMDC83- pTaWG04-GUS時(shí)的電泳結(jié)果對(duì)比圖，其中：M為Marker Ⅳ，1-6泳道為挑取的6個(gè)陽(yáng)性單克隆pMDC83-pTaWG04-GUS用常規(guī)試劑盒提取質(zhì)粒的電泳圖，7-13泳道為挑取的7個(gè)陽(yáng)性單克隆pMDC83-pTaWG04-GUS用本發(fā)明的質(zhì)粒提取方法提取質(zhì)粒的電泳圖；

圖3為目標(biāo)基因pTaWG04在提取質(zhì)粒中的PCR擴(kuò)增后的電泳圖；其中M為Marker Ⅳ，1-3泳道為利用提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行目標(biāo)條帶pTaWG04的PCR擴(kuò)增結(jié)果；

圖4為質(zhì)粒酶切結(jié)果；其中泳道M為Marker Ⅳ，泳道1為質(zhì)粒小提酶切結(jié)果，泳道2為本發(fā)明方法所提質(zhì)粒酶切結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。介紹具體實(shí)施例前，對(duì)本發(fā)明中涉及的部分物料及試驗(yàn)設(shè)備情況簡(jiǎn)要介紹說(shuō)明如下。

生物材料及實(shí)驗(yàn)試劑：

大腸桿菌DH5α菌株，為TaKaRa公司商品化產(chǎn)品；

植物表達(dá)載體pMDC83 ：由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室涂金星教授贈(zèng)予；

植物表達(dá)載體pBI101：購(gòu)自于Clontech公司；

常規(guī)QIAGEN的大提質(zhì)粒試劑盒：購(gòu)自于QIAGEN公司；

常規(guī)小提質(zhì)粒試劑盒：購(gòu)自于天根生化科技公司；

溶液I，每升溶液中的組份為：1M Tris-HCL（PH=8.0）、50mL，0.5M EDTA、20mL，其余為ddH₂O，PH=7.5，高溫滅菌；

溶液II，每升溶液的配制方法為：0.4M 的NaOH的ddH₂O溶液與質(zhì)量濃度2%的SDS的ddH₂O溶液的等體積混合液；0.4M 的NaOH的ddH₂O溶液可由8g NaOH 溶于500mL的ddH₂O中配制而成，2% SDS溶液可由10g SDS溶于500mL的ddH₂O中配制而成；溶液II現(xiàn)配現(xiàn)用；

溶液III，每升溶液的制備方法為：在600mL的ddH₂O中依次加入129.69g的KAc和100mL冰乙酸，溶解并混合均勻后，乙酸調(diào)節(jié)pH=4.8，然后用ddH₂O定容至1L，最終確定pH=4.8；

溶液I、溶液II、溶液III配制時(shí)按現(xiàn)有技術(shù)配制即可，相關(guān)物料也為常規(guī)商品化試劑或物料，不再贅述。

實(shí)施例

本實(shí)施例以含有TaWG04啟動(dòng)子的pMDC83質(zhì)粒為例，對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行了提取實(shí)驗(yàn)，相關(guān)過(guò)程簡(jiǎn)要介紹如下。

由于重組質(zhì)粒的構(gòu)建是相關(guān)轉(zhuǎn)基因操作的基礎(chǔ)，因而首先就含有TaWG04啟動(dòng)子（pTaWG04）的重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)要介紹如下， pTaWG04啟動(dòng)子堿基序列如SEQ ID NO.1所示。

第一，首先利用HindIII+EcoRI對(duì)pBI101進(jìn)行雙酶切，獲得GUS基因，然后利用HindIII+EcoRI對(duì)質(zhì)粒pMDC83進(jìn)行雙酶切，最后，利用T4 DNA連接酶將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，即，將GUS基因融合到pMDC83上，構(gòu)建獲得pMDC83-GUS重組載體。

酶切時(shí)的雙酶切體系設(shè)計(jì)為：

10×Fast Digest buffer，6μL；

pMDC83質(zhì)粒（或pBI101質(zhì)粒），2μg、20μL；

HindIII，1U/L 、2μL；

EcoRI，1U/L 、2μL；

ddH₂O，30 μL；

T4 DNA連接酶連接時(shí)的連接體系設(shè)計(jì)如下：

10×T4 DNA 連接緩沖液，1μL；

GUS基因片段，7μL；

pMDC83載體，1μL；

T4 DNA 連接酶，1μL。

第二，PCR擴(kuò)增獲得TaWG04啟動(dòng)子序列產(chǎn)物，具體步驟如下：

首先，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得TaWG04啟動(dòng)子序列；

引物序列設(shè)計(jì)如下（引物由上海生工合成提供）：

pWG04-F：ACGCGTCGACACACAAGCTGCCTTTCCATAA；

pWG04-R：CCGCGGATCCTGAATTTGTGGTTACTCTTGAT；

10μL的PCR擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)如下：

5×phusion Buffer，2 μL；

dNTPmix，10mM、1.6 μL；

pGW04F，10μM、0.5 μL；

pGW04R，10μM、0.5 μL；

Phusion HS Ⅱ，2U/μL、0.2 μL；

TaWG04啟動(dòng)子DNA，10ng/μL、0.5 μL；

ddH₂O，4.7 μL；

PCR反應(yīng)（BIO-RAD S1000 Thermal Cycler PCR儀）程序：98℃，30sec；98℃、10sec，55℃、20sec，72℃、40sec，循環(huán)32次；72℃，10min；

對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色。結(jié)果表明，所擴(kuò)增目標(biāo)條帶長(zhǎng)度為1557bp。進(jìn)一步地，對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行切膠回收備用（采用上海生工質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行操作）。

第三，將所獲得TaWG04啟動(dòng)子序列產(chǎn)物連接到上述pMDC83-GUS重組載體上，具體步驟如下：

采用SalI和BamHI酶分別對(duì)所回收的TaWG04啟動(dòng)子擴(kuò)增序列（第二步所制備）和pMDC83-GUS重組載體（第一步所制備）進(jìn)行雙酶切；回收酶切產(chǎn)物后，利用T4 DNA連接酶將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，即，將TaWG04啟動(dòng)子連接到pMDC83-GUS重組載體上，最終構(gòu)建、篩選獲得含有TaWG04啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，命名為pMDC83-pTaWG04-GUS。

酶切時(shí)的雙酶切體系設(shè)計(jì)為：

10×Fast Digest buffer，6μL；

pMDC83-GUS重組載體（或TaWG04啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物），20μL；

SalI，1U/L 、2μL；

BamHI，1U/L 、2μL；

ddH₂O，30 μL；

T4 DNA連接酶連接時(shí)的連接體系設(shè)計(jì)如下：

10×T4 DNA 連接緩沖液，1μL；

TaWG04啟動(dòng)子片段，7μL；

pMDC83-GUS載體，1μL；

T4 DNA 連接酶，1μL。

按現(xiàn)有常規(guī)操作，將含有TaWG04啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pMDC83-pTaWG04-GUS轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，并利用Kan(卡那霉素，濃度為0.1mg/mL)進(jìn)行抗性篩選，對(duì)陽(yáng)性菌株即可進(jìn)行大量質(zhì)粒提取操作。

利用本申請(qǐng)所提供的大量提取細(xì)菌質(zhì)粒的方法進(jìn)行質(zhì)粒提取時(shí)，具體包括如下步驟：

（1）篩選獲得含有質(zhì)粒的原核細(xì)胞，具體為：

首先，在上述轉(zhuǎn)化后、抗性篩選所獲得菌落中，挑取陽(yáng)性單菌落接種于2mL LB培養(yǎng)液中（培養(yǎng)液中含有Kan，濃度為0.1mg/mL），37℃培養(yǎng)3~4h后，于50mL的離心管中擴(kuò)大培養(yǎng)4~6h；

其次，吸取上述擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液50μL（或按4倍稀釋成200μL）涂布于新的LB培養(yǎng)平板上（平板直徑15cm，LB培養(yǎng)平板中含有Kan，濃度為0.1mg/mL），37℃過(guò)夜培養(yǎng)（12~16h）；

最后，在上述長(zhǎng)滿菌落（過(guò)夜培養(yǎng)后，平板培養(yǎng)基中菌落基本可長(zhǎng)滿至整個(gè)平板）的培養(yǎng)基平板中加入4mL滅菌水，然后放入滅菌的玻璃珠輕輕搖晃（如圖1所示），利用玻璃珠懸起菌落。待培養(yǎng)基中無(wú)菌落殘留時(shí)，用移液槍（規(guī)格1000μL）將菌液（即含有菌落的無(wú)菌水）吸出，分別置于4個(gè)2mL的離心管中，12000 g離心5 min，棄去上清，保留沉淀，即為含有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞。

（2）裂解細(xì)胞，具體為：

在步驟（1）中離心后沉淀中（每個(gè)離心管中）加入600μL溶液I，在震蕩器上劇烈震蕩重懸菌體，靜置5min；

然后加入600μL溶液II ，輕輕顛倒數(shù)次，徹底混勻（混勻過(guò)程中應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)壁與溶液II 充分接觸）；混勻后（至溶液變清亮為止），冰上放置5min；

最后加入600μL溶液III，輕輕顛倒數(shù)次，混勻過(guò)程中看到絮狀物時(shí)輕彈離心管使之均勻，同時(shí)，混勻過(guò)程中注意使溶液III在粘稠的細(xì)胞裂解物中分散均勻，混合均勻后冰上放置5min。

（3）提取質(zhì)粒，具體為：

將步驟（2）中冰上放置后溶液4℃、12000 g離心10 min，棄沉淀，取上清液置于新的2mL離心管中；

加入等體積量的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，放置20min；所述氯仿-異戊醇混合液中，以體積比計(jì)，氯仿：異戊醇=24：1；

將放置后混合液4℃、12000 g離心10min，取上清液置于新的2mL離心管中（預(yù)先加入有2倍體積的-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇），顛倒混勻，然后4℃、12000 g離心10min，棄上清；

用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇漂洗沉淀兩次后，即為所提取的質(zhì)粒；

所提取的質(zhì)粒在干燥后，可溶于1mL的 TE緩沖液中，取1μL作為樣品，其余-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)本發(fā)明提取的質(zhì)粒進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并EB染色，觀察質(zhì)粒片段大小及質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示，圖2中7-13泳道為隨機(jī)所挑取的7個(gè)陽(yáng)性單克隆pMDC83-pTaWG04-GUS的電泳圖。

按照常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN）說(shuō)明書(shū)，即，按照現(xiàn)有技術(shù)，對(duì)含有重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，以此作為對(duì)照對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)效果進(jìn)行展示，提取時(shí)具體包括如下步驟：

（1）把含有重組載體pMDC83-pTaWG04-GUS的菌液取500μl加到250mL LB中，37℃過(guò)夜搖菌，然后用250mL離心瓶4000rpm離心15min收集菌體；

（2）去除上清后，加入4mL P1重懸，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中；

（3）加入4mL P2，上下顛倒至混合物完全變藍(lán)，室溫放置5min；

（4）加入4mL P3上下顛倒至混合物完全變成白色，置于冰上放置15min，20000g、4℃離心30min，吸取上清到新的50mL離心管中，20000g、4℃離心15min；

（5）離心時(shí)吸取4mL QBT加到QIAGEN-Tip100柱子中使其自然流下，將離心結(jié)束后50mL離心管中的上清轉(zhuǎn)移到QIAGEN-Tip100柱子中，使其自然流下；

（6）待液體流盡，用10mL QC漂洗QIAGEN-Tip100柱子兩次，最后用5mL的QF將質(zhì)粒洗脫；

（7）在洗脫的質(zhì)粒溶液中加入3.5mL異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA，17000g、4℃離心5min收集質(zhì)粒，將收集的質(zhì)粒晾干，加入適合體積的ddH₂O溶解質(zhì)粒。

對(duì)常規(guī)試劑盒提取的質(zhì)粒進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并EB染色，觀察質(zhì)粒片段大小及質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示，圖2中1-6泳道為隨機(jī)挑取的6個(gè)陽(yáng)性單克隆的電泳圖。

對(duì)比兩種質(zhì)粒提取的效果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的提取方法在質(zhì)粒提取效果上跟常規(guī)商品化的質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN）基本一致。具體而言：

在6個(gè)常規(guī)質(zhì)粒試劑盒的提取結(jié)果和7個(gè)本發(fā)明的質(zhì)粒提取結(jié)果的對(duì)比中可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明在提取效果上更穩(wěn)定，如泳道7、10、11、12、13的條帶亮度基本一致，而常規(guī)商品化的質(zhì)粒提取試劑盒只有泳道2、4的條帶亮度和本發(fā)明的一致。推測(cè)這種結(jié)果可能是由于商品化提取操作過(guò)程過(guò)于繁瑣所造成的，或者說(shuō)，這種商品化的質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技能的要求更加嚴(yán)格。

而基于上述對(duì)比結(jié)果，可以看出，本發(fā)明不需大量搖菌培養(yǎng)，操作較為方便，操作成本較為低廉；同時(shí)由于不需要大型的高速低溫離心機(jī)的使用，且能夠較為快速的大量提取質(zhì)粒，因而對(duì)于縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率具有較好地應(yīng)用價(jià)值。

檢驗(yàn)例

對(duì)于上述所提取重組后的pMDC83-pTaWG04-GUS質(zhì)粒（本發(fā)明方法中所提?。l(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了PCR檢測(cè)和雙酶切檢測(cè)，以檢驗(yàn)所提取質(zhì)粒是否正確。具體檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)要介紹如下。

檢測(cè)

對(duì)所提取的含有TaWG04的pMDC83重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)驗(yàn)證時(shí)，所用PCR擴(kuò)增引物同前述引物序列（pGW04F、pGW04R），10μL的PCR擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)如下：

10×Buffer，1 μL；

dNTPmix，10mM、0.8 μL；

pGW04F，10μM、0.4μL；

pGW04R，10μM、0.4 μL；

rTaq DNA聚合酶，0.5U/μL、0.1 μL；

pMDC83-pTaWG04-GUS重組質(zhì)粒，10ng/μL、0.5 μL；

ddH₂O，6.8 μL；

PCR反應(yīng)程序：94℃，5min；94℃、1min，55℃、1min，72℃、1min，循環(huán)30次；72℃，5min。

對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，擴(kuò)增出目標(biāo)條帶大小約為1500bp，與預(yù)期的TaWG04啟動(dòng)子長(zhǎng)度相同，表明所提取質(zhì)粒中成功整合含有TaWG04啟動(dòng)子序列。

雙酶切檢測(cè)

對(duì)所提取質(zhì)粒樣品采用SalI和BamHI進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，20μL酶切體系設(shè)計(jì)如下：

10 ×FastDigest buffer，2 μL；

SalI，1U/L、1 μL；

BamHI，1U/L、1 μL；

質(zhì)粒DNA，1 μg；

ddH₂O，加至20μL；

37℃酶切30min。

酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，觀察酶切片段大小。

按照小提質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，即，按照現(xiàn)有技術(shù)，提取少量質(zhì)粒，對(duì)所提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，以此作為對(duì)照，以對(duì)本申請(qǐng)中所提取質(zhì)粒的酶切效果進(jìn)行展示。提取質(zhì)粒過(guò)程具體如下：

（1）吸取2mL經(jīng)過(guò)37℃充分震蕩培養(yǎng)16h的菌液pMDC83-pTaWG04-GUS，8000g離心2min，倒掉液體；

（2）向菌體中加入250μL Buffer P1，使菌體混勻懸?。?/p>

（3）吸取Buffer P2 250μL加入到離心管中，輕輕晃動(dòng)離心管混勻，然后放置10min；

（4）吸取Buffer P3 350μL ，輕輕晃動(dòng)離心管，放置10min，12000g離心8min；

（5）取吸附柱將上清全部移入，8000g離心2min，倒出廢液；

（6）吸取Wash Solution 500μL加入到吸附柱中，8000g離心2min，倒出廢液，并重復(fù)步驟一次；

（7）將空吸附柱和收集管放入小型離心機(jī)中，9000g離心1min；

（8）在吸附膜中央加入30μL Elution Buffer，室溫靜置5min，9000g離心1min，此時(shí)離心管底部的溶液就是提取的質(zhì)粒。

參考上述酶切體系對(duì)采用現(xiàn)有方法所提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并進(jìn)行電泳檢測(cè)。圖4中，泳道M為Marker，泳道1為采用現(xiàn)有小量質(zhì)粒提取試劑盒所提取質(zhì)粒的酶切結(jié)果，泳道2為本方法所提取的質(zhì)粒酶切結(jié)果。從圖中可以看出，本發(fā)明所提取質(zhì)粒的條帶相對(duì)更為明亮，即，酶切效果更佳。

從上述本發(fā)明與現(xiàn)有大、小提商品化提取質(zhì)粒試劑盒的效果對(duì)比可以看出，本發(fā)明所提取質(zhì)粒條帶更為明亮、質(zhì)粒含量多、提取效果較好，加上其不需大量搖菌培養(yǎng)、操作方便、成本較為低廉、對(duì)儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單，如不需大型的高速低溫離心機(jī)的使用、且能夠較為快速的大量提取質(zhì)粒，因而對(duì)于縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率具有較好地應(yīng)用價(jià)值。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所

<120> 一種大量提取細(xì)菌質(zhì)粒的方法

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1571

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

tagatcccct gttgtaattt atcaaaaatt tatacacaag ctgcctttcc ataatttgaa 60

acattgtact ttctacttgc ctgcaggaag aactcttttg ttatggaccc ccttatctgg 120

cgaatagtcg ccaggagggg gtggcatttg cgaatgattc gctggcagtt ttagtttgag 180

ggatggaagt ttacatcagg gcgacatgac aatttctttt tgagaaggca aattgttgtt 240

ttaaataggc atcgtttgat cttgtctcgg aaccgaaact gccatcgaaa gagtttcgtt 300

tgccacctct ctcccagcaa acgattgcca attatgatta ccgtttgtta tatgcatgaa 360

ctgtgcgtct acagttggcg gcagcgaggt tgaggagacc ggtgtcatcg gcagcggctt 420

cagccggtgg aggcgtccta tggttgacgg ccgtgctcct tcctgctcga gaagagaagt 480

gagagggtgg tgagaggtga agagagcagg aggcggcagc ctggtgctgc tgcgggtcgt 540

agtaggagcc aaggcggcgg tgctgggtgg ctcgggctgt tatgcgggcg cgcgagcgac 600

accaagccct caacaaccgt gtccgtttca gttgggtctt ccatgttggg tacactggtg 660

gtgtccggct ctccgtctgc gtccattgtc cgttttggcg acccaaacgg acaaaaagcg 720

gacaaaaatt cgtgtccgtt tgagtcattg cgttgaagtt ggccttatgc tattccacag 780

tatactcaac gcactctaat tcacattgca tgctattaca tgcgtcattg tatttgatac 840

accgtgtgca atattttttt tctggtgaca atatatctac tatcgaacca agtataaagt 900

tcctcaaagg gtttaatatc atgttcatgg tgttcccgcg gaaatgcatg ggaatcatct 960

agtgtctatt aacaactata cgacattact aacattggca taaaaaaaag aattgatgag 1020

tcatgtatgc ttgttcatct taccatcata ttacacaaaa ctacgaagtt agttcagaaa 1080

gaaatagtct agaacaatct tcatattaat agtatgatct atcttaacaa cgccaagcaa 1140

gactataaac ttagttcccg acaagctatg ccaacctaga tgtgcctaac aacttgcaga 1200

acattacaaa cttagtttta gaaaggggtg taatatagat aagtgtttcg catgtaaaat 1260

gaatatgatg agtcattacg attatcaagc tttcctggca ctccatggat gtgtgctgca 1320

agaaagcaac tttggcgatc aatctgaaaa ttacacttgt aagtagcgcc accgaacaaa 1380

acataccaaa ggatcagttt gataagagta gaggaacttt acaagaaagc aaatgtgaag 1440

acgaaaagaa atcatttcat ggcagctata aatagccata cgccatgaag acccccttcc 1500

atcatccatc cttcagaaat ttggagcaca agcatccata ataaacaatc aagagtaacc 1560

acaaattcac c 1571