本發(fā)明涉及一種豬骨活性肽的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬骨中，骨蛋白這一優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)源的利用一直很落后，并且對骨中的蛋白及其它營養(yǎng)成分沒有充分開發(fā)利用。目前，由于動物骨頭價格低廉，不易儲存，所以往往被加工成附加值比較低的產(chǎn)品或被制成飼料，導(dǎo)致骨的利用率大大降低。這樣不僅會造成極大的浪費，還會因骨頭極易腐敗變質(zhì)而導(dǎo)致一定的環(huán)境污染。
骨綜合利用的形式主要有兩種，一種是全骨利用，也就是整個骨頭的利用，該方法能夠比較全面的利用骨中的營養(yǎng)成分，其主要產(chǎn)品是骨粉、骨泥等，可以作為食品添加劑或者是肉類食品的替代物；另一種是骨提取物的利用，該方法是提取骨中的各類營養(yǎng)物質(zhì)并加以利用，其主要產(chǎn)品是骨油、骨膠、骨素等。
在豬骨蛋白質(zhì)的長鏈中，存在著比蛋白質(zhì)和氨基酸抗氧化性更強的抗氧化肽。蛋白酶的水解產(chǎn)物中存在多種抗氧化肽，它們具有較強抑制生物大分子過氧化和清除體內(nèi)自由基的功效?？寡趸囊云浞肿恿啃 ⒁孜?、活性強等特點受到重視，并在醫(yī)藥、化妝品、保健品和食品及飼料添加劑等方面具有廣闊的前景。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種豬骨活性肽的制備方法。
所述方法主要包括以下步驟：
(1)將新鮮豬骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用60℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分數(shù)為1％的檸檬酸溶液中浸泡5～6h；豬骨與檸檬酸溶液的用量比例為1kg：(2～3)L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入到質(zhì)量分數(shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6～8h得到酶解底物；豬骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：(2～4)L；
(3)按質(zhì)量比1％加入酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解2～3h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分數(shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到豬骨多肽粉。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述酸性蛋白酶是20萬U/g的酶制劑。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法主要包括以下步驟：
(1)將新鮮豬骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用60℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分數(shù)為1％的檸檬酸溶液中浸泡5h；豬骨與檸檬酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入到質(zhì)量分數(shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；豬骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在50℃條件下酶解2h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分數(shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到豬骨多肽粉。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法主要包括以下步驟：
(1)將新鮮豬骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用60℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分數(shù)為1％的檸檬酸溶液中浸泡5h；豬骨與檸檬酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分數(shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；豬骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解3h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分數(shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到豬骨多肽粉。
本發(fā)明通過檸檬酸溶液浸泡、維生素C溶液的浸泡對豬骨進行前處理，并酶進行酶解，顯著提高了豬骨蛋白的水解度以及抗氧化的能力。水解液水解度為50％左右，對羥自由基清除率達到39％，凝膠色譜測定水解液中多肽的分子量在5kD以內(nèi)的占85％以上。
具體實施方式
豬骨總蛋白質(zhì)的測定采用微量擴散法：取酶解底物5ml，加入1g消化催化劑和10ml濃硫酸，在高溫下消化至黃綠色后，取出冷卻至室溫，加水定容。然后取5ml加入到擴散皿的外室，并在擴散皿的內(nèi)室加入2ml的硼酸溶液，向外室中加入4ml濃NaOH溶液，并迅速蓋上蓋片。在自然環(huán)境下放置24h左右后，用標準的鹽酸溶液滴定硼酸溶液至紫羅蘭色即可?？偟鞍踪|(zhì)(％)＝(V2-V1)×N×稀釋倍數(shù)×0.014×6.25÷樣品重量×100％。V1為空白所需鹽溶液體積(ml)，V2為滴定待測液耗用標準酸體積(ml)，N為標準酸當(dāng)量濃度，稀釋倍數(shù)＝制備液體積(容量瓶ml)吸取體積(ml)，0.014為1ml當(dāng)量氮的克數(shù)。
水解度DH采用TCA可溶性氮測定：10ml步驟(5)水解液中加入10ml 20％的TCA溶液，混合振蕩，在4000r/min離心15min。取上清液，豬骨總氮含量與TCA可溶性氮采用微量擴散法。DH(％)＝(N3-N1)÷(N2-N1)×100％。N1為發(fā)酵底物TCA可溶性氮含量，N2為發(fā)酵底物總氮含量，N3為步驟(5)水解液TCA可溶性氮含量。
清除羥自由基能力的測定：取0.75mmol/L鄰二氮菲1mL裝于試管中，依次加入PBS(0.02mol/L pH 7.4)2mL，蒸餾水1mL，完全混勻后，加入0.75mmol/L的硫酸亞鐵1mL，質(zhì)量分數(shù)為0.12％的過氧化氫1mL，于37℃水浴反應(yīng)90min，于536nm處測其吸光度，為Ap；用1mL蒸餾水代替1mL過氧化氫，為Ab；用步驟(5)水解液取代1mL蒸餾水，為As。羥自由基清除率按樣品對羥自由基清除率＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100％計算。
除非特別說明，下述實施例涉及的實驗方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法。
實施例1
(1)將新鮮豬骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用60℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分數(shù)為1％的檸檬酸溶液中浸泡5h；豬骨與檸檬酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分數(shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；豬骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在50℃條件下酶解2h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分數(shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到豬骨多肽粉。
測得步驟(5)水解液水解度為49％，對羥自由基清除率為39％，凝膠色譜測定步驟(5)水解液中多肽的分子量在5kD以內(nèi)的占85％以上。
實施例2
(1)將新鮮豬骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用60℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分數(shù)為1％的檸檬酸溶液中浸泡5h；豬骨與檸檬酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分數(shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；豬骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解3h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分數(shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到豬骨多肽粉。
測得步驟(5)水解液水解度為52％，對羥自由基清除率為36％。
對照例1
(1)將新鮮豬骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用60℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分數(shù)為1％的檸檬酸溶液中浸泡5h；豬骨與檸檬酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，以水浸泡6h，得到酶解底物；豬骨與水的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解2～3h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分數(shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到豬骨多肽粉。
測得步驟(5)水解液水解度為24％，對羥自由基清除率為23％。
對照例2
(1)將新鮮豬骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用60℃的熱水沖洗去油脂；
(2)瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分數(shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；豬骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解2～3h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分數(shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到豬骨多肽粉。
測得步驟(5)水解液水解度為21，對羥自由基清除率為26％。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。