本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域中的葡萄糖脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，增施磷肥是一種“高投入，低產(chǎn)出”的途徑。我國(guó)每年大約消耗2100萬(wàn)～2200萬(wàn)噸磷肥，但是磷肥當(dāng)季作物利用率僅為5％-25％，90％左右的磷肥施入土壤后很快被化學(xué)固定，形成溶解性極低的磷酸鈣、鐵、鋁等化合物。磷是不可再生資源，隨著磷礦儲(chǔ)備的不斷消耗，我國(guó)可能面臨磷礦短缺而嚴(yán)重制約糧食生產(chǎn)。其實(shí)土壤中本不缺磷,但是它在土壤中的有效性非常低,多為難溶性的無(wú)機(jī)磷，植物很難吸收利用。因此，活化土壤中無(wú)效磷素，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)急需解決的問(wèn)題之一。

葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase，GDH)屬于短鏈乙醇脫氫酶家族的一員，在輔酶存在下，能夠催化D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，而生成的D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯會(huì)進(jìn)一步自發(fā)地水解成葡萄糖酸。研發(fā)具有高活性的葡萄糖脫氫酶進(jìn)而構(gòu)建葡萄糖脫氫酶溶磷工程菌，可以顯著提高溶磷細(xì)菌分解土壤無(wú)機(jī)磷的能力，在活化土壤無(wú)效磷素、提高磷肥利用率、減少磷肥投入方面具有重大價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有較高酶活性的葡萄糖脫氫酶。

本發(fā)明所提供的葡萄糖脫氫酶，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)：

a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

b)由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

c)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白；

d)將SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。

上述葡萄糖脫氫酶中，a)所示的蛋白質(zhì)的名稱(chēng)為CrGDH3A；SEQ ID No.2由796個(gè)氨基酸殘基組成。

上述葡萄糖脫氫酶中，b)所示的蛋白質(zhì)的名稱(chēng)為CrGDH3A-His，SEQ ID No.2所示的CrGDH3A的N端連接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白，SEQ ID No.6由817個(gè)氨基酸殘基組成。

上述葡萄糖脫氫酶中，蛋白標(biāo)簽是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和/或純化等。

編碼上述葡萄糖脫氫酶的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述核酸分子具體可為如下1)或2)或3)所示的葡萄糖脫氫酶的編碼基因：

1)編碼序列(CDS)是SEQ ID No.1所示的DNA分子，其名稱(chēng)為CrGDH3A基因；

2)編碼序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子，其名稱(chēng)為CrGDH3A-His基因；

3)與1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且編碼所述葡萄糖脫氫酶的DNA分子。

所述核酸分子中，“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴笨梢杂萌庋刍蛴?jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

下述A1)、A2)或A3)的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

A1)上述蛋白質(zhì)在作為葡萄糖脫氫酶中的應(yīng)用，

A2)上述核酸分子在制備葡萄糖脫氫酶中的應(yīng)用，

A3)上述核酸分子在構(gòu)建具有溶磷活性微生物中的應(yīng)用。

本申請(qǐng)中，所述溶磷活性是指將無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷的能力。其中，可溶性磷指能溶解到水中或溶解到弱酸中后可被植物吸收利用的磷?？扇苄粤装ㄋ苄粤缀?或可交換性磷。所述無(wú)機(jī)磷可為難溶的磷酸鹽(如磷酸三鈣或磷酸鋁)或磷礦粉。

本發(fā)明還提供了制備上述葡萄糖脫氫酶的方法。

本發(fā)明所提供的制備上述葡萄糖脫氫酶的方法，包括使上述葡萄糖脫氫酶的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)得到上述葡萄糖脫氫酶的步驟；所述生物可為微生物、植物或非人動(dòng)物。

上述方法中，所述使上述葡萄糖脫氫酶的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)包括將上述葡萄糖脫氫酶的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)上述葡萄糖脫氫酶的重組微生物，培養(yǎng)所述重組微生物，表達(dá)得到上述葡萄糖脫氫酶。

上述方法中，所述受體微生物可為原核微生物。

上述方法中，所述原核微生物具體可為革蘭氏陰性細(xì)菌或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

上述方法中，所述革蘭氏陰性細(xì)菌具體可為埃希氏菌屬細(xì)菌。所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具體可為芽孢桿菌屬細(xì)菌。

上述方法中，所述埃希氏菌屬細(xì)菌具體可為大腸桿菌。所述芽孢桿菌屬細(xì)菌可為巨大芽孢桿菌。

上述方法中，上述葡萄糖脫氫酶的編碼基因可通過(guò)重組表達(dá)載體pET–CrGDH3A導(dǎo)入所述受體微生物；所述pET–CrGDH3A是用SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因替換pET-28a(+)的NdeI和Bam HI識(shí)別位點(diǎn)間的片段得到的重組表達(dá)載體。pET–CrGDH3A含有SEQ ID No.5所示的His標(biāo)簽融合蛋白CrGDH3A-His編碼基因，CrGDH3A-His編碼基因編碼的蛋白質(zhì)CrGDH3A-His的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。CrGDH3A-His是SEQ ID No.2所示的CrGDH3A的N端連接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白。

上述方法中，上述葡萄糖脫氫酶的編碼基因還可通過(guò)重組表達(dá)載體pWH–CrGDH3A導(dǎo)入所述受體微生物；所述pWH–CrGDH3A是用SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因正向替換pWH1520的2個(gè)BamHI識(shí)別位點(diǎn)間的片段得到的重組表達(dá)載體。pWH–CrGDH3A含有序列表中SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因，pWH–CrGDH3A表達(dá)是SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)CrGDH3A。

實(shí)驗(yàn)證明，在模式細(xì)菌原核表達(dá)中(大腸桿菌為受體菌)，葡萄糖脫氫酶CrGDH3A和CrGDH3A-His均具有較高的葡萄糖脫氫酶活性，葡萄糖脫氫酶CrGDH3A-His在25℃pH7.8的條件下其葡萄糖脫氫酶的酶活力為39.47±1.03U/mg蛋白；在溶磷工程菌中(巨大芽孢桿菌WH320為受體菌)，葡萄糖脫氫酶CrGDH3A在40℃，pH7.4的條件下的葡萄糖脫氫酶的酶活力為36.53±1.16U/mg。本發(fā)明為應(yīng)用基因工程手段培育磷高效農(nóng)作物新品種以及高效活化土壤磷素養(yǎng)分的生物工程菌提供重要基因資源，有助于推動(dòng)溶磷工程菌從實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段向田間應(yīng)用階段邁進(jìn)。

附圖說(shuō)明

圖1為pET–CrGDH3A和pET–CrGDH3B的物理圖譜。其中，gdh3為CrGDH3A基因或CrGDH3B基因。

圖2為在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)葡萄糖脫氫酶的SDS-PAGE圖譜。其中，1：蛋白Marker；2：大腸桿菌BL21(DE3)；3：pET–CrGDH3A/BL21；4：pET-30a(+)/BL21；5：pET-CrGDH3B/BL21。箭頭示目的條帶。

圖3為pWH-CrGDH3A的物理圖譜。其中，gdh3gene為CrGDH3A基因。

圖4為在葡萄糖脫氫酶工程菌中表達(dá)葡萄糖脫氫酶的SDS-PAGE圖譜。其中，M：蛋白Marker；1：胞內(nèi)沉淀；2：胞內(nèi)上清；3：胞外上清。

圖5為pH對(duì)葡萄糖脫氫酶工程菌中表達(dá)的葡萄糖脫氫酶的酶活性影響。

圖6為溫度對(duì)葡萄糖脫氫酶工程菌中表達(dá)的葡萄糖脫氫酶的酶活性影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、葡萄糖脫氫酶CrGDH3的制備及功能驗(yàn)證

一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建

為了提高葡萄糖脫氫酶的活性，將Genbank Accession Number WP_012904518所示的來(lái)源于檸檬酸桿菌Citrobacter rodentium萄糖脫氫酶(以下稱(chēng)為CrGDH3B，簡(jiǎn)稱(chēng)3B)進(jìn)行氨基酸殘基的替換得到葡萄糖脫氫酶CrGDH3A(簡(jiǎn)稱(chēng)3A)。CrGDH3A的氨基酸序列為SEQ ID No.2，CrGDH3B的氨基酸序列為SEQ ID No.4，CrGDH3A和CrGDH3B的差異氨基酸殘基如表1和表2。

表1、CrGDH3A和CrGDH3B的差異氨基酸殘基

表2、CrGDH3A和CrGDH3B的差異氨基酸殘基

分別制備SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因和SEQ ID No.3所示的CrGDH3B基因。

用SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因替換pET-28a(+)(EMD Biosciences，購(gòu)置于北京新經(jīng)科公司，大小為5369bp)的NdeI和Bam HI識(shí)別位點(diǎn)間的片段，保持pET-28a(+)其他序列不變，得到重組表達(dá)載體，將其命名為pET–CrGDH3A(圖1)。pET–CrGDH3A含有SEQ ID No.5所示的His標(biāo)簽融合蛋白CrGDH3A-His編碼基因，CrGDH3A-His編碼基因編碼的蛋白質(zhì)CrGDH3A-His的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。CrGDH3A-His是SEQ ID No.2所示的CrGDH3A的N端連接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白。

用SEQ ID No.3所示的CrGDH3B基因替換pET-28a(+)(EMD Biosciences，購(gòu)置于北京新經(jīng)科公司，大小為5369bp)的NdeI和Bam HI識(shí)別位點(diǎn)間的片段，保持pET-28a(+)其他序列不變，得到重組表達(dá)載體，將其命名為pET–CrGDH3B(圖1)。pET–CrGDH3B含有SEQ ID No.7所示的His標(biāo)簽融合蛋白CrGDH3B-His編碼基因，CrGDH3B-His編碼基因編碼的蛋白質(zhì)CrGDH3B-His的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。CrGDH3B-His是SEQ ID No.4所示的CrGDH3B的N端連接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的融合蛋白。

二、表達(dá)葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌的制備

1、CrGDH3A-His的表達(dá)

將步驟一的pET–CrGDH3A用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(天根公司)，利用卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆篩選培養(yǎng)，挑取單克隆，以P1(5′-ATGGCTATTAACAATACAGGCTC-3′)和P2(5′-TTATTTCACATCATCCGGCAGCG-3′)為引物進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定得到2391bp PCR產(chǎn)物的陽(yáng)性克隆作為基因工程菌，命名為pET–CrGDH3A/BL21。挑取pET–CrGDH3A/BL21菌株，接種于含100ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基(在LB培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為100μg/ml得到的培養(yǎng)基)中，37℃培養(yǎng)至0D₆₀₀值(以含100μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度lmM，在150r/min的轉(zhuǎn)速下28℃誘導(dǎo)6h，收集培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min離心20min后，用50mM Tris-HCl(pH7.1)重懸菌體得到菌體含量為10⁸cfu/ml的菌體懸浮液，菌體懸浮液經(jīng)超聲破碎30min(50％功率，工作10s，間歇20s)，在破碎細(xì)胞懸濁液中加入Triton-X100至終濃度為1％，在4℃浸提過(guò)夜，12 000r/min離心10min，收集上清液(含菌體總蛋白質(zhì))，將該上清液命名為CrGDH3A-His粗酶液。

2、CrGDH3B-His的表達(dá)

將步驟二的pET–CrGDH3B用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(天根公司)，利用卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆篩選培養(yǎng)，挑取單克隆，以P3(5′-ATGGCTGAAAACAATGCACG-3′)和P4(5′-TTACTTCTCGTCGTCCGGCA-3′)為引物進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定得到2391bp PCR產(chǎn)物的陽(yáng)性克隆作為基因工程菌，命名為pET–CrGDH3B/BL21。挑取pET–CrGDH3B/BL21菌株，接種于含100μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基(在LB培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為100μg/ml得到的培養(yǎng)基)中，37℃培養(yǎng)至0D₆₀₀值(以含100μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度lmM，在150r/min的轉(zhuǎn)速下28℃誘導(dǎo)6h，收集培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min離心20min后，用50mM Tris-HCl(pH7.1)重懸菌體得到菌體含量為10⁸cfu/ml的菌體懸浮液，菌體懸浮液經(jīng)超聲破碎30min(50％功率，工作10s，間歇20s)，在破碎細(xì)胞懸濁液中加入Triton-X100至終濃度為1％，在4℃浸提過(guò)夜，12 000r/min離心10min，收集上清液(含菌體總蛋白質(zhì))，將該上清液命名為CrGDH3B-His粗酶液。

3、空載體對(duì)照菌

按照與步驟1相同的方法將pET-28a(+)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，將得到的重組大腸桿菌名為pET-28a(+)/BL21。將pET-28a(+)/BL21作為空載體對(duì)照菌按照上述步驟1的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)制備菌體總蛋白。挑取pET-28a(+)/BL21菌株，接種于含100μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基(在LB培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為100μg/ml得到的培養(yǎng)基)中，37℃培養(yǎng)至0D₆₀₀值(以含100μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度lmM，在150r/min的轉(zhuǎn)速下28℃誘導(dǎo)6h，收集培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min離心20min后，用50mM Tris-HCl(pH7.1)重懸菌體得到菌體含量為10⁸cfu/ml的菌體懸浮液，菌體懸浮液經(jīng)超聲破碎30min(50％功率，工作10s，間歇20s)，在破碎細(xì)胞懸濁液中加入Triton-X100至終濃度為1％，在4℃浸提過(guò)夜，12 000r/min離心10min，收集上清液(含菌體總蛋白質(zhì))，將該上清液命名為空載體對(duì)照菌粗酶液。

4、空白對(duì)照菌大腸桿菌BL21(DE3)

將大腸桿菌BL21(DE3)作為空白對(duì)照菌按照上述步驟1的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)制備菌體總蛋白。挑取大腸桿菌BL21(DE3)菌株，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至0D₆₀₀值(以LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度lmM，在150r/min的轉(zhuǎn)速下28℃誘導(dǎo)6h，收集培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min離心20min后，用50mM Tris-HCl(pH7.1)重懸菌體得到菌體含量為10⁸cfu/ml的菌體懸浮液，菌體懸浮液經(jīng)超聲破碎30min(50％功率，工作10s，間歇20s)，在破碎細(xì)胞懸濁液中加入Triton-X100至終濃度為1％，在4℃浸提過(guò)夜，12 000r/min離心10min，收集上清液(含菌體總蛋白質(zhì))，將該上清液命名為空白對(duì)照菌粗酶液。

取30μL CrGDH3A-His粗酶液(來(lái)自10⁸cfu/ml pET–CrGDH3A/BL21)、30μL CrGDH3B-His粗酶液(來(lái)自10⁸cfu/ml pET–CrGDH3B/BL21)、30μL空載體對(duì)照菌粗酶液(來(lái)自10⁸cfu/ml pET-28a(+)/BL21)和30μL空白對(duì)照菌粗酶液(來(lái)自10⁸cfu/ml大腸桿菌BL21(DE3))在同一塊膠上進(jìn)行SDS-PAGE分析(分離膠濃度為12％)，該膠上的加樣孔體積和形狀均一致，加樣孔體積為80μL。

SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示，表明雖然CrGDH3A-His粗酶液、CrGDH3B-His粗酶液、空載體對(duì)照菌粗酶液和空白對(duì)照菌粗酶液中均有87kD的條帶，但CrGDH3A-His粗酶液和CrGDH3B-His粗酶液中87kD多肽的含量明顯高于空載體對(duì)照菌粗酶液和空白對(duì)照菌粗酶液中87kD多肽的含量，而且CrGDH3A-His粗酶液中的87kD多肽的含量高于CrGDH3B-His粗酶液中87kD多肽的含量。說(shuō)明CrGDH3A-His和CrGDH3B-His均在大腸桿菌BL21(DE3)中得到了表達(dá)，而且CrGDH3A-His在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)量明顯高于CrGDH3B-His在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)量。

三、測(cè)定CrGDH3A-His和CrGDH3B-His的葡萄糖脫氫酶的催化活性

取步驟二的CrGDH3A-His粗酶液、CrGDH3B-His粗酶液、空載體對(duì)照菌粗酶液和空白對(duì)照菌粗酶液分別用鎳柱(購(gòu)自美國(guó)通用公司的high-affinity Ni-NTA Rasin產(chǎn)品)進(jìn)行純化，將鎳柱預(yù)處理，加入粗酶液，然后加入含咪唑洗脫液(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl，250mM imidazole，pH8.0)4℃作用10min，3000rpm離心1min收集洗脫液，重復(fù)洗脫一次，收集洗脫液，取1ml洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析。CrGDH3A-His的序列測(cè)定結(jié)果表明其N(xiāo)末端的15個(gè)氨基酸為序列表中序列2的第1-15位氨基酸，CrGDH3B-His的序列測(cè)定結(jié)果表明其N(xiāo)末端的15個(gè)氨基酸為序列表中序列4的第1-15位氨基酸。

將上述收集的洗脫液用雙蒸水透析，去鹽離子，分別獲得純的CrGDH3A-His酶液、純的CrGDH3B-His酶液、純的空載體對(duì)照菌酶液和純的空白對(duì)照菌酶液，作為待測(cè)酶液。待測(cè)酶液利用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

葡萄糖脫氫酶活性測(cè)定，以葡萄糖為底物，根據(jù)產(chǎn)生紅色進(jìn)行比色定量分析葡萄糖脫氫酶的活性。向50μL待測(cè)酶液(純的CrGDH3A-His酶液、純的CrGDH3B-His酶液、純的空載體對(duì)照菌酶液或純的空白對(duì)照菌酶液)中加入50μL pH7.8的緩沖液(向100mmol/L MOPS緩沖液中加入PQQ(吡咯喹啉醌)和CaCl₂，使PQQ含量為10μmol/L和CaCl₂含量為2mol/L得到的液體)，37℃預(yù)處理1小時(shí)以穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)，得到預(yù)處理酶液。然后，向比色皿中加入1mL的50mmol/L的pH7.8的Tris-HCl緩沖液，然后再分別加入100μL的20mmol/L吩嗪硫酸甲酯溶液、6.7mmol/L 2,6–二氯靛酚鈉(DCIP)溶液以及1mol/L葡萄糖溶液，混合均勻后加入50μL的預(yù)處理酶液，最后定容至3mL，反應(yīng)溫度為25℃，測(cè)定每分鐘600nm下吸光值的變化。酶活力單位(U)定義為：25℃pH7.8的條件下，在1min內(nèi)能夠使1μ mol的葡萄糖氧化(或1μ mol DCIP還原)的酶量。葡萄糖脫氫酶比活力以每單位總蛋白中酶的活力進(jìn)行計(jì)算，單位為U/mg。

實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。結(jié)果表明純的空載體對(duì)照菌酶液和純的空白對(duì)照菌酶液沒(méi)有葡萄糖脫氫酶活性，由pET–CrGDH3A/BL21表達(dá)的CrGDH3A–His的葡萄糖脫氫酶的酶活力為39.47±1.03U/mg蛋白，由pET–CrGDH3B/BL21表達(dá)的CrGDH3B-His的葡萄糖脫氫酶的酶活力為7.39±0.26U/mg蛋白。CrGDH3A-His的葡萄糖脫氫酶酶活力是CrGDH3B-His葡萄糖脫氫酶酶活力的5.34倍。pET–CrGDH3A/BL21的葡萄糖脫氫酶產(chǎn)量為25.65/10⁸cfu pET–CrGDH3A/BL21，pET–CrGDH3B/BL21的葡萄糖脫氫酶產(chǎn)量為5.09U/10⁸cfu pET–CrGDH3B/BL21。pET–CrGDH3A/BL21的葡萄糖脫氫酶產(chǎn)量是pET–CrGDH3B/BL21的5倍。

實(shí)施例2、具有溶磷活性重組微生物—葡萄糖脫氫酶溶磷工程菌的培育及其功能鑒定

1.葡萄糖脫氫酶CrGDH3A基因穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建

為了獲得高效表達(dá)葡萄糖脫氫酶CrGDH3A基因的溶磷工程菌，首先需要構(gòu)建能夠跨宿主表達(dá)的穿梭表達(dá)載體。pWH1520表達(dá)載體(7929bp)是巨大芽孢桿菌高效的穿梭表達(dá)載體(德國(guó)MoBiTec公司產(chǎn)品，購(gòu)置于北京拜爾迪生物技術(shù)公司)，xylA啟動(dòng)子下游攜帶BamHI酶切位點(diǎn)，具有氨芐和四環(huán)素抗性基因，能夠穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白。

利用DNAMAN軟件分析CrGDH3A基因序列，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有BamHI酶切位點(diǎn)，依據(jù)CrGDH3A基因完整編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，在上下游引物均加入Bam HI酶切位點(diǎn)(GGATCC)。上下游引物分別為：P5：5′-ATGGATCCATGGCTATTAACAATACAGGCTC-3′和P6：5′-GCGGATCCTTATTTCACATCATCCGGCAGCG-3′)。以步驟一的pET–CrGDH3A為模板，利用上述P5和P6作為引物，利用PCR擴(kuò)增的方法，在CrGDH3A基因完整編碼區(qū)的5′端和3′分別引入BamHI酶識(shí)別位點(diǎn)，得到帶有酶識(shí)別位點(diǎn)的CrGDH3A基因PCR產(chǎn)物；用BamHI酶切穿梭表達(dá)載體pWH1520和帶有酶識(shí)別位點(diǎn)的CrGDH3A基因PCR產(chǎn)物，回收的酶切產(chǎn)物用T₄連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序。由于是單酶切后再連接到表達(dá)載體，所以還需采用PCR并結(jié)合測(cè)序比對(duì)的方法篩選CrGDH3A基因正向插入穿梭表達(dá)載體pWH1520的陽(yáng)性菌斑，提取重組質(zhì)粒，最終獲得CrGDH3A基因的穿梭表達(dá)載體。將測(cè)序結(jié)果表明是用SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因正向替換pWH1520的2個(gè)BamHI識(shí)別位點(diǎn)間的片段得到的重組表達(dá)載體命名為pWH–CrGDH3A(圖3)。pWH–CrGDH3A含有序列表中SEQ ID No.1所示的CrGDH3A基因，pWH–CrGDH3A表達(dá)是SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)CrGDH3A。

2.葡萄糖脫氫酶工程菌的獲得及其表達(dá)的CrGDH3A的酶學(xué)特征

采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將重組載體pWH-CrGDH3A轉(zhuǎn)入巨大芽孢桿菌(WH320，購(gòu)置上海北諾生物科技公司)，獲得葡萄糖脫氫酶工程菌。將葡萄糖脫氫酶工程菌接入含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基(在LB培養(yǎng)基中加入四環(huán)素至四環(huán)素的濃度為100μg/ml得到的培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過(guò)夜。以2％的接種量轉(zhuǎn)接到上述含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入木糖到終濃度為0.5％，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，室溫下4000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，收集上清作為胞外上清；收集沉淀，加2倍體積磷酸緩沖液(pH6.0)，破碎細(xì)胞，得破碎細(xì)胞懸濁液。在破碎細(xì)胞懸濁液中加入Triton-X100至終濃度為1％，在4℃浸提過(guò)夜，12000r/min離心10min，上清液為胞內(nèi)上清，沉淀為胞內(nèi)沉淀。分別對(duì)胞內(nèi)上清、胞內(nèi)沉淀和胞外上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析以及酶活力測(cè)定。待測(cè)酶液利用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

按照實(shí)施例1的方法測(cè)定葡萄糖脫氫酶CrGDH3A的活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖4)顯示，CrGDH3A基因可以在葡萄糖脫氫酶工程菌中可以正常表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為胞內(nèi)蛋白(胞內(nèi)上清泳道)，表達(dá)產(chǎn)物分子量約為87kD。葡萄糖脫氫酶工程菌表達(dá)的CrGDH3A的葡萄糖脫氫酶酶活力為33.85±1.53U/mg。

3、pH對(duì)葡萄糖脫氫酶工程菌的催化活性的影響

將步驟2的葡萄糖脫氫酶工程菌接入含氨芐青霉素和四環(huán)素的LB培養(yǎng)基(在LB培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素和四環(huán)素至氨芐青霉素和四環(huán)素的濃度均為100μg/ml得到的培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過(guò)夜。以2％的接種量轉(zhuǎn)接到上述含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入木糖到終濃度為0.5％，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，室溫下4000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，收集沉淀，加2倍體積磷酸緩沖液(pH7.0)，破碎細(xì)胞，得破碎細(xì)胞懸濁液。在破碎細(xì)胞懸濁液中加入Triton-X100至終濃度為1％，在4℃浸提過(guò)夜，12000r/min離心10min，上清液即為葡萄糖脫氫酶粗酶液，作為待測(cè)酶液。

采用10個(gè)pH值不同的反應(yīng)體系：檸檬酸-磷酸緩沖溶液體系(pH5.4反應(yīng)體系、pH5.8反應(yīng)體系、pH6.2反應(yīng)體系、pH6.6反應(yīng)體系和pH7.0反應(yīng)體系)；Tris緩沖溶液體系(pH7.4反應(yīng)體系、pH7.8反應(yīng)體系、pH8.2反應(yīng)體系、pH8.6反應(yīng)體系和pH9.0反應(yīng)體系)測(cè)定葡萄糖脫氫酶工程菌催化葡萄糖脫氫的能力。

上述10個(gè)pH值不同的反應(yīng)體系均由待測(cè)酶液、吩嗪硫酸甲酯、2,6–二氯靛酚鈉(DCIP)、葡萄糖和相應(yīng)的緩沖溶液組成。

向50μL待測(cè)酶液中加入50μL相應(yīng)pH值的緩沖液(向100mmol/L MOPS緩沖液中加入PQQ(吡咯喹啉醌)和CaCl₂，使PQQ含量為10μmol/L和CaCl₂含量為2mol/L得到的液體)，37℃預(yù)處理1小時(shí)以穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)，得到預(yù)處理酶液。

向比色皿中分別加入1mL的50mmol/L的不同pH值緩沖液，然后再分別加入20mmol/L吩嗪硫酸甲酯、6.7mmol/L 2,6–二氯靛酚鈉(DCIP)以及1mol/L葡萄糖各100μL，混合均勻后加入50μL的預(yù)處理酶液，最后定容至3mL，反應(yīng)溫度為25℃，測(cè)定每分鐘600nm下吸光值的變化。酶活力單位(U)定義為：25℃條件下，在1min內(nèi)能夠使1μ mol的葡萄糖氧化(或1μ mol DCIP還原)的酶量。葡萄糖脫氫酶比活力以每單位總蛋白中酶的活力進(jìn)行計(jì)算，單位為U/mg，以最高酶活作為100％，折算相對(duì)活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

葡萄糖脫氫酶工程菌催化活性的最適pH為7.4，在pH 6.6-7.8范圍的酶活性為最適pH酶活性的80％，當(dāng)pH5.4和pH5.8時(shí)，酶活性約為最適pH酶活性的20％，當(dāng)pH8.6和pH 9時(shí)，酶活性不到最適pH酶活性的15％(圖5)。

4、溫度對(duì)葡萄糖脫氫酶工程菌的催化活性的影響

將步驟2的葡萄糖脫氫酶工程菌接入上述含氨芐青霉素和四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜。以2％的接種量轉(zhuǎn)接到上述含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入木糖到終濃度為0.5％，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，室溫下4000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，收集沉淀，加2倍體積磷酸緩沖液(pH7.0)，破碎細(xì)胞，得破碎細(xì)胞懸濁液。在破碎細(xì)胞懸濁液中加入Triton-X100至終濃度為1％，在4℃浸提過(guò)夜，12000r/min離心10min，上清液即為葡萄糖脫氫酶粗酶液，作為待測(cè)酶液。向50μL待測(cè)酶液中加入50μL pH7.4的緩沖液(向100mmol/L MOPS緩沖液中加入PQQ(吡咯喹啉醌)和CaCl₂，使PQQ含量為10μmol/L和CaCl₂含量為2mol/L得到的液體)，37℃預(yù)處理1小時(shí)以穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)，得到預(yù)處理酶液。在Tris緩沖溶液體系中(pH7.4)，在20℃-70℃溫度范圍內(nèi)測(cè)定葡萄糖脫氫酶工程菌催化葡萄糖的能力。反應(yīng)體系由待測(cè)酶液、吩嗪硫酸甲酯、2,6–二氯靛酚鈉(DCIP)、葡萄糖各和Tris緩沖溶(pH7.4)液體系組成。向比色皿中分別加入1mL的50mmol/L的Tris緩沖溶液(pH7.4)，然后再分別加入20mmol/L吩嗪硫酸甲酯、6.7mmol/L 2,6–二氯靛酚鈉(DCIP)以及1mol/L葡萄糖各100μL，混合均勻后加入50μL的預(yù)處理酶液，最后定容至3mL，測(cè)定每分鐘600nm下吸光值的變化。酶活力單位(U)定義為：在相應(yīng)溫度pH7.4條件下，在1min內(nèi)能夠使1μ mol的葡萄糖氧化(或1μ mol DCIP還原)的酶量。葡萄糖脫氫酶比活力以每單位總蛋白中酶的活力進(jìn)行計(jì)算，單位為U/mg。

步驟2的葡萄糖脫氫酶工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的葡萄糖脫氫酶CrGDH3A的最適反應(yīng)溫度為40℃，酶的活性達(dá)36.53±1.16U/mg，在30℃-45℃的范圍內(nèi)酶的活性維持在較高水平，50℃以后酶的活性則表現(xiàn)出迅速下降的趨勢(shì)，超過(guò)70℃則很難檢測(cè)到酶活性(圖6)。

5、葡萄糖脫氫酶工程菌的溶磷效果

將步驟2的葡萄糖脫氫酶工程菌及巨大芽孢桿菌WH320(受體菌)分別接種于磷礦粉液體培養(yǎng)基、磷酸三鈣液體培養(yǎng)基和磷酸鋁液體培養(yǎng)基中，使葡萄糖脫氫酶工程菌和巨大芽孢桿菌WH320的含量均為10⁸cfu/mL，在37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入木糖到終濃度為0.5％，37℃160r/min搖床培養(yǎng)，接種的磷酸三鈣培養(yǎng)基和磷酸鋁培養(yǎng)基在第7天取培養(yǎng)液，而接種的磷礦粉培養(yǎng)基在第14天取培養(yǎng)液。4℃下10000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，收集上清液，采用鉬銻抗比色法，用722型分光光度計(jì),在波長(zhǎng)700nm，直接測(cè)定接種葡萄糖脫氫酶工程菌及巨大芽孢桿菌WH320(受體菌)培養(yǎng)液中水溶性磷(也稱(chēng)為有效磷或速效磷)含量，設(shè)不接菌的相應(yīng)對(duì)照(CK)，下面給出的有效磷含量為扣除不接菌的相應(yīng)對(duì)照(CK)的值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

其中，磷礦粉液體培養(yǎng)基的pH為7.0，配制方法如下：將溶劑是水，溶質(zhì)及其濃度如下的培養(yǎng)液在115℃滅菌30min：葡萄糖5g/L，木糖5g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，KCl 0.2g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，酵母浸膏0.5g/L，5克磷礦粉(云南澄江東泰磷肥有限公司，30％的P₂O₅含量,13％的含磷量)，加蒸餾水至1000ml。

磷酸三鈣液體培養(yǎng)基的pH為7.0，配制方法如下：將溶劑是水，溶質(zhì)及其濃度如下的培養(yǎng)液在115℃滅菌30min：葡萄糖5g/L，木糖5g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，KCl 0.2g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，酵母浸膏0.5g/L，磷酸三鈣5.0g/L，加蒸餾水至1000ml。

磷酸鋁液體培養(yǎng)基的pH為7.0，配制方法如下：將溶劑是水，溶質(zhì)及其濃度如下的培養(yǎng)液在115℃滅菌30min：葡萄糖5g/L，木糖5g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，KCl 0.2g/L，(NH₄)₂SO₄0.5g/L，酵母浸膏0.5g/L，磷酸鋁5.0g/L，加蒸餾水至1000ml。

結(jié)果表明，步驟2的葡萄糖脫氫酶工程菌在磷酸三鈣液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的培養(yǎng)液的有效磷的含量為143.15±7.16μmol/L，在磷酸鋁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的培養(yǎng)液的有效磷的含量為78.90±3.95μmol/L，在磷礦粉液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天的培養(yǎng)液的有效磷的含量為34.57±2.07μmol/L；作為受體菌的巨大芽孢桿菌WH320在磷酸三鈣液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的培養(yǎng)液的有效磷的含量為12.35±0.62μmol/L，在磷酸鋁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的培養(yǎng)液的有效磷的含量為4.86±0.27μmol/L，在磷礦粉液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天的培養(yǎng)液的有效磷的含量為2.47±0.12μmol/L?？梢?jiàn)，步驟2的葡萄糖脫氫酶工程菌對(duì)磷酸三鈣的溶磷能力是作為受體菌的巨大芽孢桿菌WH320的11.59倍，對(duì)磷酸鋁的溶磷能力是作為受體菌的巨大芽孢桿菌WH320的16.23倍,對(duì)磷礦粉的溶磷能力是作為受體菌的巨大芽孢桿菌WH320的14.00倍。

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所

<120> 葡萄糖脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2391

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2391)

<223>

<400> 1

atggctatta acaatacagg ctcgcgacga ctcctcgtgg tgttaacggc cctctttgca 60

gctctttgcg ggctgtatct tctcattggc ggaggctggt tggtcgccat tggcggctcc 120

tggtactacc cgatcgccgg tctggcgatg ctgggcgtcg cctggctgct gtggcgcagc 180

aaacgttccg cactctggct gtacgccgcc ctgctcctcg ccaccctgat ttggggcgtg 240

tgggaagttg gtttcgactt ctgggcgctg actccgcgca gcgacattct ggtcttcttc 300

ggcatctggc tgatcctgcc gtttgtctgg cgtcgcctgg tcattcctgc cagcggcgca 360

gttgccgcac tggtggtcgc gctgttgatt agcggtggta tcctcacctg ggcgggcttc 420

aacgacccgc aggagatcga cggcgcgctc agcgcggagt cgacgcctgc acaggccatc 480

tcaccagtgg ctgacggcga ctggccggcg tatggccgca atcaggaagg tcaacgcttt 540

tcaccactga agcaaattca cgccgataac gtccacaagc tgaaagaagc ctgggtgttc 600

cgtactggcg atgtgaagca gccgaacgat ccgggtgaaa tcaccaatga agtgacgcca 660

attaaagtgg gcgacacgct gtatctgtgc accgctcacc agcgtctgtt cgcgctggag 720

gcggcgacgg gtaaagaaaa atggcattac gatcctgagc tgaaaaccaa cgagtctttc 780

cagcatgtaa cctgccgtgg tgtctcttat catgaagcca aagcagaaac tgcttcgccg 840

gaagtgatgg cggattgccc gcgtcgtatc attctcccgg tcaatgatgg ccgcctgatt 900

gcgattaacg ctgaaaacgg caagctgtgc gaaaccttcg ctaataaagg cgtgctcaat 960

ctgcaaagca atatgccaga caccaaaccg ggtctgtatg agccgacttc gccgccgatt 1020

atcaccgata aaacgattgt gattgctggt tcagtaacgg ataacttctc cacccgcgaa 1080

acctcgggcg tgatccgtgg ttttgacgtc aataacggta aactgctgtg ggcgttcgat 1140

ccgggtgcga aagacccgaa tgcaatccct tccgatgagc actcttttac ctttaactcg 1200

ccgaactcct gggcgccagc ggcctatgac gcgaagctgg acctcgttta cctgccgatg 1260

ggggtctcga cgccggatat ctggggcgga caccggacgc cggagcagga gcgctacgcc 1320

agttccattc tggcgctgaa cgcgaccacc ggtaaactcg cctggagcta tcagacggtt 1380

caccacgatc tgtgggatat ggacatgccg tcccagccga cgctggcgga tattaccgtc 1440

aacggtgaga aagtcccggt tatctacgcg ccagcgaaaa ccggtaacat ctttgtcctc 1500

gaccgccgta acggcgagct ggtcgttcct gcaccggaaa aaccggttcc gcagggggcc 1560

gcgaaaggcg attacgttac ccctactcaa ccgttctctg agctgagctt ccgtccgaca 1620

aaagatctaa gcggtgcgga tatgtggggt gccaccatgt ttgaccaact ggtgtgccgc 1680

gtgatgttcc accagatgcg ctatgaaggc attttcaccc caccatctga acagggtacg 1740

ctggtcttcc cgggtaacct ggggatgttc gaatggggcg gtatttcggt cgatccgaac 1800

cgtcaggtgg cgattgccaa cccgatggcg ctgccgttcg tctctaagct tattccacgc 1860

ggtccgggca acccgatgga acagccgaaa gatgcaaaag gcacaggcac cgaatccggc 1920

atccagccgc agtacggtgt accgtatggc gtcacgctca atccgttcct ctcaccgttt 1980

ggtctgccat gtaaacagcc agcatggggt tatatttcgg cgctggatct gaaaaccaat 2040

gaagtggtgt ggaagaaacg cattggtacg ccgcaggaca gcatgccgtt cccgatgccg 2100

gttccgcttc ccttcaacat ggggatgccg atgctcggcg ggcccatctc gactgccggt 2160

aacgtgctgt ttatcgccgc tacggcagat aactacctgc gcgcttacaa catgagcaac 2220

ggtgaaaaac tgtggcaggg tcgtctacca gcgggcggtc aggcaacacc gatgacctat 2280

gaggtgaacg gcaagcagta tgtcgtgatt tcagccgggg gccacggctc gtttggtacg 2340

aagatgggcg attatattgt cgcgtatgcg ctgccggatg atgtgaaata a 2391

<210> 2

<211> 796

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Ala Ile Asn Asn Thr Gly Ser Arg Arg Leu Leu Val Val Leu Thr

1 5 10 15

Ala Leu Phe Ala Ala Leu Cys Gly Leu Tyr Leu Leu Ile Gly Gly Gly

20 25 30

Trp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Trp Tyr Tyr Pro Ile Ala Gly Leu

35 40 45

Ala Met Leu Gly Val Ala Trp Leu Leu Trp Arg Ser Lys Arg Ser Ala

50 55 60

Leu Trp Leu Tyr Ala Ala Leu Leu Leu Ala Thr Leu Ile Trp Gly Val

65 70 75 80

Trp Glu Val Gly Phe Asp Phe Trp Ala Leu Thr Pro Arg Ser Asp Ile

85 90 95

Leu Val Phe Phe Gly Ile Trp Leu Ile Leu Pro Phe Val Trp Arg Arg

100 105 110

Leu Val Ile Pro Ala Ser Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Val Ala Leu

115 120 125

Leu Ile Ser Gly Gly Ile Leu Thr Trp Ala Gly Phe Asn Asp Pro Gln

130 135 140

Glu Ile Asp Gly Ala Leu Ser Ala Glu Ser Thr Pro Ala Gln Ala Ile

145 150 155 160

Ser Pro Val Ala Asp Gly Asp Trp Pro Ala Tyr Gly Arg Asn Gln Glu

165 170 175

Gly Gln Arg Phe Ser Pro Leu Lys Gln Ile His Ala Asp Asn Val His

180 185 190

Lys Leu Lys Glu Ala Trp Val Phe Arg Thr Gly Asp Val Lys Gln Pro

195 200 205

Asn Asp Pro Gly Glu Ile Thr Asn Glu Val Thr Pro Ile Lys Val Gly

210 215 220

Asp Thr Leu Tyr Leu Cys Thr Ala His Gln Arg Leu Phe Ala Leu Glu

225 230 235 240

Ala Ala Thr Gly Lys Glu Lys Trp His Tyr Asp Pro Glu Leu Lys Thr

245 250 255

Asn Glu Ser Phe Gln His Val Thr Cys Arg Gly Val Ser Tyr His Glu

260 265 270

Ala Lys Ala Glu Thr Ala Ser Pro Glu Val Met Ala Asp Cys Pro Arg

275 280 285

Arg Ile Ile Leu Pro Val Asn Asp Gly Arg Leu Ile Ala Ile Asn Ala

290 295 300

Glu Asn Gly Lys Leu Cys Glu Thr Phe Ala Asn Lys Gly Val Leu Asn

305 310 315 320

Leu Gln Ser Asn Met Pro Asp Thr Lys Pro Gly Leu Tyr Glu Pro Thr

325 330 335

Ser Pro Pro Ile Ile Thr Asp Lys Thr Ile Val Ile Ala Gly Ser Val

340 345 350

Thr Asp Asn Phe Ser Thr Arg Glu Thr Ser Gly Val Ile Arg Gly Phe

355 360 365

Asp Val Asn Asn Gly Lys Leu Leu Trp Ala Phe Asp Pro Gly Ala Lys

370 375 380

Asp Pro Asn Ala Ile Pro Ser Asp Glu His Ser Phe Thr Phe Asn Ser

385 390 395 400

Pro Asn Ser Trp Ala Pro Ala Ala Tyr Asp Ala Lys Leu Asp Leu Val

405 410 415

Tyr Leu Pro Met Gly Val Ser Thr Pro Asp Ile Trp Gly Gly His Arg

420 425 430

Thr Pro Glu Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ser Ile Leu Ala Leu Asn Ala

435 440 445

Thr Thr Gly Lys Leu Ala Trp Ser Tyr Gln Thr Val His His Asp Leu

450 455 460

Trp Asp Met Asp Met Pro Ser Gln Pro Thr Leu Ala Asp Ile Thr Val

465 470 475 480

Asn Gly Glu Lys Val Pro Val Ile Tyr Ala Pro Ala Lys Thr Gly Asn

485 490 495

Ile Phe Val Leu Asp Arg Arg Asn Gly Glu Leu Val Val Pro Ala Pro

500 505 510

Glu Lys Pro Val Pro Gln Gly Ala Ala Lys Gly Asp Tyr Val Thr Pro

515 520 525

Thr Gln Pro Phe Ser Glu Leu Ser Phe Arg Pro Thr Lys Asp Leu Ser

530 535 540

Gly Ala Asp Met Trp Gly Ala Thr Met Phe Asp Gln Leu Val Cys Arg

545 550 555 560

Val Met Phe His Gln Met Arg Tyr Glu Gly Ile Phe Thr Pro Pro Ser

565 570 575

Glu Gln Gly Thr Leu Val Phe Pro Gly Asn Leu Gly Met Phe Glu Trp

580 585 590

Gly Gly Ile Ser Val Asp Pro Asn Arg Gln Val Ala Ile Ala Asn Pro

595 600 605

Met Ala Leu Pro Phe Val Ser Lys Leu Ile Pro Arg Gly Pro Gly Asn

610 615 620

Pro Met Glu Gln Pro Lys Asp Ala Lys Gly Thr Gly Thr Glu Ser Gly

625 630 635 640

Ile Gln Pro Gln Tyr Gly Val Pro Tyr Gly Val Thr Leu Asn Pro Phe

645 650 655

Leu Ser Pro Phe Gly Leu Pro Cys Lys Gln Pro Ala Trp Gly Tyr Ile

660 665 670

Ser Ala Leu Asp Leu Lys Thr Asn Glu Val Val Trp Lys Lys Arg Ile

675 680 685

Gly Thr Pro Gln Asp Ser Met Pro Phe Pro Met Pro Val Pro Leu Pro

690 695 700

Phe Asn Met Gly Met Pro Met Leu Gly Gly Pro Ile Ser Thr Ala Gly

705 710 715 720

Asn Val Leu Phe Ile Ala Ala Thr Ala Asp Asn Tyr Leu Arg Ala Tyr

725 730 735

Asn Met Ser Asn Gly Glu Lys Leu Trp Gln Gly Arg Leu Pro Ala Gly

740 745 750

Gly Gln Ala Thr Pro Met Thr Tyr Glu Val Asn Gly Lys Gln Tyr Val

755 760 765

Val Ile Ser Ala Gly Gly His Gly Ser Phe Gly Thr Lys Met Gly Asp

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Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Leu Pro Asp Asp Val Lys

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<210> 3

<211> 2391

<212> DNA

<213> 檸檬酸桿菌Citrobacter rodentium

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2391)

<223>

<400> 3

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<212> PRT

<213> 檸檬酸桿菌Citrobacter rodentium

<220>

<223>

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Trp Glu Val Gly Phe Asp Phe Trp Ala Leu Thr Pro Arg Ser Asp Ile

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Leu Met Val Pro Ser Arg Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Ala Ala Leu

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Leu Ile Ser Gly Gly Ile Leu Thr Trp Ala Gly Phe Asn Asp Pro Gln

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Ala Ala Thr Gly Lys Glu Lys Trp His Tyr Asp Pro Glu Leu Lys Thr

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Asp Val Asn Asn Gly Lys Leu Leu Trp Ala Phe Asp Pro Gly Ala Lys

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Asp Pro Asn Ala Ile Pro Ser Asp Glu His Thr Phe Thr Phe Asn Ser

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Pro Asn Ser Trp Ala Pro Ala Ala Tyr Asp Ala Lys Leu Asp Leu Val

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Asn Met Ser Asn Gly Glu Lys Leu Trp Gln Ala Arg Leu Pro Ala Gly

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Val Ile Ser Ala Gly Gly His Gly Ser Phe Gly Thr Lys Met Gly Asp

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Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Leu Pro Asp Asp Glu Lys

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<210> 5

<211> 2454

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2454)

<223>

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<212> PRT

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<220>

<223>

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Leu Ile Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Trp Tyr Tyr

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Ala Trp Gly Tyr Ile Ser Ala Leu Asp Leu Lys Thr Asn Glu Val Val

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Arg Leu Pro Ala Gly Gly Gln Ala Thr Pro Met Thr Tyr Glu Val Asn

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Lys

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<212> DNA

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<221> CDS

<222> (1)..(2454)

<223>

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acgaagatgg gcgattatat tgtcgcgtat gcgctgccgg acgacgagaa gtaa 2454

<210> 8

<211> 817

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Met Ala Glu Asn Asn Ala Arg Ser Pro Arg Leu

20 25 30

Leu Val Thr Leu Thr Ala Leu Phe Ala Ala Leu Cys Gly Leu Tyr Leu

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Trp Tyr Tyr

50 55 60

Pro Ile Ala Gly Leu Ala Met Leu Gly Val Ala Trp Leu Leu Trp Arg

65 70 75 80

Ser Arg Arg Thr Ala Leu Trp Leu Tyr Ala Ala Leu Leu Leu Ala Thr

85 90 95

Met Ile Trp Gly Val Trp Glu Val Gly Phe Asp Phe Trp Ala Leu Thr

100 105 110

Pro Arg Ser Asp Ile Leu Val Phe Phe Gly Ile Trp Leu Ile Leu Pro

115 120 125

Phe Val Trp His Arg Leu Met Val Pro Ser Arg Gly Ala Val Ala Ala

130 135 140

Leu Val Ala Ala Leu Leu Ile Ser Gly Gly Ile Leu Thr Trp Ala Gly

145 150 155 160

Phe Asn Asp Pro Gln Glu Ile Asp Gly Ala Leu Ser Ala Glu Ser Thr

165 170 175

Pro Ala Gln Ala Ile Ser Pro Val Ala Asp Gly Asp Trp Pro Ala Tyr

180 185 190

Gly Arg Asn Gln Glu Gly Gln Arg Tyr Ser Pro Leu Lys Gln Ile Asn

195 200 205

Ala Asp Asn Val His Lys Leu Lys Glu Ala Trp Val Phe Arg Thr Gly

210 215 220

Asp Leu Lys Gln Pro Asp Asp Pro Gly Glu Leu Thr Asn Glu Val Thr

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Pro Ile Lys Val Gly Asp Thr Leu Tyr Leu Cys Thr Ala His Gln Arg

245 250 255

Leu Phe Ala Leu Glu Ala Ala Thr Gly Lys Glu Lys Trp His Tyr Asp

260 265 270

Pro Glu Leu Lys Thr Asn Glu Ser Phe Gln His Val Thr Cys Arg Gly

275 280 285

Val Ser Tyr His Glu Ala Thr Ala Gly Asn Ala Ser Pro Glu Val Ile

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Ala Asp Cys Pro Arg Arg Ile Ile Leu Pro Val Asn Asp Gly Arg Leu

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Ile Ala Leu Asn Ala Glu Thr Gly Lys Leu Cys Glu Thr Phe Gly Asn

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Lys Gly Val Leu Asn Leu Gln Thr Asn Met Pro Asp Gln Thr Pro Gly

340 345 350

Leu Tyr Glu Pro Thr Ser Pro Pro Ile Ile Thr Asp Lys Thr Ile Val

355 360 365

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370 375 380

Val Ile Arg Gly Phe Asp Val Asn Asn Gly Lys Leu Leu Trp Ala Phe

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Asp Pro Gly Ala Lys Asp Pro Asn Ala Ile Pro Ser Asp Glu His Thr

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Phe Thr Phe Asn Ser Pro Asn Ser Trp Ala Pro Ala Ala Tyr Asp Ala

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Lys Leu Asp Leu Val Tyr Leu Pro Met Gly Val Ser Thr Pro Asp Ile

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Leu Ala Leu Asn Ala Thr Thr Gly Lys Leu Ala Trp Ser Tyr Gln Thr

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Val His His Asp Leu Trp Asp Met Asp Leu Pro Ala Gln Pro Thr Leu

485 490 495

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530 535 540

Asp Tyr Val Ser Lys Thr Gln Pro Phe Ser Glu Leu Ser Phe Arg Pro

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Lys Lys Asp Leu Ser Gly Ala Asp Met Trp Gly Ala Thr Met Phe Asp

565 570 575

Gln Leu Val Cys Arg Val Met Phe His Gln Leu Arg Tyr Glu Gly Ile

580 585 590

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Pro Val Pro Leu Pro Phe Asn Met Gly Met Pro Met Leu Gly Gly Pro

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Gly Lys Gln Tyr Val Val Ile Ser Ala Gly Gly His Gly Ser Phe Gly

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Thr Lys Met Gly Asp Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Leu Pro Asp Asp Glu

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Lys