本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于檢測EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：人類表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)存在于所有正常上皮和部分間葉來源的細胞，對細胞的生長、分化的調(diào)節(jié)有重要作用。EGFR可以激活酪氨酸激酶，從而打開下游信號通路。因此，EGFR成為腫瘤尤其是非小細胞肺癌靶向治療研究的一個重要靶點。目前，臨床上EGFR靶向治療主要包括小分子酪氨酸激酶抑制劑和單克隆抗體兩個部分，如阿斯利康公司的吉非替尼(易瑞沙)，羅氏公司的惡羅替尼(特羅凱)。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)一些肺癌病人EGFR基因的編碼區(qū)，主要是在外顯子18-21上會發(fā)生突變，而這些突變與吉非替尼和惡羅替尼等藥物的臨床療效有關(guān)，即與藥物反應(yīng)性有關(guān)，原因可能是因為這些突變改變了EGFR胞內(nèi)ATP結(jié)合區(qū)的結(jié)構(gòu)，提高了EGFR對吉非替尼的結(jié)合能力。目前，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不下30種突變，不過主要是外顯子19上的缺失突變和外顯子21上L858R的點突變；外顯子19上747-750位氨基酸的大約有20多種不同缺失約占突變的45％，其中以2235_2249del15和2236_2250del15最為常見；外顯子21上858位氨基酸的替代約占突變的40-45％；外顯子18點突變(G719S或G719C)約占突變的5％；外顯子20上的插入突變約占突變的1％左右。外顯子18的G719X突變約占突變的5％左右。但是，在肺癌患者中EGFR的突變率并不高，美國肺癌病人中EGFR基因的突變率僅有2％，日本為40％。中國女性非小細胞肺癌的病人中EGFR基因的突變率為30％，如果這部分患者均能應(yīng)用吉非替尼或惡羅替尼治療將會明顯改善預(yù)后。這些靶向藥物雖然對某些人群療效非常，但是價格昂貴，如果病人不攜帶有EGFR突變而服用此類藥物，不僅耽誤病情還造成巨額藥費的浪費。因此，在用藥前篩查檢測病人是否攜帶有EGFR基因突變顯得尤為重要，也是未來腫瘤個體化治療的發(fā)展方向。所以，如何快速準確地檢測這些與藥物反應(yīng)性有關(guān)的EGFR基因突變成為人們亟待解決的問題。目前檢測EGFR基因稀有突變的方法有多種，檢測能力在1％～20％。主要有兩大類，一類是非實時PCR，主要有測序和DHPLC，檢測能力僅為20％和5％，而且需要PCR后處理，步驟繁瑣，耗時長，容易污染；另一類是實時PCR，雖然都是基于實時PCR的技術(shù)平臺，但是為了提高檢測方法的選擇能力，不同學(xué)者所用策略不盡相同。主要有完全依賴DNA序列自身識別特異性和依賴酶識別特異性兩大類策略，有TaqMan探針、高分辨熔解曲線分析、競爭性抑制實時PCR方法，檢測能力5％～20％之間，DxS蝎子引物法檢測能力可達1％。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種用于檢測EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種用于檢測EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，包括：E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組、E-21引物組、E-2引物組、E-18檢測探針、E-19檢測探針、E-20檢測探針、E-21檢測探針、E-2檢測探針和內(nèi)標(biāo)檢測探針；E-18檢測探針、E-19檢測探針、E-20檢測探針、E-21檢測探針和E-2檢測探針的5’端均修飾有第一熒光報告基團，3’端均修飾有第一熒光猝滅基團；內(nèi)標(biāo)檢測探針的序列與E-2檢測探針的序列相同，其5’端修飾有與第一熒光報告基團不同的第二熒光報告基團，3’端均修飾有第二熒光猝滅基團；其中，E-18引物組由正向引物E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F和反向引物E-18-R組成，依次包括如SEQIDNO01至04所示的序列；E-19引物組由正向引物E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F和反向引物E-19-R組成，依次包括如SEQIDNO05至24所示的序列；E-20引物組由正向引物E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F和反向引物E-20-R組成，依次包括如SEQIDNO25至30所示的序列；E-21引物組由正向引物E-21-M1-F、E-21-M2-F和反向引物E-21-R組成，依次包括如SEQIDNO31至33所示的序列；E-2引物組由正向引物E-2-F和反向引物E-2-R組成，依次包括如SEQIDNO34和35所示的序列；上述E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F、E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F、E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F、E-21-M1-F和E-21-M2-F依次對應(yīng)肺癌患者表皮生長因子受體(EGFR)基因29種常見突變，具體見下表1：表1：肺癌患者表皮生長因子受體(EGFR)基因的29種突變該多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒的每一反應(yīng)體系的組成如下：E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組和E-21引物組之一中的一正向引物和一反向引物對應(yīng)的E-18檢測探針、E-19檢測探針、E-20檢測探針、E-21檢測探針和E-2檢測探針之一E-2引物組內(nèi)標(biāo)檢測探針1×PCR緩沖液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；該多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒的每一反應(yīng)體系的反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5min，1個循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15個循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個循環(huán)，后30個循環(huán)在退火時檢測熒光信號。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述E-18檢測探針為E-18-P，包括如SEQIDNO36所示的序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述E-18檢測探針為E-19-P，包括如SEQIDNO37所示的序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述E-18檢測探針為E-20-P，包括如SEQIDNO38所示的序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述E-18檢測探針為E-21-P，包括如SEQIDNO39所示的序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述E-2檢測探針為E-2-P，所述內(nèi)標(biāo)檢測探針為E-2-I，均包括如SEQIDNO40所示的序列。上述各因物及探針具體序列如下表所示：進一步優(yōu)選的，所述第一熒光報告基團為FAM，所述第一熒光猝滅基團為BHQ，所述第二熒光報告基團為HEX、ROX或VIC，第二熒光猝滅基團為BHQ。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明以人類EGFR基因突變?yōu)闄z測對象，通過特異引物的優(yōu)化組合以及熒光探針，從而實現(xiàn)準確、簡單、快速地同時檢測EGFR基因突變，而且檢測突變的能力高。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例2的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)程序圖。圖2為本發(fā)明實施例2中多重?zé)晒釶CR檢測EGFR基因L858R突變陰性對照樣品檢測曲線圖。圖3為本發(fā)明實施例2中多重?zé)晒釶CR檢測EGFR基因L858R突變的樣品檢測曲線圖。具體實施方式以下通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的說明和描述。一種用于檢測EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，包括：E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組、E-21引物組、E-2引物組、E-18檢測探針、E-19檢測探針、E-20檢測探針、E-21檢測探針、E-2檢測探針和內(nèi)標(biāo)檢測探針；E-18檢測探針、E-19檢測探針、E-20檢測探針、E-21檢測探針和E-2檢測探針的5’端均修飾有第一熒光報告基團，3’端均修飾有第一熒光猝滅基團；內(nèi)標(biāo)檢測探針的序列與E-2檢測探針的序列相同，其5’端修飾有與第一熒光報告基團不同的第二熒光報告基團，3’端均修飾有第二熒光猝滅基團；優(yōu)選的，所述第一熒光報告基團為FAM，所述第一熒光猝滅基團為BHQ，所述第二熒光報告基團為HEX、ROX或VIC，第二熒光猝滅基團為BHQ；其中，E-18引物組由正向引物E-18-M1-F、E-18-M2-F、E-18-M3-F和反向引物E-18-R組成，依次包括如SEQIDNO01至04所示的序列；E-19引物組由正向引物E-19-M1-F、E-19-M2-F、E-19-M3-F、E-19-M4-F、E-19-M5-F、E-19-M6-F、E-19-M7-F、E-19-M8-F、E-19-M9-F、E-19-M10-F、E-19-M11-F、E-19-M12-F、E-19-M13-F、E-19-M14-F、E-19-M15-F、E-19-M16-F、E-19-M17-F、E-19-M18-F、E-19-M19-F和反向引物E-19-R組成，依次包括如SEQIDNO05至24所示的序列；E-20引物組由正向引物E-20-M1-F、E-20-M2-F、E-20-M3-F、E-20-M4-F、E-20-M5-F和反向引物E-20-R組成，依次包括如SEQIDNO25至30所示的序列；E-21引物組由正向引物E-21-M1-F、E-21-M2-F和反向引物E-21-R組成，依次包括如SEQIDNO31至33所示的序列；E-2引物組由正向引物E-2-F和反向引物E-2-R組成，依次包括如SEQIDNO34和35所示的序列；該多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒的每一反應(yīng)體系的組成如下：E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組和E-21引物組之一中的一正向引物和一反向引物對應(yīng)的E-18檢測探針、E-19檢測探針、E-20檢測探針、E-21檢測探針和E-2檢測探針之一E-2引物組內(nèi)標(biāo)檢測探針1×PCR緩沖液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；該多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒的每一反應(yīng)體系的反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5min，1個循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15個循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個循環(huán)，后30個循環(huán)在退火時檢測熒光信號。所述E-18檢測探針為E-18-P，包括如SEQIDNO36所示的序列。所述E-18檢測探針為E-19-P，包括如SEQIDNO37所示的序列。所述E-18檢測探針為E-20-P，包括如SEQIDNO38所示的序列。所述E-18檢測探針為E-21-P，包括如SEQIDNO39所示的序列。所述E-2檢測探針為E-2-P，所述內(nèi)標(biāo)檢測探針為E-2-I，均包括如SEQIDNO40所示的序列。上述各因物及探針具體序列如下表所示：實施例1本實施例以人類EGFR基因21外顯子的L858R突變?yōu)闄z測對象，通過特異引物的優(yōu)化組合以及熒光探針，從而實現(xiàn)準確、簡單、快速地同時檢測L858R突變，而且檢測突變的能力高達1％。野生型細胞系H460的基因組DNA為野生型模板，以L858R突變質(zhì)粒為陽性對照模板，以本試劑盒進行多重PCR檢測，最終以達到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(本實施例中的第一熒光報告基團為FAM，第二熒光報告基團為VIC、ROX或HEX，第一和第二熒光猝滅基團均為BHQ)。上述多重?zé)晒釶CR檢測的擴增反應(yīng)體系為：序號物料物料濃度用量(μL)11×PCR緩沖液1×102MgCl225mM83dNTPs10mM54E-21-M1-F50mM25E-21-M1-R50mM0.16E-21-P50mM0.17E-2-F50mM0.18E-2-R50mM0.19內(nèi)標(biāo)檢測探針50mM0.110Taq酶5U0.511H2O純化水18.912DNA模板2ng/ul513總體積50以上試劑組分：1×PCR緩沖液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購自中國大連寶生物公司。上述多重?zé)晒釶CR檢測的反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性5min，1個循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15個循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個循環(huán)，后30個循環(huán)在退火時檢測第一熒光報告基團和第二熒光報告基團的熒光信號。上述檢測第一熒光報告基團和第二熒光報告基團的熒光信號的Ct值，是采用Mx3000P熒光PCR擴增儀或Mx3005P熒光PCR擴增儀或ABI7500熒光PCR擴增儀。，一次可檢測96份樣品(包括陰陽性對照)。根據(jù)熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果：檢測反應(yīng)體系的第一熒光報告基團和第二熒光報告基團熒光強度，以第二熒光報告基團的信號達到設(shè)定閾值(Ct＞18)時表明上樣DNA量在允許范圍內(nèi)，第一熒光報告基團的信號結(jié)果可信；以第一熒光報告基團的信號達到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判斷的標(biāo)準，Ct值為0或30：陰性；Ct小于30：陽性。實施例2本實施例中以EGFR基因熱點突變外顯子21上的L858R突變?yōu)槔齺矸治霰景l(fā)明的多重?zé)晒釶CR檢測EGFR基因21外顯子L858R突變的方法。實驗用細胞系3株和1個質(zhì)粒，分別為H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)和L858R突變質(zhì)粒；45份健康的無償獻血者全血樣品、45份臨床肺癌樣品(包括新鮮組織、石蠟切片、胸腔積液、全血)。利用上述熒光PCR檢測EGFR基因外顯子21上的L858R突變的方法包括以下步驟：(1)樣品處理和模板提取質(zhì)控：樣品適用范圍包括手術(shù)切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片，全血，血漿，血清，胸腔積液等標(biāo)本。新鮮病理組織，取綠豆大小，約1g重，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。蠟塊樣品切成5～8μm切片，取5片，或已經(jīng)制成的5～8μm切片取5片，經(jīng)過二甲苯脫蠟后，使用Qiagen公司石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200μl，血漿、血清以及胸腔積液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH8.0)，經(jīng)紫外分光光度計檢測提取質(zhì)量，并確定濃度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH8.0)調(diào)整DNA濃度到100ng/μl或2ng/μl作為PCR擴增的模板。(2)用本發(fā)明的多重?zé)晒釶CR試劑盒(本實施例中的第一熒光報告基團為FAM，第二熒光報告基團為VIC、ROX或HEX，第一和第二熒光猝滅基團均為BHQ)對步驟(1)所得的模板進行熒光PCR擴增檢測，配制反應(yīng)體系：序號物料物料濃度用量(μL)11×PCR緩沖液1×102MgCl225mM83dNTPs10mM54E-21-M1-F50mM25E-21-M1-R50mM0.16E-21-P50mM0.17E-2-F50mM0.18E-2-R50mM0.19內(nèi)標(biāo)檢測探針50mM0.110Taq酶5U0.511H2O純化水18.912DNA模板2ng/ul513總體積50所述熒光PCR的反應(yīng)條件如圖1所示：95℃預(yù)變性5min，1個循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15個循環(huán)；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個循環(huán)。(3)檢測：采用Mx3000P實時PCR擴增儀(StrataGene公司)后30個循環(huán)退火階段檢測第一熒光報告基團和第二熒光報告基團熒光信號，一次可以檢測92份樣品(包括陰陽性對照)。結(jié)果判斷：根據(jù)熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果：檢測反應(yīng)體系的第一熒光報告基團和第二熒光報告基團熒光強度，以第二熒光報告基團信號達到設(shè)定閾值(Ct＞18)時表明上樣DNA量在允許范圍內(nèi)，第一熒光報告基團信號結(jié)果可信；以第一熒光報告基團的信號達到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判斷的標(biāo)準，Ct值為0或30：陰性；Ct小于30：陽性，檢測結(jié)果具體如圖2和圖3所示。前述45份健康獻血者全血樣品以及細胞系H460(EGFR基因野生型)、293T(EGFR基因野生型)、SW480(EGFR基因野生型)，L858R突變質(zhì)粒經(jīng)本發(fā)明的體系檢測，只有L858R突變質(zhì)粒有熒光信號，其他樣品無熒光信號，進一步證明了熒光PCR的特異性。靈敏度分析：將突變型L858R突變質(zhì)粒從10的4次方連續(xù)10倍梯度稀釋，分別為10的3次方，10的2次方，10的1次方，10的0次方。每次反應(yīng)加入5μLDNA。結(jié)果表明本發(fā)明的熒光PCR方法的靈敏度高，5拷貝DNA基因組即可檢出。選擇性能力分析：固定每次PCR反應(yīng)總DNA用量，100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。先將L858R突變質(zhì)粒DNA和野生型細胞系(H460)DNA濃度都調(diào)整為20ng/μL和2ng/μL。這樣每個反應(yīng)加5μL模板即為100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。按下述方法配置模擬DNA模板。A：50％即為10的3次方L858R突變細胞DNA。B：30％取A液60μL后混入40μL10的3次方L858R突變細胞DNA，震蕩混均。C：20％取A液40μL后混入60μL10的3次方L858R突變細胞DNA，震蕩混均。D：15％取B液50μL后混入50μL10的3次方L858R突變細胞DNA，震蕩混均。E：10％取C液50μL后混入50μL10的3次方L858R突變細胞DNA，震蕩混均。F：5％取E液50μL后混入50μL10的3次方L858R突變細胞DNA，震蕩混均。G：1％取F液20μL后混入80μL10的3次方L858R突變細胞DNA，震蕩混均。H：0.5％取G液50μL后混入50μL10的3次方L858R突變細胞DNA，震蕩混均。I：0.1％取H液20μL后混入80μL10的3次方L858R突變細胞DNA，震蕩混均。結(jié)果表明本發(fā)明的熒光PCR方法的選擇性檢測能力為在10ng總DNA中可以檢出5拷貝的突變DNA，檢測能力為1％。重復(fù)性試驗：每個反應(yīng)分別加入突變L858R質(zhì)粒DNA10ng、1ng和100pg，重復(fù)10次進行熒光PCR擴增，10次Ct值相差不到0.1個循環(huán)。收集手術(shù)切除的肺癌標(biāo)本，全血和血漿標(biāo)本以及胸水標(biāo)本共45例，其中30組織樣品，5例血漿，5例胸水，5例全血。其中男性31例，女性14例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。對于外顯子21的L858R突變，本發(fā)明檢測結(jié)果與DNA測序結(jié)果完全一致：45例樣品中有12例發(fā)生外顯子21的L858R突變，33例均為野生型。本發(fā)明可以同時檢測EGFR外顯子21的L858R突變，檢測時間僅需90min，因此本發(fā)明準、簡單、快捷可滿足突變的快速診斷。而且，多重?zé)晒釶CR方法和傳統(tǒng)測序方法結(jié)果的符合率為100％，熒光PCR靈敏度和選擇性檢測能力高于傳統(tǒng)測序方法，10ng樣品DNA中含1％的突變DNA即可檢出。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可知，用本發(fā)明的試劑盒中的E-18引物組、E-19引物組、E-20引物組、E-21引物組的其他正向引物及E-18檢測探針、E-19檢測探針、E-20檢測探針、E-21檢測探針或E-2檢測探針檢測其他相應(yīng)基因突變，仍然能夠得到與上述實施例相同或相近的技術(shù)效果，仍然屬于本發(fā)明的保護范圍。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。<110>廈門飛朔生物技術(shù)有限公司<120>一種用于檢測EGFR基因突變的多重?zé)晒釶CR檢測試劑盒<160>40<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1caaaaagatcaaagtgctggc21<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2ttcaaaaagatcaaagtgctga22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3ttcaaaaagatcaaagtgctgt22<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4tctgggctccccaccagac19<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>5gaaagttaaaattcccgtcgctatcaa27<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>6gaaagttaaaattcccgtcgctatcaagac30<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>7gagaaagttaaaattcccgtcgctatc27<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>8gagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaaa31<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>9gagaaagttaaaattcccgtcgctatc27<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10gagaaagttaaaattcccgtcgct24<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>11gagaaagttaaaattcccgtcgcta25<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>12gagaaagttaaaattcccgtcgc23<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>13ttaaaattcccgtcgctatcaaggat26<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>14ttaaaattcccgtcgctatcaagga25<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>15ttaaaattcccgtcgctatcaaggatc27<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>16ttaaaattcccgtcgctatcaagg24<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>17aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>18aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>19aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>20aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>21aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>22aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>23aattcccgtcgctatcaaggaacc24<210>24<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>24cctgaggttcagagccatggacc23<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>25cctccaccgtgcaactcatcct22<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>26gaagcctacgtgatggcgat20<210>27<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>27cgtggacaacccccacca18<210>28<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>28tggccagcgtggacgg16<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>29gtgatggccagcgtggctag20<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>30ccagttgagcaggtactgggag22<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>31gcagcatgtcaagatcacagattttgggag30<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>32cagattttgggctggccaaaga22<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>33ggaaaatgctggctgacctaaag23<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>34gcacgagtaacaagctcacg20<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>35gatcataattcctctgcacataggtaa27<210>36<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>36ctccggtgcgttcggca17<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>37cctcgatgtgagtttctgct20<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>38cccttcggctgcctcctgg19<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>39tgcagaaggaggcaaagtaagg22<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>40cagcctccagaggatgttcaa21當(dāng)前第1頁1 2 3