本發(fā)明涉及一種微生物檢測方法，具體屬于一種煤地質(zhì)微生物形態(tài)和數(shù)量的檢測方法。

背景技術(shù)：

目前，在煤地質(zhì)微生物形態(tài)觀察和數(shù)量研究方面，多采用直接觀察法和MPN計數(shù)法，該方法難以避免雜質(zhì)的影響，同時，很多煤地質(zhì)微生物不可培養(yǎng)，無法用MPN計數(shù)法計算數(shù)量，且不準(zhǔn)確。不能真實反映微生物的形態(tài)和數(shù)量及其活性。使用熒光顯微鏡進(jìn)行微生物數(shù)量和大小的觀察計算是本領(lǐng)域的常用方法之一。主要操作方法是對微生物進(jìn)行熒光染色，然后再利用熒光顯微鏡在一定波長下照射使其發(fā)光，然后進(jìn)行計數(shù)。例如量取一定量的水樣（1毫升），用吖啶橙（4-7滴）染色（3-5分鐘），抽濾，將濾膜放置于熒光顯微鏡下檢測，對所拍照片進(jìn)行直接計數(shù)。對于普通的微生物，這種操作辦法效果很好。但是對于長期存在于煤礦中的微生物，絕大多數(shù)都為厭氧微生物，在采樣過程中要絕對避免接觸氧氣和其他環(huán)境，否則會引起這些厭氧微生物大量消失以及混入其他微生物，從而影響計數(shù)準(zhǔn)確性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決煤地質(zhì)微生物厭氧取樣技術(shù)手段無法完全避免摻入雜質(zhì)，對微生物樣品觀察檢測造成干擾，難以區(qū)分樣品雜質(zhì)和微生物菌體等問題，提供一種煤地質(zhì)微生物形態(tài)和數(shù)量的檢測方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種煤地質(zhì)微生物形態(tài)和數(shù)量的檢測方法，包括如下步驟：

1）煤樣或水樣采集,

2）微生物菌體的收集,

3）菌體前處理：厭氧條件下，將備用濾膜上菌體，用去氧無菌水洗下來，制成菌懸液。根據(jù)觀察目的不同，加入特定熒光染色劑（DAPI），低速震蕩培養(yǎng)，待染色劑與微生物反應(yīng),

（4）熒光顯微鏡分析：將反應(yīng)好的微生物樣品，適量滴在載玻片上，進(jìn)行鏡檢,

（5）微生物形態(tài)分析：使用Image pro Plus軟件測量菌體大小體積,

（6）微生物數(shù)量分析：將制備好的染色菌液，取適量滴入細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)，在熒光顯微鏡下鏡檢，統(tǒng)計計算出數(shù)量。

本發(fā)明通過水樣或煤樣的隔絕氧氣的采集等加工手段，能夠確保煤礦中的煤樣或水樣中的厭氧微生物不被破壞，且不混入地面的雜菌，因而能明顯觀察出樣品中微生物的菌體形態(tài)，準(zhǔn)確測量出其大小，較精確計算出其數(shù)量，在研究煤地質(zhì)微生物菌體形態(tài)數(shù)量中有明顯的優(yōu)越性。適用于煤層、油氣或頁巖氣地層等環(huán)境中微生物形態(tài)和數(shù)量的分析。

附圖說明

圖1為本發(fā)明檢測方法的流程圖；

圖2為水樣采樣瓶的構(gòu)造；

圖3為煤樣采樣罐的構(gòu)造；

圖4為抽濾裝置構(gòu)造；

圖中：1-出氣液管、2-進(jìn)氣液管、3-瓶體、4-還原劑、5-瓶底、6-出氣口、7-催化劑、8-罐蓋、9-罐體、10-進(jìn)氣口一、11-進(jìn)氣口二、12-待濾樣品瓶、13-夾子、14-聯(lián)通器、15-錐形廢液瓶、16-抽氣口、17-微孔濾膜。

具體實施方式

如圖1所示意，一種煤地質(zhì)微生物形態(tài)和數(shù)量的檢測方法，包括如下步驟：

1）煤樣或水樣采集,

2）微生物菌體的收集,

3）菌體前處理：厭氧條件下，將備用濾膜上菌體，用去氧無菌水洗下來，制成菌懸液。根據(jù)觀察目的不同，加入熒光染色劑DAPI（即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。因為DAPI可以透過完整的細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。），低速震蕩培養(yǎng)，待染色劑與微生物反應(yīng),

（4）熒光顯微鏡分析：將反應(yīng)好的微生物樣品，適量滴在載玻片上，進(jìn)行鏡檢,

（5）微生物形態(tài)分析：使用Image pro Plus軟件測量菌體大小體積,

（6）微生物數(shù)量分析：將制備好的染色菌液，取適量滴入細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)，在熒光顯微鏡下鏡檢，統(tǒng)計計算出數(shù)量。

所述步驟（1）中，

水樣采集過程，使用水樣取樣瓶，取樣前將取樣瓶進(jìn)行高溫高壓滅菌，在無菌工作臺內(nèi)，用氮氣置換瓶體內(nèi)空氣，將配制好的新鮮還原劑溶液（還原劑為L-半胱氨酸和或碳酸氫鈉）裝入底部，然后從進(jìn)液口灌入水樣，將水樣與還原劑混勻，取回待用。

煤樣采樣過程：使用煤樣取樣罐，取樣前將取樣罐進(jìn)行高溫高壓滅菌，將催化劑鈀粒裝在罐蓋底部（催化劑鈀粒是干性的，可將罐體內(nèi)殘留少量空氣催化成厭氧氣體，催化劑的種類名稱），從進(jìn)氣口一通入氮氣置換罐體內(nèi)空氣，從下至上，能充分置換氣體，取樣時，將煤樣裝入罐體內(nèi)，蓋好罐蓋，再通入氮氣充分置換罐體，取回待用。

如圖2所示意，所述的水樣取樣瓶構(gòu)造是，瓶體3，瓶體3上口封閉，瓶體3下設(shè)有可拆卸的還原劑瓶底5，在瓶口處設(shè)有進(jìn)氣液管2和出氣液管1，所述的進(jìn)氣液管2下口比出氣液管1下口低。

使用方法：用氮氣從置換瓶體內(nèi)空氣，從進(jìn)氣液管2送入氮氣，使瓶內(nèi)空氣從出氣液管1排出，完成置換過程。

將配制好的新鮮還原劑溶液裝入底部。取樣時從進(jìn)液口灌入水樣，將水樣與還原劑混勻，取回待用。使用結(jié)束后打開還原劑瓶底5，將還原劑取出即可。

如圖3所示意，所述的煤樣取樣罐的構(gòu)造是，罐體9，罐體下方設(shè)有進(jìn)氣口10一，罐體9上方設(shè)有罐蓋8，罐蓋8內(nèi)裝有催化劑7，穿過罐蓋8設(shè)有出氣口6。

使用方法：將催化劑7裝在罐蓋8底部（催化劑是干性的，可將罐體內(nèi)殘留少量空氣催化成厭氧氣體），從下部的進(jìn)氣口一10緩慢通入氮氣置換罐體內(nèi)空氣，從下至上，能充分置換氣體。取樣時，將煤樣裝入罐體9內(nèi)，蓋好罐蓋8，再通入氮氣充分置換罐體9，取回待用。使用時取少量煤樣后，按照上述方法通入氮氣，可保證剩余煤樣依然保持厭氧狀態(tài)，繼續(xù)使用。

所述的步驟（2）微生物菌體的收集方法,具體如下

操作前進(jìn)行高溫高壓滅菌，在超凈工作臺內(nèi)，放好微孔濾膜，進(jìn)氣口二連接氮氣閥，真空連接好，對過濾裝置進(jìn)行預(yù)抽過程，使得整個裝置充滿氮氣，保持厭氧環(huán)境，預(yù)抽后，加入待濾樣，進(jìn)氣口二依然連接氮氣閥，開始抽濾工作，完畢后取微孔濾膜待用。

所述待濾樣為采集到的水體菌水樣，

所述的待濾樣為采集到的煤體菌水樣，制備方法是采集到的煤樣在厭氧條件下，研磨細(xì)，加入去氧無菌水，震蕩搖勻，靜置，取上清液。

如圖4所示意，所述收集裝置的構(gòu)造，錐形廢液瓶15，聯(lián)通器14，待濾樣品瓶12，待濾樣品瓶12和錐形廢液瓶15通過聯(lián)通器14連接，在聯(lián)通器14一側(cè)設(shè)有抽氣口16，在待濾樣品瓶12上方設(shè)有進(jìn)氣口二11，在待濾樣品瓶12和聯(lián)通器14之間設(shè)有微孔濾膜17，并且通過夾子13固定。