1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng):選取間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后,將4代細(xì)胞消化計數(shù),轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng);
(2)間充質(zhì)干細(xì)胞因子的誘導(dǎo)分泌:當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞長至匯合度70~85%時,棄掉原培養(yǎng)基,添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠,繼續(xù)培養(yǎng),收集誘導(dǎo)培養(yǎng)基;
(3)間充質(zhì)干細(xì)胞因子的分離純化:將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過濾5-8遍,收集第一粗純液,將第一粗純液泵至切向流超濾膜包,循環(huán)過濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/30-1/60,然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補(bǔ)至原體積得到第二粗純液,繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/40-1/60后,向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補(bǔ)至原體積得到第三粗純液,繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/30-1/50,收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液;
其中,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由誘導(dǎo)劑和混合培養(yǎng)基配置而成,所述混合培養(yǎng)基由體積比為30-80:19.8-68.5:0.2-1.5的1500-3000mg/L的DMEM、0.01-0.03M的PBS緩沖液和150-300mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液組成,所述誘導(dǎo)劑包括的組分及各組分在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度如下:10-20mmol/L的HEPES、1-2g/100ml的D-葡萄糖和40-70 μmol/L的L-維生素C。
2.如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法,其特征在于,所述誘導(dǎo)劑還包括如下濃度的組分:5-7mg/ml的硫代甘油和0.8-1.3mmol/L的吡哆醇鹽酸鹽。
3.如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法,其特征在于,間充質(zhì)干細(xì)胞因子誘導(dǎo)分泌的具體方法如下:
當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞長至匯合度70~85%時,棄掉原培養(yǎng)基,添加原培養(yǎng)基一半體積的誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠,繼續(xù)培養(yǎng)72h;
其中,0-24h內(nèi)培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、5%O2,24-48h內(nèi)培養(yǎng)條件為:37℃、5%CO2、20%O2;
48-72h內(nèi)培養(yǎng)條件為:37℃、5%CO2、5%O2;于48h后收集半量誘導(dǎo)培養(yǎng)基,并向細(xì)胞工廠中加入等量誘導(dǎo)培養(yǎng)基;72h后收集全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞因子的大規(guī)模制備方法,其特征在于,所述制備方法還包括間充質(zhì)干細(xì)胞因子的冷凍干燥步驟,將間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液用生理鹽水稀釋得到間充質(zhì)干細(xì)胞因子生理鹽水稀釋液,添加凍干保護(hù)劑混合均勻,過濾除菌后-80℃冷凍,并進(jìn)行真空干燥,得到的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉,-20℃保存。
5.如權(quán)利要求4所述的間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法,其特征在于,所述凍干保護(hù)劑包括的組分及各組分在間充質(zhì)干細(xì)胞因子生理鹽水稀釋液中的濃度如下:250-400mmol/L海藻糖、180-220mmol/L山梨醇和0.8-1.3g/L的人血白蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法,其特征在于,所述凍干保護(hù)劑還包括:30-50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12-36mmol/L的黃體酮。
7.如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法,其特征在于,間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)包括如下步驟:
(1)將含有間充質(zhì)干細(xì)胞的組織塊,并裝于培養(yǎng)瓶中,加入間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),保持培養(yǎng)瓶絕對靜止培養(yǎng)5天,其后每3天換液;
(2)待細(xì)胞長至75-85%匯合度時,棄間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基,于非細(xì)胞培養(yǎng)面加入生理鹽水洗滌兩次,然后加入0.25%胰酶均勻浸潤細(xì)胞貼壁面,室溫孵育3-5min,待細(xì)胞變圓后加無血清培養(yǎng)基,快速震蕩并吹打細(xì)胞貼壁面,得到細(xì)胞懸液,離心棄上清,沉淀加生理鹽水再次洗滌并離心得細(xì)胞沉淀,所述細(xì)胞沉淀用無血清培養(yǎng)基重懸,細(xì)胞篩過濾,計數(shù)并以為1-2×104個/ml細(xì)胞濃度鋪瓶,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng);如此反復(fù)至細(xì)胞傳代至4代;
(3)取經(jīng)傳代培養(yǎng)的第4代間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞;按1-2×104/ml密度接種于細(xì)胞工廠進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、20%O2培養(yǎng)。
8.一種如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法所需的制備裝置,其特征在于,所述制備裝置包括通過管路依次連通的細(xì)胞工廠、誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐、中空纖維膜微濾器、粗純液儲罐和切向流超濾膜超濾器,所述粗純液儲罐還通過管路連接有PBS緩沖液儲罐和生理鹽水儲罐;所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐間還設(shè)有第一循環(huán)管路,所述切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲罐間還設(shè)有第二循環(huán)管路,所述第一循環(huán)管路、第二循環(huán)管路,細(xì)胞工廠與誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐之間、中空纖維膜微濾器與粗純液儲罐之間、PBS儲罐或生理鹽水儲罐與粗純液儲罐之間和切向流超濾膜超濾器與生物安全柜之間的管路上均設(shè)有閥門,所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐之間及切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲罐之間的管路上還安裝有無菌泵。
9.如權(quán)利要求8所述的制備裝置,其特征在于,所述無菌泵為無菌蠕動泵,所述切向流超濾膜超濾器的截留分子量為5kD。
10.如權(quán)利要求8所述的制備裝置,其特征在于,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐、粗純液儲罐、PBS緩沖液儲罐和生理鹽水儲罐上均設(shè)有空氣過濾器。