本發(fā)明提供一種過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶人二倍體細胞貼壁培養(yǎng)方法，本發(fā)明進一步公開了實現(xiàn)本發(fā)明培養(yǎng)方法的裝置，屬于細胞培養(yǎng)生物工程技術領域。

背景技術：

在生物工程技術領域中，人二倍體細胞來源于正常人體組織，是目前公認的可用于制備病毒性疫苗的宿主細胞之一。傳統(tǒng)的細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法大多是利用不同容量的玻璃轉瓶，其缺點是單位體積提供細胞生長的表面積小、細胞生長密度低、瓶間差異較難控制、易于污染、勞動強度高、占用空間和能源消耗大。

多層細胞培養(yǎng)瓶是近年發(fā)展的一種新型細胞培養(yǎng)容器，與傳統(tǒng)的轉瓶培養(yǎng)比較其表面經(jīng)過特殊處理，細胞更容易貼壁生長，單位體積內(nèi)細胞培養(yǎng)的面積更大，細胞產(chǎn)量更高，不易污染，降低了勞動強度。

CO₂既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞生長所需成分。在哺乳類動物細胞的體外培養(yǎng)過程中，CO₂除了提供細胞生長所必需，另一方面主要與維持細胞培養(yǎng)液的pH有直接關系，對于大多數(shù)細胞適宜的pH為7.2～7.4，偏離此范圍將對細胞生長產(chǎn)生有害影響。一般培養(yǎng)液的緩沖物是碳酸緩沖對，由于空氣中的二氧化碳濃度較低，在此環(huán)境下培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)液中的HCO₃^-會被逐漸耗盡，使培養(yǎng)液pH值漸漸升高，從而影響細胞的正常生長，因此這就需要二氧化碳培養(yǎng)箱的支持，穩(wěn)定地提供適宜濃度的CO₂，以維持細胞生長的氣體環(huán)境，同時要求培養(yǎng)細胞的容器需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。

但是，對于細胞大規(guī)模培養(yǎng)來說，使用二氧化碳培養(yǎng)箱就又涉及到占用空間和能源消耗的問題?，F(xiàn)有的多層細胞培養(yǎng)瓶采用的透氣瓶蓋結構，在培養(yǎng)依賴CO₂的哺乳動物細胞，如人二倍體細胞時，并不適合在大氣二氧化碳濃度的普通大型恒溫培養(yǎng)環(huán)境下進行，因此，現(xiàn)有技術還有待進一步的改進。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開一種過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶人二倍體細胞貼壁培養(yǎng)方法，解決了利用多層細胞培養(yǎng)瓶替代傳統(tǒng)轉瓶進行生物制品生產(chǎn)中細胞的大規(guī)模培養(yǎng)的問題。

本發(fā)明進一步公開了一種過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶人二倍體細胞貼壁培養(yǎng)裝置，實現(xiàn)了普通大型恒溫培養(yǎng)環(huán)境下人二倍體細胞貼壁培養(yǎng)。

本發(fā)明所述的一種過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶人二倍體細胞貼壁培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1、將在T-225cm²細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)長成致密單層的人二倍體細胞棄去瓶中生長液，用洗液洗去殘留的舊生長液，加消化液靜置消化，待細胞表面呈松散狀時棄去消化液，用含小牛血清的生長液將細胞分散至單個狀態(tài)，按1:4分種率分種于過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶中，再補加生長液至225～275ml；

2、將過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶的瓶口用滅菌硅膠軟管與0.2 μm無菌空氣過濾器的梯形軟管接口連接進行封閉后，置37℃±0.5℃大氣二氧化碳濃度的普通恒溫室中靜止培養(yǎng)；

3、待5-7天細胞長滿致密單層后，棄去瓶中生長液，用洗液洗滌后，加消化液靜置消化，待細胞表面呈松散狀時棄去消化液，用含小牛血清的生長液將細胞分散至單個狀態(tài)，按1:4分種率繼續(xù)分種于多層細胞培養(yǎng)瓶中連續(xù)傳代擴增至適宜規(guī)模后，轉接細胞工廠用于病毒培養(yǎng)。

本發(fā)明所述的一種過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶，其特征在于：

在多層細胞培養(yǎng)瓶瓶體1的瓶口通過滅菌硅膠軟管2與一個無菌空氣過濾器3的梯形軟管接口連接進行封閉，所述的多層細胞培養(yǎng)瓶1內(nèi)壁分布有四層橫向的隔板4將瓶內(nèi)分為五層，可供細胞貼壁，無菌空氣過濾器3內(nèi)鑲嵌有0.2 μm 的無菌PTFE膜5，可以提供持續(xù)而無菌的氣體交換。

所述一種過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶人二倍體細胞貼壁培養(yǎng)方法，其中，所述人二倍體細胞可以為2BS、MRC-5、KMB17等中的任意一種。

本發(fā)明提供的一種利用多層細胞培養(yǎng)瓶進行人二倍體細胞貼壁培養(yǎng)的應用，不僅可以替代傳統(tǒng)病毒性疫苗制備工藝中細胞培養(yǎng)階段的轉瓶培養(yǎng)，降低勞動強度，減小占用空間和降低能源消耗，并且本發(fā)明的技術克服了目前市售具透氣蓋多層細胞培養(yǎng)瓶不適用于非二氧化碳依賴型培養(yǎng)環(huán)境的缺陷，降低了生產(chǎn)投入，更有利于人二倍體細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶結構示意圖，圖中，1、多層細胞培養(yǎng)瓶瓶體；2、滅菌硅膠軟管；3、無菌空氣過濾器；4、隔板；5、無菌PTFE膜；

圖2示出分別用無菌空氣過濾器與透氣蓋封閉多層細胞培養(yǎng)瓶瓶口培養(yǎng)的人二倍體細胞生長狀態(tài)的比較；

圖3示出分別用無菌空氣過濾器與透氣蓋封閉多層細胞培養(yǎng)瓶瓶口對培養(yǎng)的人二倍體細胞活細胞密度的影響；

圖4示出分別用無菌空氣過濾器與透氣蓋封閉多層細胞培養(yǎng)瓶瓶口對培養(yǎng)的人二倍體細胞上清液pH的影響。

具體實施方式

為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明的目的及技術方案，下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1

1、將在T-225cm²細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)長成致密單層的人二倍體細胞棄去瓶中生長液，用洗液洗去殘留的舊生長液，加消化液靜置消化，待細胞表面呈松散狀時棄去消化液，用含小牛血清的生長液將細胞分散至單個狀態(tài)，按1:4分種率分種于過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶中，再補加生長液至225～275ml；

2、將過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶的瓶口用滅菌硅膠軟管與0.2 μm無菌空氣過濾器的梯形軟管接口連接進行封閉后，置37 ℃±0.5 ℃大氣二氧化碳濃度的普通恒溫室中靜止培養(yǎng)；

3、待5-7天細胞長滿致密單層后，棄去瓶中生長液，用洗液洗滌后，加消化液靜置消化，待細胞表面呈松散狀時棄去消化液，用含小牛血清的生長液將細胞分散至單個狀態(tài)，按1:4分種率繼續(xù)分種于多層細胞培養(yǎng)瓶中連續(xù)傳代擴增至適宜規(guī)模后，轉接細胞工廠用于病毒培養(yǎng)。

實施例2

在過CO₂多層細胞培養(yǎng)瓶人二倍體細胞貼壁培養(yǎng)方法中，所述人二倍體細胞可以為2BS、MRC-5、KMB17等中的任意一種。

實施例3

在多層細胞培養(yǎng)瓶瓶體1的瓶口通過滅菌硅膠軟管2與一個無菌空氣過濾器3的梯形軟管接口連接進行封閉，所述的多層細胞培養(yǎng)瓶1內(nèi)壁分布有四層橫向的隔板4將瓶內(nèi)分為五層，可供細胞貼壁，無菌空氣過濾器3內(nèi)鑲嵌有0.2 μm 的無菌PTFE膜5，可以提供持續(xù)而無菌的氣體交換。

試驗例1

通過以下試驗對分別用無菌空氣過濾器與透氣蓋封閉多層細胞培養(yǎng)瓶瓶口培養(yǎng)的人二倍體細胞生長狀態(tài)進行比較。

為了測試在非二氧化碳依賴型環(huán)境下以無菌空氣過濾器封閉多層細胞培養(yǎng)瓶瓶口培養(yǎng)人二倍體細胞的性能，在大氣二氧化碳濃度的37℃恒溫室中以無菌空氣過濾器封閉多層細胞培養(yǎng)瓶瓶口培養(yǎng)人胚肺二倍體細胞2BS株2BS株，并與以原裝透氣蓋封閉的多層細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細胞進行比較。

選取在T-225 cm²細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)長成致密單層的P31代人胚肺二倍體細胞2BS株2BS株，棄去瓶內(nèi)生長液，用10～20 ml Hank's液洗去殘留的舊生長液。培養(yǎng)瓶內(nèi)加10～20ml消化液，37℃靜置消化，待細胞表面呈松散狀時棄去消化液，加入200ml含有10%小牛血清的新鮮細胞生長液，反復吹打細胞使其脫壁并分散至單個狀態(tài)，按1:4分種率分種至多層細胞培養(yǎng)瓶中。

Countstar自動細胞計數(shù)分析儀檢測每瓶活細胞密度為1.6×10⁵/ml，利用精密酸度計調整pH至7.40，每個多層細胞培養(yǎng)瓶最終生長液量為225～275ml。

實驗分為兩組，取18瓶多層細胞培養(yǎng)瓶，將瓶體1的瓶口通過滅菌硅膠軟管2與一個無菌空氣過濾器3的梯形軟管接口連接進行封閉，所述的多層細胞培養(yǎng)瓶1內(nèi)壁分布有四層橫向的隔板4將瓶內(nèi)分為五層，可供細胞貼壁，無菌空氣過濾器3內(nèi)鑲嵌有0.2 μm 的無菌PTFE膜5，可以提供持續(xù)而無菌的氣體交換（見圖1）。另取18瓶多層細胞培養(yǎng)瓶作為對照組，瓶口用原裝透氣蓋封閉。

將兩組細胞同置于37℃±0.5℃大氣二氧化碳濃度的恒溫室中靜止培養(yǎng)。以接種后一日記為第1天，每日觀察細胞形態(tài)，消化細胞進行細胞計數(shù)，并提取細胞培養(yǎng)上清液檢測pH，連續(xù)觀察6天。

細胞生長狀態(tài)比較

細胞傳代后分別用肉眼和光學顯微鏡觀察比較細胞的生長狀態(tài)。無菌空氣過濾器封閉組細胞的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于對照的原裝透氣蓋封閉組，細胞貼壁迅速，增殖速度快，細胞密度大，在接種后第3天即可形成單層。而原裝透氣蓋封閉組細胞貼壁及增殖能力均較弱，細胞不易連接成片無法形成單層，至接種后第5天，細胞開始變形，出現(xiàn)顆粒，接種后第6天細胞圓縮，失去人二倍體細胞正常形態(tài)，脫壁。見圖2。

細胞計數(shù)

自細胞接種后第1天開始，每日從兩組中各抽取3個培養(yǎng)瓶，消化液消化細胞并收獲，采用Countstar自動細胞計數(shù)分析儀對細胞進行計數(shù)，每瓶樣品檢測3個視野，計算平均結果。相同培養(yǎng)時間，無菌空氣過濾器封閉組活細胞密度明顯大于對照的原裝透氣蓋封閉組的活細胞密度，見圖3。

培養(yǎng)液pH變化

自細胞接種后第1天開始，每日從兩組中各抽取3個培養(yǎng)瓶，提取細胞培養(yǎng)上清液，采用精密酸度計檢測pH，計算平均結果。自接種后第1天開始，對照的原裝透氣蓋封閉組培養(yǎng)液pH即明顯升高，升高趨勢一直延續(xù)到接種后第6天。無菌空氣過濾器封閉組培養(yǎng)液pH在接種后第1天略高于初始pH，之后便呈現(xiàn)回落趨勢。見圖4。

上述對比實驗顯示，本發(fā)明的技術克服了目前市售具透氣蓋多層細胞培養(yǎng)瓶不適用于非二氧化碳依賴型培養(yǎng)環(huán)境的缺陷，更有利于人二倍體細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。需要說明的是，雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但本領域的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明可以做各種變化和改進，因此本發(fā)明的保護范圍應以權力要求書及其等同方案所界定的為準。