本發(fā)明屬于細(xì)胞因子
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法。
背景技術(shù)：
：間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞。因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞作用機(jī)理尚不完全明確，一般認(rèn)為主要通過(guò)以下機(jī)制：1、旁分泌作用分泌細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、抗凋亡因子等。2、代替或修復(fù)死亡或受損的細(xì)胞。3、細(xì)胞直接接觸，調(diào)控細(xì)胞的功能。當(dāng)前，越來(lái)越多的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)在其發(fā)揮治療效果中其主要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)分泌各類(lèi)細(xì)胞因子對(duì)鄰近細(xì)胞產(chǎn)生作用，從而發(fā)揮其功效。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如VEGF血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、bFGF堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、NGF神經(jīng)生長(zhǎng)因子、HGF肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IGF-1胰島素樣生長(zhǎng)因子1、BDNF腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、GDNF膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、IL-6白細(xì)胞介素6、IL-11白細(xì)胞介素11等。間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子具有改善炎性環(huán)境、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管再生、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞遷移和分化、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)及突觸連接形成及促進(jìn)髓鞘形成的功能等，通過(guò)腦白質(zhì)損傷的動(dòng)物模型證實(shí)可以抑制宿主細(xì)胞及移植細(xì)胞凋亡、改善模型鼠的神經(jīng)功能，通過(guò)心梗動(dòng)物模型證實(shí)可以促進(jìn)心功能恢復(fù)，通過(guò)皮膚損傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以促進(jìn)傷口愈合。目前的間充質(zhì)干細(xì)胞因子的制備方法的報(bào)道，如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN105543313A中公開(kāi)的人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子及其制備方法，收集并合并P1-P5代細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度75-85％時(shí)的上清液，并對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾和超濾得到細(xì)胞因子濃縮液即可，該方法未能提供有效的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌過(guò)程不夠高效，得到的間充質(zhì)干細(xì)胞因子數(shù)量較少，且該方法需要收集多代細(xì)胞培養(yǎng)基，效率低，工藝不連續(xù)，極易導(dǎo)致樣品受到不必要的污染，且多代收集的方法來(lái)制備細(xì)胞因子，產(chǎn)品均一性較難保證，分離純化過(guò)程不具規(guī)?；^難適應(yīng)大批量生產(chǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，建立完善樣本采集規(guī)范，建立大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子的制備工藝，設(shè)計(jì)一套高效連續(xù)分離純化工藝，產(chǎn)品經(jīng)真空冷凍干燥可長(zhǎng)期保存。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)：選取健康間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；2、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的誘導(dǎo)分泌：當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度70～85％時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的分離純化：將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過(guò)中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過(guò)濾5-8遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過(guò)濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/30-1/60，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補(bǔ)至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過(guò)濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/40-1/60后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補(bǔ)至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/30-1/50，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由體積比為30-80:20-60:0.2-1.5的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：10-20mmol/L的HEPES、1-2g/100ml的D-葡萄糖和40-70μmol/L的L-維生素C，其中DMEM的濃度為1500-3000mg/L，PBS緩沖液的濃度為0.01-0.03M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的濃度為150-300mM。本發(fā)明所提供的間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，采用單一樣本來(lái)源大規(guī)模培養(yǎng)，保真批次產(chǎn)品均一性，間充質(zhì)干細(xì)胞因子的誘導(dǎo)分泌階段采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加誘導(dǎo)劑配制成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，刺激細(xì)胞因子的大量分泌，配方合理有效，保持神經(jīng)干細(xì)胞的高活率同時(shí)大量分泌細(xì)胞因子，誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本不含大分子蛋白成分，便于后期產(chǎn)物分離純化；間充質(zhì)干細(xì)胞因子的分離純化階段包含兩步置換緩沖液步驟，第一步用PBS緩沖液有效防止細(xì)胞因子純化過(guò)程失活；第二部采用生理鹽水，避免PBS緩沖液在凍干過(guò)程中因本身特性產(chǎn)生的PH急劇變化導(dǎo)致蛋白失活，整個(gè)制備過(guò)程條件穩(wěn)定合理，適宜大規(guī)模生產(chǎn)。進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)劑還包括5-7mg/ml的硫代甘油和0.8-1.3mmol/L的吡哆醇鹽酸鹽。進(jìn)一步地優(yōu)選，當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度70～85％時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，添加原培養(yǎng)基一半體積的誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)72h；其中，0-24h內(nèi)培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、5％O2，24-48h內(nèi)培養(yǎng)條件為：37℃、5％CO2、20％O2；48-72h內(nèi)培養(yǎng)條件為：37℃、5％CO2、5％O2；于48h后收集半量誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并向細(xì)胞工廠中加入等量誘導(dǎo)培養(yǎng)基；72h后收集全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)階段交替改善培養(yǎng)環(huán)境并放出一部分誘導(dǎo)培養(yǎng)基，補(bǔ)加新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，從而改善細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，解除產(chǎn)物抑制，使細(xì)胞進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子。進(jìn)一步地，所述制備方法還包括間充質(zhì)干細(xì)胞因子的冷凍干燥步驟，將間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液用生理鹽水稀釋得到間充質(zhì)干細(xì)胞因子生理鹽水稀釋液，添加凍干保護(hù)劑混合均勻，過(guò)濾除菌后-80℃冷凍，并進(jìn)行真空干燥，得到的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉，-20℃保存。進(jìn)一步地，所述凍干保護(hù)劑包括250-400mmol/L海藻糖、180-220mmol/L山梨醇和0.8-1.3g/L的人血白蛋白；更進(jìn)一步地，所述凍干保護(hù)劑還包括：30-50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12-36mmol/L的黃體酮，將間充質(zhì)干細(xì)胞因子在凍干過(guò)程中有效保護(hù)，保證凍干粉的高質(zhì)量。優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)包括如下步驟：1、在無(wú)菌條件取得含有間充質(zhì)干細(xì)胞的組織塊裝于培養(yǎng)瓶中，加入間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持培養(yǎng)瓶絕對(duì)靜止培養(yǎng)5天，其后每3天換液；2、待細(xì)胞長(zhǎng)至75-85％愈合時(shí)，棄舊培養(yǎng)基，于非細(xì)胞培養(yǎng)面加入生理鹽水洗滌兩次，然后加入0.25％胰酶均勻浸潤(rùn)細(xì)胞貼壁面，室溫孵育3-5min，待細(xì)胞變圓后加無(wú)血清培養(yǎng)基，快速震蕩并吹打細(xì)胞貼壁面，得到細(xì)胞懸液，離心棄上清，沉淀加生理鹽水再次洗滌并離心得細(xì)胞沉淀，所述細(xì)胞沉淀用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞篩過(guò)濾，計(jì)數(shù)并以為1-2×104個(gè)/ml細(xì)胞濃度鋪瓶，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；3、取間充質(zhì)干細(xì)胞因子的4代細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)按1-2×104/ml密度接種到細(xì)胞工廠中，同時(shí)按相同密度接種于培養(yǎng)瓶伴隨培養(yǎng)，以37℃、5％CO2、20％O2條件進(jìn)行培養(yǎng)。采用營(yíng)養(yǎng)充足的培養(yǎng)基，有利的培養(yǎng)條件，快速大量擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，采用低氧環(huán)境，模擬間充質(zhì)干細(xì)胞在生物體內(nèi)環(huán)境，刺激大量分泌細(xì)胞因子。優(yōu)選地，所述含有間充質(zhì)干細(xì)胞的組織為人臍帶，采集方法包括如下步驟：1、提前確定臍帶來(lái)源孕婦，調(diào)查家族遺傳病史，抽母血進(jìn)行病毒檢測(cè)，記錄健康調(diào)查表；2、新生兒出生當(dāng)場(chǎng)采集臍帶，保存于儲(chǔ)運(yùn)液，保存時(shí)間<12h；3、將臍帶消毒、清洗，剪成小塊，縱向撕開(kāi)，剖離1根靜脈血管和2根動(dòng)脈血管，去除羊膜，撕取華通膠；4、將華通膠洗滌，充分剪碎至1mm3-3mm3大小，即得含有間充質(zhì)干細(xì)胞組織塊。上述方法建立完善樣本采集規(guī)范，有利于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)樣品質(zhì)量的穩(wěn)定性。另一方面，本發(fā)明提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法所需的制備裝置，包括通過(guò)管路依次密閉連接的細(xì)胞工廠、誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐、中空纖維膜微濾器、粗純液儲(chǔ)罐、切向流超濾膜超濾器和生物安全柜，所述粗純液儲(chǔ)罐還通過(guò)管路連接有PBS緩沖液儲(chǔ)罐和生理鹽水儲(chǔ)罐；所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐間還設(shè)有第一循環(huán)管路，所述切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲(chǔ)罐件還設(shè)有第二循環(huán)管路，所述第一循環(huán)管路、第二循環(huán)管路，細(xì)胞工廠與誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐之間、中空纖維膜微濾器與粗純液儲(chǔ)罐之間、PBS緩沖液儲(chǔ)罐或生理鹽水儲(chǔ)罐與粗純液儲(chǔ)罐之間和切向流超濾膜超濾器與生物安全柜之間的管道上均設(shè)有閥門(mén)，所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐之間及切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲(chǔ)罐件之間的管路上還安裝有無(wú)菌泵。提供了一套高效連續(xù)封閉的分離純化裝置，整個(gè)純化系統(tǒng)密閉連接，連續(xù)化操作，大大提高分離純化效率。優(yōu)選地，所述無(wú)菌泵為無(wú)菌蠕動(dòng)泵，所述切向流超濾膜超濾器的截留分子量為5kD。進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐、粗純液儲(chǔ)罐、PBS緩沖液儲(chǔ)罐和生理鹽水儲(chǔ)罐上均設(shè)有空氣過(guò)濾器，有效防止空氣中微生物或細(xì)菌的進(jìn)入。本發(fā)明的有益效果在于:1、提供了系統(tǒng)的樣本采集、細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)分泌及細(xì)胞因子分離純化工藝，單一樣本來(lái)源大規(guī)模培養(yǎng)，最大可能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性、均一性及重現(xiàn)性，適用于工業(yè)生產(chǎn)；2、培養(yǎng)分為兩個(gè)階段，第一階段采用營(yíng)養(yǎng)充足培養(yǎng)基、有利培養(yǎng)條件快速大量擴(kuò)增細(xì)胞；第二階段采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加誘導(dǎo)劑配置誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并采用低氧環(huán)境，模擬間充質(zhì)干細(xì)胞在生物體內(nèi)環(huán)境，刺激大量分泌細(xì)胞因子；3、純化過(guò)程包含兩步置換緩沖液步驟，第一步用PBS緩沖液有效防止細(xì)胞因子純化過(guò)程失活；第二部采用生理鹽水，避免PBS緩沖液在凍干過(guò)程中因本身特性產(chǎn)生的PH急劇變化導(dǎo)致蛋白失活。4、誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本不含大分子蛋白成分，便于后期產(chǎn)物分離純化。誘導(dǎo)階段交替改善培養(yǎng)環(huán)境并放出一部分誘導(dǎo)培養(yǎng)基，補(bǔ)加新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，從而改善細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，解除產(chǎn)物抑制，使細(xì)胞進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子；5、純化濃縮液采用ELISA法測(cè)定4種代表因子濃度，然后調(diào)節(jié)濃縮液細(xì)胞因子濃度，最后添加保護(hù)劑進(jìn)行真空冷凍干燥，真空壓蓋，保證了最終產(chǎn)品批次間的均一性。有利于產(chǎn)品后續(xù)在美容、臨床前研究及醫(yī)療方面的應(yīng)用。6、提供完整系統(tǒng)的一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法所需的制備裝置，該裝置實(shí)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備的連續(xù)化操作，大大提高純化效率，并可有效防止空氣中微生物進(jìn)入；無(wú)菌泵可選蠕動(dòng)泵，較易保證無(wú)菌操作具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明；下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍；本發(fā)明中所使用的設(shè)備，如無(wú)特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)常用的設(shè)備；本發(fā)明中所使用的方法，如無(wú)特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)常用的方法。實(shí)施例1一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、選取間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；2、當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度70～85％時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過(guò)中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過(guò)濾5遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過(guò)濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/50，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補(bǔ)至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過(guò)濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/50后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補(bǔ)至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/40，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為50:49:1的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：15mmol/L的HEPES、1.3g/100ml的D-葡萄糖和52μmol/L的L-維生素C，所述原培養(yǎng)基為常規(guī)無(wú)血清培養(yǎng)基，其中DMEM濃度為2500mg/L，PBS緩沖液緩沖溶液的濃度為0.02M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的濃度為200mM。實(shí)施例2一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、選取間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；2、當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度70～85％時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過(guò)中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過(guò)濾8遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過(guò)濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/30，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補(bǔ)至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過(guò)濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/40后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補(bǔ)至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/30，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為30:68.5:1.5的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：10mmol/L的HEPES、1g/100ml的D-葡萄糖和40μmol/L的L-維生素C，5mg/ml的硫代甘油和0.8mmol/L的吡哆醇鹽酸鹽，其中DMEM濃度為1500mg/L，PBS緩沖液緩沖溶液的濃度為0.01M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的濃度為300mM。。實(shí)施例3一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、選取間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；2、當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度70～85％時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，并按照原培養(yǎng)基一半體積添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)調(diào)整參數(shù)為:37℃、5％CO2、5％O2，24h后調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為：37℃、5％CO2、20％O2，48h后收集半量誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并向細(xì)胞工廠中加入等量新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整參數(shù)為37℃、5％CO2、5％O2，繼續(xù)培養(yǎng)；72h后收集全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過(guò)0.1um的中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過(guò)濾7遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過(guò)濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/60，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補(bǔ)至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過(guò)濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/60后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補(bǔ)至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/50，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為80:19.8:0.2的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：20mmol/L的HEPES、2g/100ml的D-葡萄糖和70μmol/L的L-維生素C，7mg/ml的硫代甘油和1.3mmol/L的吡哆醇鹽酸鹽，其中DMEM濃度為3000mg/L，PBS緩沖液緩沖溶液的濃度為0.03M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的濃度為300mM。實(shí)施例4一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、選取間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；2、當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度70～85％時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，并按照原培養(yǎng)基一半體積添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)調(diào)整參數(shù)為:37℃、5％CO2、5％O2，24h后調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為：37℃、5％CO2、20％O2，48h后收集半量誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并向細(xì)胞工廠中加入等量新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整參數(shù)為37℃、5％CO2、5％O2，繼續(xù)培養(yǎng)；72h后收集全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過(guò)0.1um的中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過(guò)濾6遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過(guò)濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/50，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補(bǔ)至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過(guò)濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/50后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補(bǔ)至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/50，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；4、將間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液收集至合適離心管，取樣ELISA法測(cè)定VEGF、BDNF、GDNF、bFGF濃度，用生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度得純化液，然后將純化液用注射器吸出，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝到2ml無(wú)菌、無(wú)熱源西林瓶，每管1ml，將西林瓶置于-80℃冰箱速凍4h；將西林瓶置于壓蓋式真空冷凍干燥機(jī)，浮蓋蓋好，啟動(dòng)冷凍干燥機(jī)，設(shè)置真空度1.05mbar，干燥時(shí)間24h；干燥結(jié)束，真空壓蓋，西林瓶取出-20℃保存。其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為50:49:1的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：10mmol/L的HEPES、2g/100ml的D-葡萄糖和50μmol/L的L-維生素C。凍干保護(hù)劑包括：250mmol/L海藻糖、180mmol/L山梨醇和0.8g/L的人血白蛋白。實(shí)施例5一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實(shí)施例4的區(qū)別在于凍干保護(hù)劑包括：400mmol/L海藻糖、220mmol/L山梨醇和1.3g/L的人血白蛋白，50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和36mmol/L的黃體酮。實(shí)施例6一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)：1)提前確定臍帶來(lái)源孕婦，調(diào)查家族遺傳病史，抽母血進(jìn)行病毒檢測(cè)，記錄健康調(diào)查表；2)新生兒出生當(dāng)場(chǎng)采集臍帶，保存于儲(chǔ)運(yùn)液，保存時(shí)間<12h；3)將臍帶消毒、清洗，剪成小塊，縱向撕開(kāi)，剖離1根靜脈血管和2根動(dòng)脈血管，去除羊膜，撕取華通膠；4)將華通膠洗滌，充分剪碎至1mm3-3mm3大小，即得含有間充質(zhì)干細(xì)胞組織塊；5)將組織塊并裝于培養(yǎng)瓶中，加入間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持培養(yǎng)瓶絕對(duì)靜止培養(yǎng)5天，其后每3天換液；6)待細(xì)胞長(zhǎng)至80％愈合時(shí)，棄舊培養(yǎng)基，于非細(xì)胞培養(yǎng)面加入生理鹽水洗滌兩次，然后加入0.25％胰酶均勻浸潤(rùn)細(xì)胞貼壁面，室溫孵育3-5min，待細(xì)胞變圓后加無(wú)血清培養(yǎng)基，快速震蕩并吹打細(xì)胞貼壁面，得到細(xì)胞懸液，離心棄上清，沉淀加生理鹽水再次洗滌并離心得細(xì)胞沉淀，所述細(xì)胞沉淀用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞篩過(guò)濾，計(jì)數(shù)并以為1-2×104個(gè)/ml細(xì)胞濃度鋪瓶，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；7)取間充質(zhì)干細(xì)胞因子的4代細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)按1-2×104/ml密度接種到細(xì)胞工廠中，同時(shí)按相同密度接種于培養(yǎng)瓶伴隨培養(yǎng)，以37℃、5％CO2、20％O2條件進(jìn)行培養(yǎng)。2、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的誘導(dǎo)分泌：當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度70～85％時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，并按照原培養(yǎng)基一半體積添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)調(diào)整參數(shù)為:37℃、5％CO2、5％O2，24h后調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為：37℃、5％CO2、20％O2，48h后收集半量誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并向細(xì)胞工廠中加入等量新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整參數(shù)為37℃、5％CO2、5％O2，繼續(xù)培養(yǎng)；72h后收集全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的分離純化：將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過(guò)0.1um的中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過(guò)濾6遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過(guò)濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/50，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補(bǔ)至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過(guò)濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/50后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補(bǔ)至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/50，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；4、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的冷凍干燥，將間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液用生理鹽水稀釋?zhuān)砑觾龈杀Ｗo(hù)劑混合均勻，過(guò)濾除菌后-80℃冷凍干燥，得到的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉，-20℃保存；其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為50:49:1的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：10mmol/L的HEPES、1.5g/100ml的D-葡萄糖和55μmol/L的L-維生素C。凍干保護(hù)劑包括：250mmol/L海藻糖、180mmol/L山梨醇和0.8g/L的人血白蛋白，30mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12mmol/L的黃體酮。實(shí)施例7一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法所需的制備裝置，包括通過(guò)管路依次密閉連接的細(xì)胞工廠、誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐、中空纖維膜微濾器、粗純液儲(chǔ)罐和切向流超濾膜超濾器，所述粗純液儲(chǔ)罐還通過(guò)管路連接有PBS緩沖液儲(chǔ)罐和生理鹽水儲(chǔ)罐；所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐間還設(shè)有第一循環(huán)管路，所述切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲(chǔ)罐間還設(shè)有第二循環(huán)管路，所述第一循環(huán)管路、第二循環(huán)管路，細(xì)胞工廠與誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐之間、中空纖維膜微濾器與粗純液儲(chǔ)罐之間、PBS緩沖液儲(chǔ)罐或生理鹽水儲(chǔ)罐與粗純液儲(chǔ)罐之間和切向流超濾膜超濾器與生物安全柜之間的管道上均設(shè)有閥門(mén)，所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐之間及切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲(chǔ)罐間之間的管路上還安裝有無(wú)菌泵，優(yōu)選地，所述無(wú)菌泵為無(wú)菌蠕動(dòng)泵，所述切向流超濾膜超濾器的截留分子量為5kD。實(shí)施例8一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法所需的制備裝置，與實(shí)施例7的區(qū)別在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲(chǔ)罐、粗純液儲(chǔ)罐、PBS緩沖液儲(chǔ)罐和生理鹽水儲(chǔ)罐上均設(shè)有空氣過(guò)濾器。對(duì)照實(shí)施例1一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實(shí)施例1的區(qū)別在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基相同，所述原培養(yǎng)基為常規(guī)無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)照實(shí)施例2一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實(shí)施例1的區(qū)別在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)劑包括的組分及各組分在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度如下：10mmol/L的HEPES、1g/100ml的甘露糖、50μmol/L的維生素E。對(duì)照實(shí)施例3一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實(shí)施例1的區(qū)別在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)基由體積比為50:50的DMEM和PBS緩沖液混合而成。對(duì)照實(shí)施例4一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實(shí)施例1的區(qū)別在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)劑包括的組分及各組分在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度如下：10mmol/L的HEPES、1g/100ml的D-葡萄糖、50μmol/L的L-維生素C5mg/ml的硫代甘油。對(duì)照實(shí)施例5一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實(shí)施例4的區(qū)別在于，所述凍干保護(hù)劑為，每100ml中含有如下組分：抗壞血酸(VC)0.5g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、檸檬酸鈉0.26g、叔丁醇15ml。試驗(yàn)1：間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液中細(xì)胞因子的含量測(cè)定取等量實(shí)施例1-3、對(duì)照例1-4及中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN105543313A中公開(kāi)的人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子制備方法所制備出的間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液，采用ELISA法測(cè)定VEGF、BDNF、GDNF、bFGF濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。表1各細(xì)胞因子的濃度組別VEGFBDNFGDNFbFGF實(shí)施例1457ng/ml269ng/ml206ng/ml353ng/ml實(shí)施例2537ng/ml321ng/ml257ng/ml398ng/ml實(shí)施例3602ng/ml364ng/ml283ng/ml435ng/ml對(duì)照例1211ng/ml137ng/ml89ng/ml159ng/ml對(duì)照例2397ng/ml221ng/ml153ng/ml301ng/ml對(duì)照例3335ng/ml158ng/ml183ng/ml226ng/ml對(duì)照例4462ng/ml285ng/ml213ng/ml363ng/mlCN105543313A385ng/ml214ng/ml164ng/ml297ng/ml由表1可以看出，實(shí)施例1與對(duì)照例1-3相比，極大程度提高了各細(xì)胞因子的濃度，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子具有很好的誘導(dǎo)作用，對(duì)照實(shí)施例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于，將D-葡萄糖替換為其同分異構(gòu)體甘露糖、將L-維生素C替換為同族的維生素E；對(duì)照實(shí)施例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的混合培養(yǎng)基中不含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液；試驗(yàn)結(jié)果可知，上述改變所構(gòu)成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基均不能較好的起到誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用，各個(gè)組分相互協(xié)同，缺一不可且不可替代；實(shí)施例2相對(duì)于實(shí)施例1進(jìn)一步優(yōu)化了誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分，有實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知實(shí)施例2的細(xì)胞因子濃度高于實(shí)施例1，對(duì)照例4與實(shí)施例2的區(qū)別在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基組分不同，由試驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)施例2的間充質(zhì)干細(xì)胞因子誘導(dǎo)分泌效果遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)照例4；而實(shí)施例3在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)的條件，更進(jìn)一步提高了細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的量；與中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN105543313A的方法制備間充質(zhì)干細(xì)胞因子數(shù)量相比較，本發(fā)明所提供的間充質(zhì)干細(xì)胞因子制備方法得到的細(xì)胞因子更多，效率高，且方法簡(jiǎn)單。試驗(yàn)2：間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉檢驗(yàn)取實(shí)施例4、實(shí)施例5和對(duì)照實(shí)施例2所得的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉，于-10℃放置18個(gè)月，分別于6個(gè)月、12個(gè)月和18個(gè)月時(shí)觀察凍干粉的性狀、剩余水分及bFGF活性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。表2試驗(yàn)組和對(duì)照組神經(jīng)干細(xì)胞分化結(jié)果經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果分析可知，本發(fā)明所提供的凍干保護(hù)劑，可以形成穩(wěn)定的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉，使產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，易于保存，在-10℃條件下可放置12個(gè)月以上無(wú)變化，含水量在1.33％以下，其中實(shí)施例5所提供的凍干保護(hù)劑較實(shí)施例4效果更佳；實(shí)施例1與對(duì)照例2相比效果更佳，且成分簡(jiǎn)單，成本低廉。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3