本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA基因突變的檢測引物、試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)：
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Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber’s hereditary optic neuropathy,LHON)是最常見的線粒體遺傳病之一，也是青壯年視力喪失的最常見原因之一[Man PYW et al.J Med Genet,2002]。95％以上的患者是由線粒體DNA(mtDNA)的3個原發(fā)致病突變引起，包括位于MT-ND4基因的m.11778G>A，MT-ND6基因的m.14484T>C以及MT-ND1基因的m.3460G>A[Cerelli V et al.Prog Retin Eye Res,2004]。而位于MT-ND1基因的m.3635G>A突變是中國人群中第4個常見突變，其突變頻率與m.3460G>A突變相當(dāng)[Jia XY et al.J Hum Genet,2006]。通過對這4個位點進(jìn)行突變檢測，對于這種嚴(yán)重影響青壯年視力疾病的早期診斷、干預(yù)、和治療具有重要意義。
目前，一方面，市場上沒有商品化的LHON常見mtDNA 4位點突變檢測試劑盒；另一方面，LHON的基因診斷最常見的方法有等位基因特異性PCR(AS-PCR)[CN1288254C,CN102146443A，CN101781683A]、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)[CN1143117A，CN102747152A，CN104774927A，CN103173545A，CN104774926A，CN103173544A]以及等位基因特異性熒光探針技術(shù)PCR[CN1721839A,CN1712543A]，檢測單個或者3個常見突變位點，這些檢測方法都具有簡便、快速、費用低的優(yōu)點，但是由于mtDNA變異在人群中發(fā)生頻率高，位于原發(fā)突變鄰近區(qū)域的變異會影響結(jié)果，造成假陽性或假陰性，此外，還有芯片檢測法[CN101497925A,CN104805210A]，可以同時檢測更多LHON相關(guān)mtDNA變異，具有準(zhǔn)確高通量的優(yōu)點，但是該方法費用昂貴。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種具有高度的敏感性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA基因突變的檢測引物、試劑盒和檢測方法。
本發(fā)明的第一個目的是提供Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA基因突變的檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：
MT-ND4-F：5’-GCCTACCCCTTCCTTGTACT-3’(如SEQ ID NO.1所示)，MT-ND4-R：5’-TGGTTACTAGCACAGAGAGTTCT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；MT-ND6-F：5’-GTTTACCACAACCACCACCC-3’(如SEQ ID NO.3所示)，MT-ND6-R：5’-AAGCCTTCTCCTATTTATGGGG-3’(如SEQ ID NO.4所示)；MT-ND1-F：5’-GGCCAACCTCCTACTCCTC-3’(如SEQ ID NO.5所示)，MT-ND1-R：5’-TGATGGCTAGGGTGACTTCA-3’(如SEQ ID NO.6所示)。
本發(fā)明的第二個目的是提供Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，包括上述的檢測引物。
優(yōu)選，所述的檢測試劑盒還包括2*Master Mix、ddH2O、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。
所述的陽性質(zhì)控品為含有SEQ ID NO.8序列的質(zhì)粒DNA、含有SEQ ID NO.10序列的質(zhì)粒DNA、含有SEQ ID NO.12序列的質(zhì)粒DNA和含有SEQ ID NO.13序列的質(zhì)粒DNA。
所述的陰性質(zhì)控品為不含有SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13序列的DNA序列。
本發(fā)明的第三個目的是提供Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA基因突變的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)提取待測樣品的基因組DNA；(2)用檢測引物MT-ND4-F/MT-ND4-R、MT-ND6-F/MT-ND6-R和MT-ND1-F/MT-ND1-R分別對步驟(1)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，然后與野生型線粒體DNA相應(yīng)的基因序列進(jìn)行比對，確定是否存在基因突變位點。
所述的測序的方法優(yōu)選為Sanger測序法。
Sanger測序原理，DNA模板在DNA聚合酶、引物、四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下進(jìn)行復(fù)制時，在反應(yīng)體系中分別按照一定的比例引入四種熒光染色劑標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基團(tuán)，當(dāng)ddNTP摻入鏈的末端時，該鏈就會停止延伸。如此每管反應(yīng)體系中就產(chǎn)生了一系列長度不等的以ddNTP為3’端的DNA片段。反應(yīng)終止后，在毛細(xì)管中進(jìn)行凝膠電泳以分離長短不一的DNA片段，相鄰的片段長度相差一個堿基，在毛細(xì)管電泳中的遷移率就不同，激光檢測器可對熒光分子逐個進(jìn)行檢測，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測序的目的。
所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：包含基因組DNA 20ng、2*Master Mix 10μL、10μM上游引物0.3μL和10μM下游引物0.3μL，其余由雙蒸水補(bǔ)足至20μL；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序為：94℃，預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，重復(fù)30個循環(huán)；72℃延伸5min。
本發(fā)明基于Sanger測序的原理，具有高度的敏感性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的特點，可以同時檢測LHON mtDNA最常見的四個致病突變，解決了現(xiàn)有檢測LHON線粒體DNA突變方法的靈敏度低和特異性不夠強(qiáng)、容易污染和費用昂貴等問題，為LHON提供了一種精準(zhǔn)的基因診斷方法，對該病的遺傳咨詢和基因治療有重要意義。
具體實施方式：
以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例1：檢測引物的設(shè)計和標(biāo)準(zhǔn)品的制備
1、檢測引物的設(shè)計
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中mtDNA中的MT-ND4基因(GeneBank序列號為Gene ID:4538；NC_012920.1；YP_003024035.1)、MT-ND6基因(GeneBank序列號為Gene ID:4541；NC_012920.1；YP_003024037.1)和MT-ND1基因(GeneBank序列號為Gene ID:4535；NC_012920.1；P_003024026.1)的核苷酸序列，分別在G11778A突變位點、T14484C突變位點、G3460A和G3635A兩個突變位點的上下游設(shè)計檢測引物。所設(shè)計的檢測引物如表1所示。
表1檢測引物序列
2、標(biāo)準(zhǔn)品的制備
將SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8作為目的片段分別插入到pGH載體的多克隆位點制備得到野生型質(zhì)粒pGH-G11778G和突變型質(zhì)粒pGH-G11778A，將SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10作為目的片段分別插入到pGH載體的多克隆位點制備得到野生型質(zhì)粒pGH-T14484T和突變型質(zhì)粒pGH-T14484C，將SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13作為目的片段分別插入到pGH載體的多克隆位點制備得到野生型質(zhì)粒pGH-G3460G和突變型質(zhì)粒pGH-G3460A以及野生型質(zhì)粒pGH-G3635G和突變型質(zhì)粒pGH-G3635A。其中，野生型質(zhì)粒pGH-G3460G和野生型質(zhì)粒pGH-G3635G插入的目的片段均為SEQ ID NO.11所示的序列。
實施例2：樣本基因組DNA提取
使用酚/氯仿法或試劑盒提取法從臨床樣本中提取基因組DNA?；蚪MDNA提取的具體步驟如下：
1.向EP管中proteinase-K Mix 20μL，然后加樣本200μL(全血或白膜層)。
2.向EP管中加200μL Buffer AL緩沖液(混勻充分)，充分振蕩混勻Mix-tex 15s。
3.將EP管放置于56℃水浴10min。
4.取出EP管并短暫離心，去除EP管管蓋內(nèi)壁的液滴。
5.加入200μL無水乙醇，用振蕩器徹底混勻15s(去除EP管管蓋內(nèi)壁的液滴)。
6.將吸附柱放入收集管中，將上述所得溶液和絮狀沉淀物全部小心轉(zhuǎn)移到吸附柱中，蓋上管蓋，8000rpm離心1分鐘。
7.并將吸附柱放置于另一個干凈的收集管中，向吸附柱中加入500μL緩沖液AW1(已經(jīng)加入無水乙醇)，蓋上管蓋，8000rpm離心1分鐘，將吸附柱放置于另一個干凈的收集管中。
8.向吸附柱中加入500μL緩沖液AW2(已經(jīng)加入無水乙醇)。蓋上管蓋，14000rpm離心3分鐘；開蓋晾2分鐘。
9.將吸附柱置于一干凈的1.5mL離心管內(nèi)，棄除將裝有流液的收集管。
10.取緩沖液AE 100μL垂直滴加至吸附柱中心，室溫放置5分鐘，8000rpm離心1分鐘。
11.EP管中為所提取DNA，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例3：PCR擴(kuò)增
以實施例2提取的基因組DNA作為模板，分別以實施例1設(shè)計的檢測引物MT-ND4-F/MT-ND4-R、MT-ND6-F/MT-ND6-R和MT-ND1-F/MT-ND1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以不加模板DNA作為空白對照，野生型質(zhì)粒作為陰性對照，突變位點的突變型質(zhì)粒作為陽性對照。
PCR反應(yīng)體系為：總體系為20μL，包含模板DNA 2μL(20ng)、2*Master Mix 10μL、10μM上游引物0.3μL和10μM下游引物0.3μL，其余用ddH2O補(bǔ)足至20μL，PCR反應(yīng)程序為：94℃，預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，重復(fù)30個循環(huán)；72℃延伸5min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：取3μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在20g/L瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)，50V電泳45-60min，紫外燈下直接觀察結(jié)果：檢測引物MT-ND4-F/MT-ND4-R、MT-ND6-F/MT-ND6-R和MT-ND1-F/MT-ND1-R擴(kuò)增的目的片段大小分別為382bp、288bp和437bp。
實施例4：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
使用前請先在漂洗液PW中加入無水乙醇。所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化具體步驟如下：
4.1柱平衡步驟：向吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(請使用當(dāng)天處理過的柱子)。
4.2估計PCR反應(yīng)液的體積，向其中加入5倍體積的結(jié)合液PB，充分混勻。
4.3將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置2min，12,000rpm(～13,400×g)離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。注意：吸附柱容積為800μL，若樣品體積大于800μL可分批加入。
4.4向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW靜置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
4.5重復(fù)操作步驟4.4。
4.6將離心吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。收集純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
實施例5：目的片段的測序
5.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序擴(kuò)增
使用表1中的檢測引物的上游引物和下游引物分別對實施例4獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正向測序和反向測序擴(kuò)增。
測序PCR反應(yīng)體系為：包含模板DNA 1μL、10μM上游引物或下游引物0.5μL、2.5×Bigdye 0.3μL、5×buffer 1μL和ddH2O 2.2μL，測序PCR反應(yīng)程序：94℃，預(yù)變性5min；94℃變性10s，50℃延伸5s，60℃退火4min，重復(fù)29個循環(huán)。
5.2測序擴(kuò)增產(chǎn)物純化
在96孔板中加入測序反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物5μL和70％無水乙醇35μL，4,000rpm離心30min；馬上倒置96孔板，500rpm瞬時離心30sec，室溫放置40min晾干。
5.3上機(jī)測序
上機(jī)樣本準(zhǔn)備：晾干后的樣品加Hi-Di去離子甲酰胺10μL，95℃變性5min，然后馬上置于冰上冷卻5min。然后將樣本放到測序儀的樣本板基座上測序。
5.4測序結(jié)果分析：導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，使用“DNAStar”軟件分析，mtDNA位點11778上堿基G突變?yōu)锳為11778突變陽性；mtDNA位點14484上堿基T突變?yōu)镃為14484突變陽性；mtDNA位點3460上堿基G突變?yōu)锳為3460為突變陽性；mtDNA位點3635上堿基G突變?yōu)锳為3635突變陽性；堿基沒有變異為陰性。
實施例6：靈敏度檢測
6.1靈敏度檢測
分別將各突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒稀釋至終濃度為10ng/μL，然后將突變型質(zhì)粒與其對應(yīng)的野生型質(zhì)粒按體積比0.2:9.8、0.5:9.5、1:9、1.5:8.5、2:8、3:7和4:6進(jìn)行混合，配制成突變豐度為2％、5％、10％、15％、20％、30％和40％的陽性樣本(表2)。以不同突變豐度的陽性樣本作為模板，按照實施例3～5所述的方法進(jìn)行測序，結(jié)果如表3所示。
表2突變質(zhì)粒的質(zhì)粒信息
表3靈敏度檢測結(jié)果(正反向測序)
注：-/-表示正反向測序均未檢出突變，+/+表示正反向測序均檢出突變
結(jié)合測序圖及表3判斷，本發(fā)明的檢測引物的檢測靈敏度為突變豐度為10％。
6.2靈敏度驗證
合格標(biāo)準(zhǔn)：檢測樣品突變體基因組的突變豐度為10％的樣本10次，至少9次檢測結(jié)果符合檢測下限，即檢出率大于或者等于90％。
6.3突變豐度為10％的陽性樣本的檢測靈敏度
取LHON最常見4位點突變位點的突變型質(zhì)粒(突變豐度10％)，按照實施例3～5所述的方法進(jìn)行基因突變檢測。檢測結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，突變豐度為10％的各突變型質(zhì)粒pGH-G11778A、pGH-T14484C、pGH-G3460A和pGH-G3635A陽性樣本重復(fù)10次檢測的檢出率為100％。靈敏度驗證通過。
表4靈敏度驗證檢測結(jié)果(突變豐度10％)
實施例7：特異性測試
特異性驗證方法：收集10名正常人外周血白細(xì)胞提取的全基因組DNA，按實施例3～5的方法進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，10例樣本均為野生型，特異性100％。
實施例8：重復(fù)性測試
將實施例6中的突變豐度為10％和30％的陽性樣本作為模板，按照實施例3～5的方法進(jìn)行測序，重復(fù)10次，并計算其陽性率結(jié)果重復(fù)率，結(jié)果見表5。
表5不同突變豐度模板的重復(fù)測序結(jié)果
注：+/+表示正反向測序均檢出突變
綜合測序圖及表5顯示，以突變豐度為10％和30％的陽性樣本作為模板進(jìn)行測序，重復(fù)測序10次，陽性結(jié)果重復(fù)率均為100％，本發(fā)明的檢測引物及PCR反應(yīng)條件檢測重復(fù)性好，并能對突變豐度為10％的樣本實現(xiàn)穩(wěn)定檢測。
實施例9：最低檢測限測試
分別以G11778A、T14484C、G3460A和G3635A突變型基因組DNA作為模板，按照反應(yīng)終濃度為20ng/20μL、10ng/20μL、5ng/20μL、2.5ng/20μL和1.25ng/20μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各擴(kuò)增體系中突變型基因組DNA的突變豐度均為100％。將突變型基因組DNA與野生型基因組DNA分別進(jìn)行稀釋，然后將突變型基因組DNA與其對應(yīng)的野生型基因組DNA按體積比1:9進(jìn)行混合，得到突變豐度為10％的陽性樣本，然后按照反應(yīng)終濃度為20ng/20μL、10ng/20μL、5ng/20μL、2.5ng/20μL和1.25ng/20μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各擴(kuò)增體系中突變型基因組DNA的突變豐度均為10％。按照實施例3～5的方法測序，重復(fù)20次。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明：反應(yīng)終濃度為20ng/20μL、10ng/20μL、5ng/20μL、2.5ng/20μL的陽性樣本的擴(kuò)增條帶清晰明亮、無非特異性擴(kuò)增。反應(yīng)終濃度為1.25ng/20μL的陽性樣本的四個位點的檢出率均低于95％。
測序結(jié)果：突變豐度為100％、10％的20份陽性樣本的正反向測序峰圖均符合要求。檢測結(jié)果見表6。結(jié)合測序圖及表6判斷，初步結(jié)果顯示本發(fā)明的檢測引物的最低檢測限為模板反應(yīng)終濃度為2.5ng/20μL。
表6檢測結(jié)果(正反向測試)
序列表
<110> 中山大學(xué)中山眼科中心
<120> 一種Leber遺傳性視神經(jīng)病變線粒體DNA基因突變的檢測引物、試劑盒和檢測方法
<160> 13
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcctacccct tccttgtact 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggttactag cacagagagt tct 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtttaccaca accaccaccc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagccttctc ctatttatgg gg 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggccaacctc ctactcctc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgatggctag ggtgacttca 20
<210> 7
<211> 382
<212> DNA
<213> 人線粒體DNA
<400> 7
gcctacccct tccttgtact atccctatga ggcataatta taacaagctc catctgccta 60
cgacaaacag acctaaaatc gctcattgca tactcttcaa tcagccacat agccctcgta 120
gtaacagcca ttctcatcca aaccccctga agcttcaccg gcgcagtcat tctcataatc 180
gcccacgggc ttacatcctc attactattc tgcctagcaa actcaaacta cgaacgcact 240
cacagtcgca tcataatcct ctctcaagga cttcaaactc tactcccact aatagctttt 300
tgatgacttc tagcaagcct cgctaacctc gccttacccc ccactattaa cctactggga 360
gaactctctg tgctagtaac ca 382
<210> 8
<211> 382
<212> DNA
<213> 人線粒體DNA
<400> 8
gcctacccct tccttgtact atccctatga ggcataatta taacaagctc catctgccta 60
cgacaaacag acctaaaatc gctcattgca tactcttcaa tcagccacat agccctcgta 120
gtaacagcca ttctcatcca aaccccctga agcttcaccg gcgcagtcat tctcataatc 180
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cacagtcaca tcataatcct ctctcaagga cttcaaactc tactcccact aatagctttt 300
tgatgacttc tagcaagcct cgctaacctc gccttacccc ccactattaa cctactggga 360
gaactctctg tgctagtaac ca 382
<210> 9
<211> 288
<212> DNA
<213> 人線粒體DNA
<400> 9
gtttaccaca accaccaccc catcatactc tttcacccac agcaccaatc ctacctccat 60
cgctaacccc actaaaacca tcaccaagac ctcaacccct gacccccatg cctcaggata 120
ctcctcaata gccatcgctg tagtatatcc aaagacaacc atcattcccc ctaaataaat 180
taaaaaaact attaaaccca tataacctcc cccaaaattc agaataataa cacacccgac 240
cacaccgcta acaatcaata ctaaaccccc ataaatagga gaaggctt 288
<210> 10
<211> 288
<212> DNA
<213> 人線粒體DNA
<400> 10
gtttaccaca accaccaccc catcatactc tttcacccac agcaccaatc ctacctccat 60
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<210> 11
<211> 437
<212> DNA
<213> 人線粒體DNA
<400> 11
ggccaacctc ctactcctca ttgtacccat tctaatcgca atggcattcc taatgcttac 60
cgaacgaaaa attctaggct atatacaact acgcaaaggc cccaacgttg taggccccta 120
cgggctacta caacccttcg ctgacgccat aaaactcttc accaaagagc ccctaaaacc 180
cgccacatct accatcaccc tctacatcac cgccccgacc ttagctctca ccatcgctct 240
tctactatga acccccctcc ccatacccaa ccccctggtc aacctcaacc taggcctcct 300
atttattcta gccacctcta gcctagccgt ttactcaatc ctctgatcag ggtgagcatc 360
aaactcaaac tacgccctga tcggcgcact gcgagcagta gcccaaacaa tctcatatga 420
agtcacccta gccatca 437
<210> 12
<211> 435
<212> DNA
<213> 人線粒體DNA
<400> 12
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<210> 13
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