技術(shù)特征：

1.一種對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑，其特征在于：以菲并咪唑?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)，以活化的C＝C雙鍵為反應(yīng)活性基團(tuán)，其化學(xué)名稱是：2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式是：

2.一種權(quán)利要求1所述的對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的合成方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)將菲醌、對(duì)二苯甲醛加入到燒瓶中，再加入乙酸銨和乙酸，加熱回流進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，待溶液冷卻到室溫，抽濾，用乙酸洗滌得到的固體，抽濾得到的濾液加入到冰水中，攪拌得到黃色固體，將黃色固體與乙酸洗滌后的固體合并，得到中間產(chǎn)物4-苯并咪唑基苯甲醛；

(2)將步驟(1)得到的中間產(chǎn)物4-苯并咪唑基苯甲醛用無水乙腈溶解，加入碳酸鉀和氫氧化鉀加熱回流，降至室溫后，加入碘甲烷的無水乙腈溶液，升溫回流反應(yīng)，冷卻，過濾，將濾液收集后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸餾、純化得到中間產(chǎn)物4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛；

(3)將得到的中間產(chǎn)物4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛溶于無水吡啶中，升溫并攪拌，加入丙二腈反應(yīng)，反應(yīng)完成后，冷卻，過濾，得到紅色結(jié)晶物，即目標(biāo)產(chǎn)物2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基-苯亞甲基)丙二腈。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的合成方法，其特征在于：步驟(1)中，菲醌、對(duì)二苯甲醛、乙酸銨、乙酸的摩爾比是1:3:7:10。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的合成方法，其特征在于：步驟(1)中，回流反應(yīng)的時(shí)間為50分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的合成方法，其特征在于：步驟(2)中，碳酸鉀、氫氧化鉀、碘甲烷與中間產(chǎn)物4-苯并咪唑基苯甲醛的摩爾比為1:1:1.2:1。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的合成方法，其特征在于：步驟(2)中，加入碳酸鉀和氫氧化鉀加熱回流30分鐘，降至室溫后，加入碘甲烷的無水乙腈溶液，升溫回流反應(yīng)30分鐘。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的合成方法，其特征在于：步驟(3)中，丙二腈與中間產(chǎn)物4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛的摩爾比為1.5:1。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的合成方法，其特征在于：步驟(3)中，升溫至70℃并攪拌10分鐘，加入丙二腈反應(yīng)1小時(shí)。

9.一種權(quán)利要求1所述的對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的應(yīng)用，其特征在于：檢測(cè)細(xì)胞外源性HSO₃^-和ClO^-的濃度、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度以及熒光成像。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的對(duì)亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟：

一、檢測(cè)細(xì)胞外源性HSO₃^-和ClO^-的濃度：

(1)配制pH＝7.40，濃度為10mM的PBS緩沖鹽溶液；配制濃度為1mM的HSO₃^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為1mM的ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液及濃度為0.05mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液；

(2)分別取0μL、2.5μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、15μL、17.5μL、20μL、22.5μL、25μL濃度為1mM的HSO₃^-和ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液共22份，分別加入到熒光比色皿中，分別加入100μL濃度為10mM的PBS緩沖鹽溶液，然后再分別加入100μL濃度為0.05mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液，最后分別加入乙腈定容到1mL，混合均勻；

通過熒光分光光度計(jì)測(cè)試熒光強(qiáng)度，得到熒光強(qiáng)度比值，檢測(cè)ClO^-熒光強(qiáng)度的激發(fā)波長為440nm、檢測(cè)HSO₃^-熒光強(qiáng)度的激發(fā)波長分別為330nm、410nm；

(3)分別以HSO₃^-和ClO^-的濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)，得到關(guān)于細(xì)胞外源性HSO₃^-和ClO^-濃度、熒光強(qiáng)度比值的線性方程；

(4)將待測(cè)樣品與乙腈按體積比1:4混合后，取900mL，并向其中加入100μL濃度為0.05mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液，根據(jù)外源性HSO₃^-和ClO^-濃度、熒光強(qiáng)度比值的線性方程得到HSO₃^-和ClO^-的濃度；

二、用來檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度：

(1)配制濃度為1mM的HSO₃^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為1mM的ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液、濃度為1μg/ml的LPS溶液、濃度為1μg/ml的PMA溶液、濃度為1mM的SO₂donor溶液；

(2)將活細(xì)胞Hela細(xì)胞置入培養(yǎng)基中培育，共分別培養(yǎng)10組，每組培養(yǎng)基中接種量為2×10⁷～9×10⁷個(gè)/mL，培育24h，先分別加入10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液，再分別加入0μL、7.5μL、15μL、22.5μL、30μL濃度為1mM的HSO₃^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液和ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，于37℃共培育15min，置入共聚焦下觀測(cè)成像，收集不同顏色光通道的熒光強(qiáng)度，從而進(jìn)行熒光強(qiáng)度比值，得到關(guān)于細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度與熒光強(qiáng)度比值的線性方程；

(3)將活細(xì)胞Hela細(xì)胞置入培養(yǎng)基中培育，共分別培養(yǎng)4組，每組培養(yǎng)基中接種量為2×10⁷～9×10⁷個(gè)/mL，培育24h；

向第一組中加入100μL濃度為1μg/ml的LPS溶液、100μL濃度為1μg/ml的PMA溶液用來刺激細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的ClO^-，再加入10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液進(jìn)行培養(yǎng)，成像，第二組不加LPS和PMA，只加10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液作為對(duì)照；

向第三組中加入100μL濃度為1mM的SO₂donor用來刺激細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的HSO₃^-，再加入10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液進(jìn)行培養(yǎng)，成像，第四組不加SO₂donor，只加10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液作為對(duì)照；

置入共聚焦下觀測(cè)成像，收集不同顏色光通道的熒光強(qiáng)度，從而進(jìn)行熒光強(qiáng)度比值，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度與熒光強(qiáng)度比值的線性方程，從而得到細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度。