本發(fā)明涉及熒光標(biāo)記試劑，具體涉及一種對亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近十年來，一些生物小分子因廣泛參與生命體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡以及潛在的應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)而備受關(guān)注。在這其中，氧化還原平衡活性氧(ROS)和還原硫物種(RSS)在調(diào)節(jié)生物過程中扮演關(guān)鍵角色，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡，而其中代表性的物質(zhì)當(dāng)屬HSO₃^-和ClO^-。雖然近年來，人們都在廣泛討論這些生物小分子的反應(yīng)路徑，生理功能等各種性能，但是，這些物質(zhì)在生命系統(tǒng)中扮演的作用仍然有許多未知方面。因此，十分有必要建立一種即時的檢測方法對這些生物小分子完成區(qū)分和檢測。

到目前為止，高效液相色譜-質(zhì)譜、電化學(xué)分析、毛細(xì)管電泳分析、以及以有機(jī)探針和納米材料為基礎(chǔ)的熒光、拉曼等分析法用來檢測生物小分子被廣泛應(yīng)用。在這些分析方法中，熒光探針具有超高靈敏性，即時檢測以及應(yīng)用于生命有機(jī)體系等獨(dú)特優(yōu)勢。此外，相比較開關(guān)型熒光有機(jī)探針，比率型熒光探針大大減少受到來自外界環(huán)境、儀器設(shè)備等的影響。

最重要的是，當(dāng)前還沒有一種比率型熒光探針可用來同時檢測HSO₃^-和ClO^-，因此，本發(fā)明所提出的雙響應(yīng)熒光分子探針對于進(jìn)一步了解HSO₃^-和ClO^-在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)理有著深遠(yuǎn)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是一種標(biāo)記反應(yīng)迅速、對HSO₃^-和ClO^-選擇性高、檢測限極低、合成方法簡便的對亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑；本發(fā)明同時提供其合成方法和應(yīng)用。

本發(fā)明所述的對亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑，是以菲并咪唑為熒光基團(tuán)，以活化的C＝C雙鍵為反應(yīng)活性基團(tuán)，其化學(xué)名稱是：2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式是：

所述的對亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的合成方法，包括以下步驟：

(1)將菲醌、對二苯甲醛加入到燒瓶中，再加入乙酸銨和乙酸，加熱回流進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，待溶液冷卻到室溫，抽濾，用乙酸洗滌得到的固體，抽濾得到的濾液加入到冰水中，攪拌得到黃色固體，將黃色固體與乙酸洗滌后的固體合并，得到中間產(chǎn)物4-苯并咪唑基苯甲醛；

(2)將步驟(1)得到的中間產(chǎn)物4-苯并咪唑基苯甲醛用無水乙腈溶解，加入碳酸鉀和氫氧化鉀加熱回流，降至室溫后，加入碘甲烷的無水乙腈溶液，升溫回流反應(yīng)，冷卻，過濾，將濾液收集后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸餾、純化得到中間產(chǎn)物4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛；

(3)將得到的中間產(chǎn)物4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛溶于無水吡啶中，升溫并攪拌，加入丙二腈反應(yīng)，反應(yīng)完成后，冷卻，過濾，得到紅色結(jié)晶物，即目標(biāo)產(chǎn)物2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基-苯亞甲基)丙二腈(MPIBA)。

其中：

步驟(1)中，菲醌、對二苯甲醛、乙酸銨、乙酸的摩爾比是1:3:7:10。

步驟(1)中回流反應(yīng)的時間為50分鐘。

步驟(2)中，碳酸鉀、氫氧化鉀、碘甲烷與中間產(chǎn)物4-苯并咪唑基苯甲醛的摩爾比為1:1:1.2:1。

步驟(2)中，加入碳酸鉀和氫氧化鉀加熱回流30分鐘，降至室溫后，加入碘甲烷的無水乙腈溶液，升溫回流反應(yīng)30分鐘。

步驟(3)中，丙二腈與中間產(chǎn)物4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛的摩爾比為1.5:1。

步驟(3)中，升溫至70℃并攪拌10分鐘，加入丙二腈反應(yīng)1小時。

所述的對亞硫酸氫根和次氯酸根雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑的應(yīng)用，用于檢測細(xì)胞外源性HSO₃^-和ClO^-的濃度、檢測細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度以及熒光成像。

具體包括以下步驟：

一、檢測細(xì)胞外源性HSO₃^-和ClO^-的濃度：

(1)配制pH＝7.40，濃度為10mM的PBS緩沖鹽溶液；配制濃度為1mM的HSO₃^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為1mM的ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液及濃度為0.05mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液；

(2)分別取0μL、2.5μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、15μL、17.5μL、20μL、22.5μL、25μL濃度為1mM的HSO₃^-和ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液共22份，分別加入到熒光比色皿中，分別加入100μL濃度為10mM的PBS緩沖鹽溶液，然后再分別加入100μL濃度為0.05mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液，最后分別加入乙腈定容到1mL，混合均勻；

通過熒光分光光度計測試熒光強(qiáng)度，得到熒光強(qiáng)度比值，檢測ClO^-熒光強(qiáng)度的激發(fā)波長為440nm、檢測HSO₃^-熒光強(qiáng)度的激發(fā)波長分別為330nm、410nm；

(3)分別以HSO₃^-和ClO^-的濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)，得到關(guān)于細(xì)胞外源性HSO₃^-和ClO^-濃度、熒光強(qiáng)度比值的線性方程；

(4)將待測樣品與乙腈按體積比1:4混合后，取900mL，并向其中加入100μL濃度為0.05mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液，根據(jù)外源性HSO₃^-和ClO^-濃度、熒光強(qiáng)度比值的線性方程得到HSO₃^-和ClO^-的濃度；

二、用來檢測活細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度：

(1)配制濃度為1mM的HSO₃^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為1mM的ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液、濃度為1μg/ml的LPS溶液、濃度為1μg/ml的PMA溶液、濃度為1mM的SO₂donor溶液；

(2)將活細(xì)胞Hela細(xì)胞置入培養(yǎng)基中培育，共分別培養(yǎng)10組，每組培養(yǎng)基中接種量為2×10⁷～9×10⁷個/mL，培育24h，先分別加入10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液，再分別加入0μL、7.5μL、15μL、22.5μL、30μL濃度為1mM的HSO₃^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液和ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，于37℃共培育15min，置入共聚焦下觀測成像，收集不同顏色光通道的熒光強(qiáng)度，從而進(jìn)行熒光強(qiáng)度比值，得到關(guān)于細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度與熒光強(qiáng)度比值的線性方程；

(3)將活細(xì)胞Hela細(xì)胞置入培養(yǎng)基中培育，共分別培養(yǎng)4組，每組培養(yǎng)基中接種量為2×10⁷～9×10⁷個/mL，培育24h；

向第一組中加入100μL濃度為1μg/ml的LPS溶液、100μL濃度為1μg/ml的PMA溶液用來刺激細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的ClO^-，再加入10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液進(jìn)行培養(yǎng)，成像，第二組不加LPS和PMA，只加10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液作為對照；

向第三組中加入100μL濃度為1mM的SO₂donor用來刺激細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的HSO₃^-，再加入10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液進(jìn)行培養(yǎng)，成像，第四組不加SO₂donor，只加10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液作為對照；

置入共聚焦下觀測成像，收集不同顏色光通道的熒光強(qiáng)度，從而進(jìn)行熒光強(qiáng)度比值，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度與熒光強(qiáng)度比值的線性方程，從而得到細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本發(fā)明的比率型熒光標(biāo)記試劑是以菲并咪唑為母體環(huán)，以受活化的C＝C雙鍵為反應(yīng)位點(diǎn)，使探針對HSO₃^-和ClO^-有優(yōu)越的選擇性，并且會有明顯的熒光信號讀出。

(2)本發(fā)明的比率型熒光標(biāo)記試劑響應(yīng)靈敏，對ClO^-的響應(yīng)時間在數(shù)秒內(nèi)，對HSO₃^-的響應(yīng)在40s以內(nèi)。

(3)本發(fā)明的比率型熒光標(biāo)記試劑檢測限低，相比較于商業(yè)化的熒光標(biāo)記試劑，本發(fā)明所提出的對HSO₃^-和ClO^-的檢測限分別為3.5nm/L和7.5nm/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞內(nèi)這兩種物質(zhì)存在的含量。

(4)本發(fā)明的比率型熒光標(biāo)記試劑，相比較開關(guān)型熒光標(biāo)記試劑，以熒光強(qiáng)度的比值為基準(zhǔn)，而不是直接熒光強(qiáng)度，會大大減少來自外界環(huán)境以及儀器等等的影響。

(5)本發(fā)明是目前為止第一種用來同時區(qū)分和檢測HSO₃^-和ClO^-的有機(jī)熒光探針。

(6)由于反應(yīng)后紫外顏色的變化，可供裸眼檢測，方便快捷。

(7)本發(fā)明應(yīng)用于活細(xì)胞的檢測，進(jìn)一步推動了生物小分子在生命體中作用的探究。

附圖說明

圖1是MPIBA的合成路線圖；

圖2是實(shí)施例1中的質(zhì)譜圖；

其中：A、MPIBA的質(zhì)譜圖；B、MPIBA與ClO^-反應(yīng)的質(zhì)譜圖；C、MPIBA與HSO₃^-反應(yīng)的質(zhì)譜圖；

圖3是實(shí)施例1中MPIBA的核磁H譜；

圖4是實(shí)施例1中MPIBA的核磁C譜；

圖5是MPIBA對HSO₃^-的熒光強(qiáng)度及線性方程圖；

圖6是MPIBA對ClO^-的熒光強(qiáng)度及線性方程圖；

圖7是樣品檢測的熒光圖；

其中：A、檢測雨水中HSO₃^-濃度的熒光圖；B、檢測自來水中ClO^-濃度的熒光圖；

圖8是MPIBA對HSO₃^-分子的選擇性研究分析及比色圖；

其中：A、HSO₃^-對金屬離子；B、HSO₃^-對陰離子其他還原類硫物種；

圖9是MPIBA對ClO^-分子的選擇性研究分析及比色圖；

其中：A、ClO^-對金屬離子；B、ClO^-對陰離子其他活性氧和活性氮；

圖10是探究pH值對MPIBA與物質(zhì)反應(yīng)效果的影響圖；

其中：A、HSO₃^-；B、ClO^-；

圖11是探究MPIBA對物質(zhì)的響應(yīng)時間圖；

其中：A、HSO₃^-；B、ClO^-；

圖12是細(xì)胞內(nèi)熒光線性方程圖；

其中：A、HSO₃^-；B、ClO^-；

圖13是檢測內(nèi)源性相關(guān)細(xì)胞圖；

其中：A、HSO₃^-；B、ClO^-；

圖14是細(xì)胞存活率柱狀圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1

如圖1所示，本發(fā)明的對HSO₃^-和ClO^-雙響應(yīng)比率型熒光標(biāo)記試劑合成步驟有3步，以菲醌和對二苯甲醛為原料，具體合成操作如下：

(1)中間體4-苯并咪唑基苯甲醛的合成：

在50ml的圓底燒瓶中加入600mg對二苯甲醛，315mg菲醌和2.15g的乙酸銨，然后加入25ml的冰乙酸，攪拌加熱至回流50分鐘，冷卻到室溫，抽濾得到固體，用冰乙酸洗滌得到的固體，抽濾得到的濾液倒入冰水中攪拌，攪拌得到黃色固體，過濾并且合并前面洗滌后的固體，得到中間體4-苯并咪唑基苯甲醛395.5mg，產(chǎn)率為96％。

(2)中間體4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛的合成：

在100ml圓底燒瓶中加入30ml無水乙腈，再加入336mg中間體4-苯并咪唑基苯甲醛，56mg KOH，150mg K₂CO₃，攪拌加熱至回流30分鐘，降溫至室溫后用恒壓滴液漏斗加入溶有0.1ml CH₃I的乙腈溶液，滴加完畢，升溫至回流狀態(tài)反應(yīng)30分鐘，冷卻過濾，收集濾液并旋蒸，粗產(chǎn)品進(jìn)一步純化，以(v正己烷：v乙酸乙酯＝10:1)為洗脫劑，得黃綠色固體4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛280mg，產(chǎn)率80.5％。

(3)目標(biāo)產(chǎn)物2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈(MPIBA)的合成：

取176mg中間產(chǎn)物4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛放入25ml圓底燒瓶中，溶于10ml無水吡啶中，升溫至70℃并攪拌10分鐘，加入丙二腈0.05ml再反應(yīng)1小時，待稍冷卻放入冰箱，待固體析出后，直接過濾得紅色針狀固體，即為目標(biāo)產(chǎn)物2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基-苯亞甲基)丙二腈，158mg，產(chǎn)率78.3％。

中間體4-苯并咪唑基苯甲醛表征如下：

1H NMR(DMSO-d6,500MHz),δ(ppm):10.141(s,1H),8.86(d,J＝8.5Hz,2H),8.62(d,J＝4.5Hz,2H),8.15(q,J＝8.5Hz,4H),7.79(q,J＝7.5Hz,2H),7.68(d,J＝7.0Hz,2H),),2.953(s,N-H,1H).

13C NMR(DMSO-d6,500MHz),δ(ppm):(193.42,151.33,130.75,130.20,127.91,127.71,126.97,126.22,125.98,124.94,124.10,122.35,121.97.MS m/z calcd for 322.37[M+H]+found 323.5.

中間體4-甲基-苯并咪唑基苯甲醛表征如下：

1H NMR(DMSO-d6,500MHz),δ(ppm):4.52(s，3H)7.67(m,2H),7.77(m,2H),8.14(d,J＝8.4Hz,2H),8.53(d,J＝8.4Hz,2H),8.57(d,J＝7.6Hz,1H),8.63(d,J＝7.6Hz,1H),8.86(d,J＝8.4Hz,1H),8.90(d,J＝8.4Hz,1H),10.10(s,1H).

¹³C NMR(DMSO-d6,500MHz),δ(ppm):(193.37,151.22,130.75,130.19,127.87,127.68,126.16,125.92,124.98,124.14,123.53,122.35,122.01)MS m/z calcd for 336.1[M+H]⁺found 336.5.

目標(biāo)產(chǎn)物2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基-苯亞甲基)丙二腈表征如下：

1H NMR(DMSO-d6,500MHz),δ(ppm):9.0(d,J＝8.5Hz,H),8.89(d,J＝8.5Hz,2H),8.66(d,J＝7.5Hz,2H),8.62(d,J＝6.5Hz,1H),8.59(d,J＝5.5Hz,2H),7.80(d,J＝8.0Hz,2H),7.75(d,J＝3.0Hz,2H),7.68(d,J＝3.0Hz,H),7.40(d,J＝3.0Hz,H),4.37(s,3H,N-CH₃)

¹³C NMR(DMSO-d6,500MHz),δ(ppm):(161.01,150.98,137.47,131.24,,130.74,127.90,127.72,126.24,125.00,122.36,122.07,113.74,82.53,36.90.MS m/z calcd for 384.1[M+H]⁺found 384.8.

將MPIBA進(jìn)行質(zhì)譜檢測，具體見圖2，其中，A是MPIBA的質(zhì)譜圖，B是MPIBA與ClO^-反應(yīng)的質(zhì)譜圖，C是MPIBA與HSO₃^-反應(yīng)的質(zhì)譜圖。

將MPIBA進(jìn)行核磁共振檢測，具體見圖3-4，其中，圖3是MPIBA的核磁H譜，圖4是MPIBA的核磁C譜。

實(shí)施例2

檢測細(xì)胞外源性HSO₃^-和ClO^-的濃度：

(1)配制pH＝7.40，濃度為10mM的PBS緩沖鹽溶液；配制濃度為1mM的HSO₃^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為1mM的ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液及濃度為0.05mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液；

(2)分別取0μL、2.5μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、15μL、17.5μL、20μL、22.5μL、25μL濃度為1mM的HSO₃^-和ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液共22份，分別加入到熒光比色皿中，分別加入100μL濃度為10mM的PBS緩沖鹽溶液，然后再分別加入100μL濃度為0.05mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液，最后分別加入乙腈定容到1mL，混合均勻；

通過熒光分光光度計測試熒光強(qiáng)度，得到熒光強(qiáng)度比值，檢測ClO^-熒光強(qiáng)度的激發(fā)波長為440nm、檢測HSO₃^-熒光強(qiáng)度的激發(fā)波長分別為330nm、410nm；

(3)分別以HSO₃^-和ClO^-的濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)，得到關(guān)于細(xì)胞外源性HSO₃^-和ClO^-濃度、熒光強(qiáng)度比值的線性方程；圖5是MPIBA對HSO₃^-的熒光強(qiáng)度及線性方程圖，其中，A、B是加入0-22.5μM的HSO₃^-的熒光圖，C是HSO₃^-熒光線性方程圖。圖6是MPIBA對ClO^-的熒光強(qiáng)度及線性方程圖；其中，A是加入0-22.5μM的ClO^-的熒光圖，B是ClO^-熒光線性方程圖。

(4)將待測樣品與乙腈按體積比1:4混合后，取900mL，并向其中加入100μL濃度為0.05mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液，根據(jù)外源性HSO₃^-和ClO^-濃度、熒光強(qiáng)度比值的線性方程得到HSO₃^-和ClO^-的濃度。

實(shí)施例3

利用MPIBA檢測雨水中的HSO₃^-和自來水中的ClO^-的含量。

將待測雨水樣品和無水乙腈按體積比1:4混合，取所得液900mL，并向其中加入100μL濃度為0.05mM的MPIBA，所得溶液在室溫下保存1min，根據(jù)實(shí)施例2熒光強(qiáng)度計算得到雨水樣品中含有HSO₃^-的含量，將所得熒光強(qiáng)度值(從圖7A中得到)帶入圖5C所建立的熒光線性，所得數(shù)值為1.9mM，即雨水中的HSO₃^-含量為10.5mM。

將待測自來水樣品和無水乙腈按體積比1:4混合，取所得液900mL，并向其中加入100μL濃度為0.05mM的MPIBA，所得溶液在室溫下保存1min，根據(jù)實(shí)施例2熒光強(qiáng)度判斷自來水樣品中是否含有ClO^-，將所得熒光強(qiáng)度值(從圖7B中得到)帶入圖6B所建立的熒光線性，所得數(shù)值為2.3mM，即自來水中的ClO^-含量為12.5mM。

圖7是樣品檢測的熒光圖。其中，A為檢測雨水中HSO₃^-濃度的熒光圖，B為檢測自來水中ClO^-濃度的熒光圖。

實(shí)施例4

為探究MPIBA對HSO₃^-的選擇性，一些代表性的陰離子Cl^-、Br^-、I^-、CH₃COO^-、ClO₄^-、SO₄²、H₂PO₄^-、S₂O₃^2-、SCN^-、還原硫物種HS^-、GSH、Cys、Hcy和金屬離子Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、Zn²⁺加入給予探究。從圖8可以看到，數(shù)倍HSO₃^-濃度的離子加入到MPIBA中，造成的影響可以忽略不計。在365nm紫外燈下，當(dāng)HSO₃^-加入可以發(fā)現(xiàn)紅色熒光消失，藍(lán)色熒光出現(xiàn)。圖8中，A為金屬離子對MPIBA選擇性影響，小瓶為在365nm紫外燈下加入干擾性離子溶液的現(xiàn)象，B為一些RSS，常見陰離子對探針選擇性研究，小瓶為相應(yīng)加入干擾離子溶液在365nm紫外燈下的現(xiàn)象。

同樣，為了探究MPIBA對ClO^-的選擇性，除了相同金屬離子，活性氧(ROS)、活性氮(RNS)，包括H₂O₂、OH、TBHP、TBO^-、KO₂、ONOO^-、NO₂^-、NO₃^-、NO加入到溶液中。從圖9可以看出，即使數(shù)倍于ClO^-濃度的干擾離子加入，造成的影響也可忽略不計。同樣在365nm的紫外燈下，當(dāng)ClO^-加入可以發(fā)現(xiàn)紅色熒光變?yōu)榫G色熒光。圖9中，A為金屬離子對探針選擇性影響，小瓶為在365nm紫外燈下加入干擾性離子溶液的現(xiàn)象，B為一些ROS、RNS對MPIBA選擇性研究，小瓶為相應(yīng)加入干擾離子溶液在365nm紫外燈下的現(xiàn)象。

為了探究pH值對熒光比率的影響，在加入探針和檢測物的物質(zhì)的量一定的情況下，讓反應(yīng)在pH為4.0-10.0的區(qū)間內(nèi)反應(yīng)，探究最優(yōu)的反應(yīng)環(huán)境。正如圖10A所顯示的熒光比率值在pH為6.0-10.0的環(huán)境中維持在一個較高水平，這說明在中性和弱堿性的環(huán)境中測量是較優(yōu)環(huán)境，這和HSO₃^-的pka為7.20是相吻合的。同樣如圖10B所示，在pH為4.0-6.0間，反應(yīng)活性比較低，當(dāng)pH處于6.0-10.0環(huán)境中時，反應(yīng)比率明顯升高。

圖11是探究MPIBA對物質(zhì)的響應(yīng)時間圖，其中A為MPIBA加上HSO₃^-的響應(yīng)時間圖，B為MPIBA加上ClO^-的響應(yīng)時間圖。

實(shí)施例5

利用MPIBA檢測細(xì)胞內(nèi)源性的HSO₃^-和ClO^-的濃度：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：本實(shí)驗選擇Hela細(xì)胞，將復(fù)蘇好的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基包含10％牛胚胎血清、1％雙抗、89％DMEM、在37℃，5％CO₂的環(huán)境中培養(yǎng)24h,得到長勢良好的細(xì)胞待用，共分別培養(yǎng)14組，每組培養(yǎng)基中接種量為2×10⁷～9×10⁷個/mL；

(2)細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度與熒光強(qiáng)度比值的線性方程的建立：

①配制濃度為1mM的HSO₃^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為1mM的ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃度為0.5mM的MPIBA的乙腈溶液、濃度為1μg/ml的LPS溶液、濃度為1μg/ml的PMA溶液、濃度為1mM的SO₂donor溶液；

②取10組培養(yǎng)基，先分別加入10μL濃度為0.5mM的2-(4-(1-甲基-1H菲并[9,10d]咪唑-2基)-苯亞甲基)丙二腈的乙腈溶液，再分別加入0μL、7.5μL、15μL、22.5μL、30μL濃度為1mM的HSO₃^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液和ClO^-的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，于37℃共培育15min，置入共聚焦下觀測成像，收集不同顏色光通道的熒光強(qiáng)度，從而進(jìn)行熒光強(qiáng)度比值，得到關(guān)于細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度與熒光強(qiáng)度比值的線性方程。

圖12A為細(xì)胞內(nèi)HSO₃^-濃度與熒光比率(藍(lán)色熒光強(qiáng)度比紅色熒光強(qiáng)度)的線性方程。圖12B為細(xì)胞內(nèi)ClO^-濃度與熒光強(qiáng)度比率(綠色熒光強(qiáng)度比紅色熒光強(qiáng)度)的線性方程。

(3)細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生的HSO₃^-和ClO^-的含量的檢測：

取4組培養(yǎng)基，向第一組中加入100μL濃度為1μg/ml的LPS溶液、100μL濃度為1μg/ml的PMA溶液用來刺激細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的ClO^-，再加入10μL濃度為0.5mM的MPIBA的乙腈溶液進(jìn)行培養(yǎng)，成像，第二組不加LPS和PMA，只加10μL濃度為0.5mM的MPIBA的乙腈溶液作為對照；圖12B即為內(nèi)源性檢測ClO^-的相關(guān)細(xì)胞圖。

向第三組中加入100μL濃度為1mM的SO₂donor用來刺激細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的HSO₃^-，再加入10μL濃度為0.5mM的MPIBA的乙腈溶液進(jìn)行培養(yǎng)，成像，第四組不加SO₂donor，只加10μL濃度為0.5mM的MPIBA的乙腈溶液作為對照；圖12A即為內(nèi)源性檢測HSO₃^-相關(guān)細(xì)胞圖。

置入共聚焦下觀測成像，收集不同顏色光通道的熒光強(qiáng)度，從而進(jìn)行熒光強(qiáng)度比值，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度與熒光強(qiáng)度比值的線性方程，從而得到細(xì)胞內(nèi)源性HSO₃^-和ClO^-的濃度。

圖13A為內(nèi)源性HSO₃^-的細(xì)胞圖，圖中從左到右為紅色通道，藍(lán)色通道，明場，重疊，比率，圖13B為內(nèi)源性ClO^-的細(xì)胞圖，圖中從左到右為綠色通道，紅色通道，明場，重疊，比率。

實(shí)施例6

細(xì)胞存活率實(shí)驗：

細(xì)胞存活率的實(shí)驗主要驗證MPIBA毒性對細(xì)胞壽命的影響。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的MPIBA探針(0M，5M，10M，20M，30M and 50M)，在37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,接著25μL的4-甲基噻唑基四唑MTT(5mg mL^-1)加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)4個小時。結(jié)果通過MTT比色皿法來評估細(xì)胞存活率。以不加MPIBA的那組細(xì)胞存活為100％，不同濃度MPIBA加入的實(shí)驗組相關(guān)數(shù)據(jù)，繪制相對柱狀圖14。

本發(fā)明實(shí)施例中高效液相-質(zhì)譜分析是利用Agilent 1100質(zhì)譜系統(tǒng)(Agilent,USA)，并配備脫氣裝置、四元泵、自動進(jìn)樣器，高效液相色譜分離是借助Hypersil GOLD C18柱(2.1mm×50mm,1.8μm i.d.,Agilent,USA)來完成。熒光檢測是利用日立Hitachi F-4600熒光光譜儀來進(jìn)行，對ClO^-檢測激發(fā)波長為420nm，對HSO₃^-的檢測激發(fā)分別為330和440nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10.0nm，電壓400V，掃描速度2400納米/分。熒光成像觀測是通過Olympus Fluo View FV1000(日本)共聚焦來進(jìn)行，用40倍物鏡觀察?；衔锏姆蛛x純化是采用薄層色譜硅膠柱實(shí)現(xiàn)，其中，填料為300-400目。