本發(fā)明涉及一種肽的制備，尤其是一種利用海洋生物制取復(fù)合降血壓肽的方法。

背景技術(shù)：

降血壓肽，又稱(chēng)為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme, EC3.4.15.1, 簡(jiǎn)稱(chēng)ACE)抑制肽，是從食物蛋白中分離出的一類(lèi)具有顯著降低血壓功效的肽，通常為小分子肽。在眾多降壓物質(zhì)中，降血壓肽因其無(wú)毒副作用的降壓功能成為活性肽研究的熱點(diǎn)。從天然食物蛋白中分離的降血壓肽，雖然降壓效果不如合成藥物那么強(qiáng)烈，但其具有安全性高，只對(duì)高血壓患者起到降壓作用，對(duì)血壓正常者無(wú)降壓作用，不會(huì)有降壓過(guò)度現(xiàn)象發(fā)生。現(xiàn)在已經(jīng)從乳酪蛋白中的干酪素、乳清蛋白等；動(dòng)植物蛋白中的雞肉、明膠、豬肉、雞蛋、蕎麥、玉米、椰菜、大蒜等；魚(yú)貝藻類(lèi)蛋白中的沙丁魚(yú)、金槍魚(yú)、鱔魚(yú)頭、牡蠣、裙帶菜等許多食品中分離出ACE抑制劑；國(guó)內(nèi)的研究者還從中國(guó)傳統(tǒng)的食品即墨老酒，豆腐乳中發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，海參富含多糖、海參素、海參皂甙、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、硒、鋅、鐵、碘、鈣、超氧化物歧化酶（SOD）、硫酸軟骨素等50多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，海參水解肽也具有一定的ACE抑制活性，是潛在的降血壓物質(zhì)。另外，海蜇種類(lèi)多，數(shù)量大，在我國(guó)分布廣，是海洋浮游動(dòng)物群落的重要組成部分。海蟄體內(nèi)含有較高的蛋白質(zhì)及鈣、磷、碘、鐵等無(wú)機(jī)鹽，素有“水產(chǎn)瑰寶”之美稱(chēng)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，海蜇具有擴(kuò)張血管，降血壓之功效。另外，中國(guó)毛蝦為我國(guó)特有種類(lèi)，我國(guó)沿海均有分布，尤以渤海沿岸產(chǎn)量最多。而毛蝦中的氨基酸中含有與降血壓肽結(jié)構(gòu)有關(guān)的支鏈氨基酸和芳香族氨基酸，中國(guó)毛蝦是降壓物質(zhì)提取的良好原料。另外，海帶含有藻膠酸、昆布素，半乳聚糖等多糖類(lèi)，海帶氨酸、谷氨酸、天門(mén)冬氨酸，脯氨酸等氨基酸，維生素B1、B2、C、P及胡蘿卜素，碘、鉀、鈣等無(wú)機(jī)鹽。中醫(yī)認(rèn)為，海帶具有軟堅(jiān)散結(jié)、消痰平喘、通行利水、祛脂降壓等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，從海帶里提取出的褐藻氨酸和甘露醇具有降壓作用。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于降血壓肽的研究主要集中在肽的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和活性評(píng)價(jià)方面。如何確定最佳、優(yōu)化的酶解條件及對(duì)降血壓肽提高分離提取效率是一個(gè)亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。同時(shí)，目前，還未見(jiàn)有利用多種海洋生物制取復(fù)合降血壓肽的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種利用海洋生物制取復(fù)合降血壓肽的方法。該方法的原料選取科學(xué)、工藝合理、操作簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)、分離提取效率高，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。依照該方法制取所得的復(fù)合降血壓肽，具有良好的降壓功效。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種利用海洋生物制取復(fù)合降血壓肽的方法，其是選取海參、海蟄、海帶和中國(guó)毛蝦為原料，按重量百分比稱(chēng)?。汉?～10%、海蟄50～65%、海帶10～25%和中國(guó)毛蝦10～20%分別進(jìn)行脫鹽、軟化處理；再分別經(jīng)打漿后加入10～30倍的純凈水過(guò)膠體磨制成漿狀物；漿狀物加熱滅除微生物；冷卻后進(jìn)行酶解處理，加熱滅酶；冷卻后離心去除不溶物，取上清液通過(guò)管式膜過(guò)濾脫除大分子；濾過(guò)液通過(guò)截留分子質(zhì)量為3000Dalton的有機(jī)膜分級(jí)，收集3000Dalton以下的截留液；截留液納濾濃縮脫鹽，干燥，復(fù)配，得復(fù)合降血壓肽。

本發(fā)明選取海參、海蟄、海帶和中國(guó)毛蝦為原料，將每一原料分別經(jīng)脫鹽、軟化處理，再分別經(jīng)加水磨漿，加熱滅除微生物；冷卻后酶解，滅酶；離心，取上清液再分別經(jīng)管濾、超濾、納濾，干燥，復(fù)配，得復(fù)合降血壓肽。本發(fā)明是科學(xué)合理的選取具有降壓功能的海參、海蟄、海帶和中國(guó)毛蝦為原料，經(jīng)過(guò)酶解、管濾、超濾、納濾將具有ACE抑制活性的小分子肽分離出來(lái)，并保存了其完好的結(jié)構(gòu)和有效的生物活性。實(shí)驗(yàn)表明，采用該工藝分離出的降血壓肽成分復(fù)配后，經(jīng)原發(fā)性高血壓大鼠實(shí)驗(yàn)，能顯著地降低大鼠舒張壓。該方法中確定了最佳優(yōu)化的酶解技術(shù)方案，所采用的管濾、超濾、納濾分離提取技術(shù)，使其提取的效率高。本發(fā)明的利用海洋生物制取復(fù)合降血壓肽的方法工藝合理、操作簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

一種利用海洋生物制取復(fù)合降血壓肽的方法，其具體工藝步驟如下：

a、原料的選取與處理 選取海參、海蟄、海帶和中國(guó)毛蝦為原料，按重量百分比稱(chēng)取：海參5～10%、海蟄50～65%、海帶10～25%和中國(guó)毛蝦10～20%分別放入冷水中浸泡24h以上，去除鹽分，洗凈，撈出瀝干水分，分別使用打漿機(jī)進(jìn)行打漿處理，之后加入10～30倍的純凈水采用膠體磨將物料細(xì)化處理，得海參漿狀物、海蟄漿狀物、海帶漿狀物和中國(guó)毛蝦漿狀物；

b、酶解 將步驟(a)所得到的海參漿狀物、海蟄漿狀物、海帶漿狀物和中國(guó)毛蝦漿狀物加熱至溶液中心溫度為95～100℃，保持10min，滅除微生物；然后進(jìn)行酶解處理，其中各漿狀物酶解的條件為：

將海參漿狀物溫度調(diào)節(jié)至50～55℃加入復(fù)合蛋白酶，其用量為海參重量的3～10‰，酶解1～2h后，加入風(fēng)味蛋白酶，其用量為海參重量的2～10‰，酶解2～3h，得海參酶解液；

將海蟄漿狀物溫度調(diào)節(jié)至35～40℃，調(diào)節(jié)pH值3～3.5，加入胃蛋白酶，其用量為海蜇重量的2～5‰，酶解2～5h后，調(diào)節(jié)溫度為45～50℃，pH值為5～5.5，加入木瓜蛋白酶，其用量為海蜇重量的4～8‰，酶解1～3h，得海蜇酶解液；

將海帶漿狀物溫度調(diào)節(jié)至45～55℃，加入纖維素酶、果膠酶和復(fù)合蛋白酶，酶解3～4h，得海帶酶解液；其中，所述的纖維素酶的用量為海帶重量的4～8‰、果膠酶的用量為海帶重量的2～6‰、復(fù)合蛋白酶的用量為海帶重量的3～10‰；

將中國(guó)毛蝦漿狀物溫度調(diào)節(jié)至45～55℃，調(diào)節(jié)pH值為9.5～10，加入堿性蛋白酶，其用量為中國(guó)毛蝦重量的的3～7‰，酶解1～2h后，調(diào)節(jié)pH值為6.5～7，加入風(fēng)味蛋白酶，其用量為中國(guó)毛蝦重量的2～10‰，酶解1～2h，得中國(guó)毛蝦酶解液；

c、滅酶 將步驟(b)所得到的海參酶解液、海蜇酶解液、海帶酶解液、中國(guó)毛蝦酶解液分別加熱至溶液中心溫度為95～100℃，保持10min，進(jìn)行滅酶處理，然后冷卻至4℃，靜置過(guò)夜；

d、離心 將步驟(c)得到的滅酶、冷卻、靜置的海參酶解液、海蜇酶解液、海帶酶解液、中國(guó)毛蝦酶解液分別采用離心機(jī)離心去除不溶物，并收集上清液；

e、膜過(guò)濾：將步驟(d) 得到的海參、海蜇、海帶、中國(guó)毛蝦上清液分別通過(guò)管式膜過(guò)濾脫除大分子，其管膜濾過(guò)液再分別通過(guò)孔徑大小為3000Dalton的有機(jī)膜截留分級(jí)，收集3000Dalton以下截留液；其3000Dalton以下的截留液通過(guò)納濾濃縮脫鹽，得納濾截留液；

f、干燥：將步驟(e)得到的海參、海蜇、海帶、中國(guó)毛蝦納濾截留液干燥，復(fù)配，制粉，得復(fù)合降血壓肽。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

一種利用海洋生物制取復(fù)合降血壓肽的方法，其具體工藝步驟如下：

a、原料的選取與處理 稱(chēng)取海參10kg、海蟄50kg、海帶25kg和中國(guó)毛蝦15kg為原料，分別放入冷水中浸泡36h，去除鹽分，洗凈，撈出瀝干水分，分別使用打漿機(jī)進(jìn)行打漿處理，之后加入20倍的純凈水采用膠體磨將物料細(xì)化處理，得海參漿狀物、海蟄漿狀物、海帶漿狀物和中國(guó)毛蝦漿狀物；

b、酶解 將步驟(a)所得到的海參漿狀物、海蟄漿狀物、海帶漿狀物和中國(guó)毛蝦漿狀物加熱至溶液中心溫度為100℃，保持10min，滅除微生物；然后進(jìn)行酶解處理，其中各漿狀物酶解的條件為：

將海參漿狀物溫度調(diào)節(jié)至55℃加入復(fù)合蛋白酶90g，酶解1h后，加入風(fēng)味蛋白酶20g，酶解3h，得海參酶解液；其中復(fù)合蛋白水解酶可為市購(gòu)的商品酶，如Protamex復(fù)合蛋白酶，也可以自行配制，配制的復(fù)合蛋白水解酶中含有木瓜蛋白酶和淀粉酶。本實(shí)施例采用的是自行配制復(fù)合蛋白水解酶；

將海蟄漿狀物溫度調(diào)節(jié)至37℃，調(diào)節(jié)pH值3，加入胃蛋白酶250g，酶解2h后，調(diào)節(jié)溫度為50℃，pH值為5，加入木瓜蛋白酶200g，酶解2h，得海蜇酶解液；

將海帶漿狀物溫度調(diào)節(jié)至50℃，加入纖維素酶200g、果膠酶100g和復(fù)合蛋白酶250g，酶解3h，得海帶酶解液；其中復(fù)合蛋白水解酶采用的是自行配制復(fù)合蛋白水解酶；

將中國(guó)毛蝦漿狀物溫度調(diào)節(jié)至50℃，調(diào)節(jié)pH值為10，加入堿性蛋白酶75g，酶解1.5h后，調(diào)節(jié)pH值為6.5，加入風(fēng)味蛋白酶150g，酶解1.5h，得中國(guó)毛蝦酶解液；

c、滅酶 將步驟(b)所得到的海參酶解液、海蜇酶解液、海帶酶解液、中國(guó)毛蝦酶解液分別加熱至溶液中心溫度為100℃，保持10min，進(jìn)行滅酶處理，然后冷卻至4℃，靜置過(guò)夜；

d、離心 將步驟(c)得到的滅酶、冷卻、靜置的海參酶解液、海蜇酶解液、海帶酶解液、中國(guó)毛蝦酶解液分別采用三足式離心機(jī)，控制轉(zhuǎn)速2000 rpm，離心去除不溶物，并收集上清液；

e、膜過(guò)濾：將步驟(d) 得到的海參、海蜇、海帶、中國(guó)毛蝦上清液分別通過(guò)管式膜過(guò)濾脫除大分子，其管膜濾過(guò)液再分別通過(guò)孔徑大小為3000Dalton的有機(jī)膜截留分級(jí)，收集3000Dalton以下截留液；其3000Dalton以下的截留液通過(guò)納濾濃縮脫鹽，得納濾截留液；

f、干燥：將步驟(e)得到的海參、海蜇、海帶、中國(guó)毛蝦納濾截留液噴霧干燥，復(fù)配，粉碎成粉，得復(fù)合降血壓肽。

實(shí)施例2

一種利用海洋生物制取復(fù)合降血壓肽的方法，其具體工藝步驟如下：

a、原料的選取與處理 稱(chēng)取海參5kg、海蟄65kg、海帶10kg和中國(guó)毛蝦20kg為原料，分別放入冷水中浸泡48h，去除鹽分，洗凈，撈出瀝干水分，分別使用打漿機(jī)進(jìn)行打漿處理，之后加入10倍的純凈水采用膠體磨將物料細(xì)化處理，得海參漿狀物、海蟄漿狀物、海帶漿狀物和中國(guó)毛蝦漿狀物；

b、酶解 將步驟(a)所得到的海參漿狀物、海蟄漿狀物、海帶漿狀物和中國(guó)毛蝦漿狀物加熱至溶液中心溫度為95℃，保持10min，滅除微生物；然后進(jìn)行酶解處理，其中各漿狀物酶解的條件為：

將海參漿狀物溫度調(diào)節(jié)至50℃加入復(fù)合蛋白酶25g，酶解2h后，加入風(fēng)味蛋白酶25g，酶解2.5h，得海參酶解液；其中復(fù)合蛋白水解酶可為市購(gòu)的Protamex復(fù)合蛋白酶；

將海蟄漿狀物溫度調(diào)節(jié)至35℃，調(diào)節(jié)pH值3.3，加入胃蛋白酶195g，酶解3h后，調(diào)節(jié)溫度為45℃，pH值為5.5，加入木瓜蛋白酶325g，酶解3h，得海蜇酶解液；

將海帶漿狀物溫度調(diào)節(jié)至55℃，加入纖維素酶40g、果膠酶60g和復(fù)合蛋白酶30g，酶解4h，得海帶酶解液；其中復(fù)合蛋白水解酶可為市購(gòu)的Protamex復(fù)合蛋白酶；

將中國(guó)毛蝦漿狀物溫度調(diào)節(jié)至45℃，調(diào)節(jié)pH值為9.5，加入堿性蛋白酶140g，酶解2h后，調(diào)節(jié)pH值為7，加入風(fēng)味蛋白酶200g，酶解2h，得中國(guó)毛蝦酶解液；

c、滅酶 將步驟(b)所得到的海參酶解液、海蜇酶解液、海帶酶解液、中國(guó)毛蝦酶解液分別加熱至溶液中心溫度為98℃，保持10min，進(jìn)行滅酶處理，然后冷卻至4℃，靜置過(guò)夜；

d、離心 將步驟(c)得到的滅酶、冷卻、靜置的海參酶解液、海蜇酶解液、海帶酶解液、中國(guó)毛蝦酶解液分別采用管式離心機(jī)，控制轉(zhuǎn)速2500 rpm，離心去除不溶物，并收集上清液；

e、膜過(guò)濾：將步驟(d) 得到的海參、海蜇、海帶、中國(guó)毛蝦上清液分別通過(guò)管式膜過(guò)濾脫除大分子，其管膜濾過(guò)液再分別通過(guò)孔徑大小為3000Dalton的有機(jī)膜截留分級(jí)，收集3000Dalton以下截留液；其3000Dalton以下的截留液通過(guò)納濾濃縮脫鹽，得納濾截留液；

f、干燥：將步驟(e)得到的海參、海蜇、海帶、中國(guó)毛蝦納濾截留液噴霧干燥，復(fù)配，粉碎成粉，得復(fù)合降血壓肽。

實(shí)施例3

一種利用海洋生物制取復(fù)合降血壓肽的方法，其具體工藝步驟如下：

a、原料的選取與處理 稱(chēng)取海參8kg、海蟄60kg、海帶22kg和中國(guó)毛蝦10kg為原料，分別放入冷水中浸泡24h，去除鹽分，洗凈，撈出瀝干水分，分別使用打漿機(jī)進(jìn)行打漿處理，之后加入30倍的純凈水采用膠體磨將物料細(xì)化處理，得海參漿狀物、海蟄漿狀物、海帶漿狀物和中國(guó)毛蝦漿狀物；

b、酶解 將步驟(a)所得到的海參漿狀物、海蟄漿狀物、海帶漿狀物和中國(guó)毛蝦漿狀物加熱至溶液中心溫度為100℃，保持10min，滅除微生物；然后進(jìn)行酶解處理，其中各漿狀物酶解的條件為：

將海參漿狀物溫度調(diào)節(jié)至52℃加入復(fù)合蛋白酶24g，酶解1.5h后，加入風(fēng)味蛋白酶70g，酶解2h，得海參酶解液；其中復(fù)合蛋白水解酶可為市購(gòu)的Protamex復(fù)合蛋白酶；

將海蟄漿狀物溫度調(diào)節(jié)至40℃，調(diào)節(jié)pH值3.5，加入胃蛋白酶120g，酶解3.5h后，調(diào)節(jié)溫度為48℃，pH值為5.2，加入木瓜蛋白酶480g，酶解1h，得海蜇酶解液；

將海帶漿狀物溫度調(diào)節(jié)至45℃，加入纖維素酶132g、果膠酶44g和復(fù)合蛋白酶110g，酶解3.5h，得海帶酶解液；其中復(fù)合蛋白水解酶可為市購(gòu)的Protamex復(fù)合蛋白酶；

將中國(guó)毛蝦漿狀物溫度調(diào)節(jié)至55℃，調(diào)節(jié)pH值為9.5，加入堿性蛋白酶30g，酶解1h后，調(diào)節(jié)pH值為7，加入風(fēng)味蛋白酶20g，酶解1h，得中國(guó)毛蝦酶解液；

c、滅酶 將步驟(b)所得到的海參酶解液、海蜇酶解液、海帶酶解液、中國(guó)毛蝦酶解液分別加熱至溶液中心溫度為100℃，保持10min，進(jìn)行滅酶處理，然后冷卻至4℃，靜置過(guò)夜；

d、離心 將步驟(c)得到的滅酶、冷卻、靜置的海參酶解液、海蜇酶解液、海帶酶解液、中國(guó)毛蝦酶解液分別采用三足式離心機(jī)，控制轉(zhuǎn)速3000 rpm，離心去除不溶物，并收集上清液；

e、膜過(guò)濾：將步驟(d) 得到的海參、海蜇、海帶、中國(guó)毛蝦上清液分別通過(guò)管式膜過(guò)濾脫除大分子，其管膜濾過(guò)液再分別通過(guò)孔徑大小為3000Dalton的有機(jī)膜截留分級(jí)，收集3000Dalton以下截留液；其3000Dalton以下的截留液通過(guò)納濾濃縮脫鹽，得納濾截留液；

f、干燥：將步驟(e)得到的海參、海蜇、海帶、中國(guó)毛蝦納濾截留液噴霧干燥，復(fù)配，粉碎成粉，得復(fù)合降血壓肽。