調(diào)節(jié)復合物SASPase-FLG2的肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從SASPase或FLG2、其片段或其同系物中分離出來的肽，該肽可以改變通過來自絲聚合蛋白-2的第一氨基酸序列和來自SASPase的第二氨基酸序列之間的相互作用而形成的復合物的三維構(gòu)像。
【專利說明】調(diào)節(jié)復合物SASPase-FLG2的肽
【技術領域】[0001]本發(fā)明涉及一種關于皮膚和/或其附屬物的新穎的美容靶點或治療靶點，還涉及其用于皮膚的生物標記物的用途，或用于篩選新的專用于皮膚和/或其附屬物的美容護理、治療護理或皮膚病學護理的活性劑的用途。
[0002]更具體地說，本發(fā)明涉及分別從絲聚合蛋白-2或FLG2和SASPase分離出的肽，所述肽能夠一起形成復合物，并且本發(fā)明涉及所述肽作為用于篩選關于皮膚和/或其附屬物的美容活性劑或治療活性劑的靶點的用途。
【背景技術】
[0003]詞語“皮膚和其附屬物”意思是整個身體的皮膚、頭皮、黏膜，尤其是嘴唇、體毛、頭發(fā)和指甲。更具體地說，本發(fā)明涉及身體的皮膚、頭皮、嘴唇、頭發(fā)和體毛。特別地，本發(fā)明涉及面部的皮膚、頸部皮膚、臂和前臂的皮膚、腿部的皮膚、和頭皮。更具體地說，術語“附屬物”表示頭發(fā)、體毛、指甲，尤其是頭發(fā)和體毛。
[0004]表皮通常分為構(gòu)成表皮的生發(fā)層的膠質(zhì)細胞基底層，位于生發(fā)層上的多面體細胞構(gòu)成的多層“刺狀”層，由含有明顯的細胞質(zhì)內(nèi)含物透明膠質(zhì)顆粒的扁平細胞構(gòu)成的I層至3層“顆粒”層，和最后的被稱為角化層(或角質(zhì)層)的上層組合，該上層組合由在其分化末期被稱為角質(zhì)細胞的角化細胞構(gòu)成。
[0005]角質(zhì)細胞為主要由含有細胞質(zhì)蛋白的纖維材料構(gòu)成、由角化包膜包圍的無核細胞。新的角化細胞經(jīng)歷了永久的生成以補償通過被稱為脫皮的機理而來自于角化層的表皮細胞的連續(xù)的損失。導致角質(zhì)層的形成和其消除的整個過程是在多種激素因子或細胞因子的控制下精細調(diào)節(jié)的對象。這些因子的失調(diào)，如果沒有快速調(diào)節(jié)，到最后導致基底層中細胞增殖和/或分化的功能紊亂，或脫皮的功能紊亂。
[0006]皮膚和其附屬物的許多缺陷或紊亂可與此類改變關聯(lián)。
[0007]因此，相對于脫皮，當表皮的基底層的細胞的增殖和/或分化加速時，那么角質(zhì)層傾向于變厚。根據(jù)其表現(xiàn)的程度，這種功能紊亂可與各種美學缺陷(如皮膚老化的體征、表皮屏障功能紊亂、或皮膚干燥的體征)有關，或者在適當情況下，與各種病理紊亂(例如，角化過度、干燥病、魚鱗癬、牛皮癬或反應性角化過度)有關。
[0008]相反，相對于脫皮，基底層的細胞的增殖和/或分化減慢可以通過使表皮、尤其角化層變薄而顯現(xiàn)出其本身。根據(jù)其表現(xiàn)的程度，這種功能紊亂可與各種美學缺陷(如愈合缺陷、或尤其在皮膚用力擦洗或去角質(zhì)處理后的再上皮化缺陷)有關，或者在適當情況下，與各種病理紊亂(例如，通常由皮膚與一種或多種外源試劑接觸而誘導的免疫起源反應)有關。
[0009]為角質(zhì)層形成的基礎的激素的、細胞的或分子的機理的各種失調(diào)可與這些紊亂有關。
[0010]例如，F(xiàn)R2842209描述了 SASPase蛋白質(zhì)在表皮中的表達，和其在治療皮膚紊亂中作為靶點的用途。然而，SASPase在表皮中的表達的檢測只是整套涉及表皮體內(nèi)平衡的機理的一個因素，這些機理的許多方面仍然有待確定。
[0011]因此，仍然需要更加精確地確定涉及表皮體內(nèi)平衡、尤其涉及表皮細胞的增殖和/或分化的因子的性質(zhì)和作用。
[0012]尤其，需要確定能夠調(diào)節(jié)SASPase的蛋白水解活性的試劑的性質(zhì)。
[0013]仍然需要識別和提供關于皮膚和/或其附屬物的新的美容靶點或治療靶點，尤其是涉及表皮細胞的增殖和/或分化的美容靶點或治療靶點。
[0014]仍然需要識別和提供用于篩選能夠調(diào)節(jié)表皮細胞的增殖和/或分化的活性化合物的新的工具，該工具同時是快速的、靈敏的、易于使用和便宜的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的是滿足這些需要。
[0016]因此，根據(jù)第一主題，本發(fā)明涉及一種分離的肽，該分離的肽由選自SEQ IDN0.:9、SEQ ID N0.: 16、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物的氨基酸序列表示，所述氨基酸序列能夠改變由來自絲聚合蛋白-2的第一氨基酸序列和來自SASPase的第二氨基酸序列的相互作用而形成的復合物的三維構(gòu)象。
[0017]出乎意料的是，發(fā)明人已證明以單體或二聚物形式的絲聚合蛋白-2和SASPase通過親和力彼此結(jié)合，以一起形成蛋白質(zhì)復合物。尤其，發(fā)明人已識別了在絲聚合蛋白-2和SASPase中，涉及該結(jié)合和蛋白質(zhì)復合物的形成的明確的氨基酸序列。
[0018]更重要的是，發(fā)明人已證明絲聚合蛋白-2與SASPase的結(jié)合增強了 SASPase的蛋白水解活性，并且證明該活性也可以通過來自于絲聚合蛋白-2的特定的肽來調(diào)節(jié)。
[0019]為了本發(fā)明的目的，術語“相互作用”意思是在兩個氨基酸序列之間通過親和力形成一個或多個鍵，以致形成在生理學上可接受的條件下能夠保持穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或肽復合物。在本發(fā)明中，無區(qū)別地使用術語“相互作用”和“結(jié)合”。
[0020]為了本發(fā)明的目的，復合物的“三維構(gòu)象”這一術語意思是當彼此相互作用時組成該復合物的氨基酸序列的空間排列。
[0021] 為了本發(fā)明的目的，復合物的三維構(gòu)象的“改變”這一術語意思是改變復合物中的氨基酸序列的空間排列，或改變這些序列中的兩者或一者的三維結(jié)構(gòu)。
[0022]這些改變可以導致復合物的整體形狀的改變(也稱為變構(gòu)改變)和/或在自由氨基酸序列和彼此結(jié)合的氨基酸序列之間的熱力平衡的改變。這些改變導致復合物的生物活性的增強、降低或穩(wěn)定。
[0023]優(yōu)選地，這些改變可以導致復合物的解離，即在自由序列和結(jié)合序列之間建立的熱力平衡朝著自由序列偏移。
[0024]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及一種嵌合肽，該嵌合肽包括與第二氨基酸序列融合的第一氨基酸序列，其中，第一氨基酸序列表示本發(fā)明的肽。
[0025]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及一種分離復合物，該分離復合物通過第一氨基酸序列和來自SASPase或其具有至少85%的序列同一性的同系物的第二氨基酸序列的相互作用而形成，其中，所述第一氨基酸序列表示本發(fā)明的肽，尤其是正如根據(jù)本發(fā)明的第一個主題所限定的肽。
[0026]為了本發(fā)明的目的，詞語“來自于…的氨基酸序列”旨在表示考慮之中的蛋白質(zhì)或肽的全部或部分，即整體或片段。
[0027]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及至少一種本發(fā)明的復合物用于篩選能夠調(diào)節(jié)表皮細胞的增殖和/或分化的化合物的用途。
[0028]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及一種用于篩選能夠調(diào)節(jié)表皮細胞的增殖和/或分化的化合物的方法，所述方法至少包括在下文中描述的步驟。
[0029]本發(fā)明的方法或用途可有利地在體內(nèi)、間接體內(nèi)或體外進行。
[0030]尤其，本發(fā)明的方法或用途可在間接體內(nèi)或體外進行。
[0031]可有利地實施本發(fā)明的篩選方法，以便識別能夠預防和/或治療與表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷或病理紊亂的新的活性化合物。
[0032]為了本發(fā)明的目的，術語“預防”意思是降低出現(xiàn)所給現(xiàn)象(即在本發(fā)明中，與表皮細胞的分化和/或增殖的缺陷關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷或病理紊亂)的風險或可能性。
[0033]本發(fā)明有利地可提供新靶點，其用在化妝品行業(yè)或關于皮膚和/或其附屬物的治療中。
[0034]有利的是，本發(fā)明的肽對于進行篩選新的美容活性劑或皮膚病學活性劑的簡單的、便宜的和靈敏的方法可以是特別有用的。
[0035]有利的是，本發(fā)明可以識別能夠作用于調(diào)節(jié)表皮體內(nèi)平衡的未知途徑的新的活性劑，并且因此可以關于皮膚和/或其附屬物的美容缺陷或病理紊亂提供更加精確的效果和更好的效力。
[0036]有利的是，本發(fā)明可以提供一種新穎的篩選工具，該工具對于檢測在關于皮膚和/或其附屬物的化妝品行業(yè)或治療中有用的新的活性化合物是特別有效和靈敏的。
[0037]對于與表皮細胞的增殖和/或分化的缺陷關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷或病理紊亂，這些活性化合物可以是特別有效的。
[0038]有利的是，本發(fā)明的肽也可以用作化妝品活性劑。
[0039]肽
[0040]本發(fā)明的肽可以來自于或源于SASPase或FLG2的氨基酸序列，并且能夠在適當?shù)臈l件下改變由來自絲聚合蛋白-2的第一氨基酸序列和來自SASPase的第二氨基酸序列的相互作用而形成的復合物的三維構(gòu)象。
[0041]這樣的復合物可以由來自SASPase的第一氨基酸序列的全部或部分和來自FLG2的第二氨基酸序列或該第二序列的二聚物的全部或部分相互作用而形成。
[0042]適合于這樣的復合物的SASPase或FLG2的氨基酸序列尤其可以由選自于以下的序列表示:由標號Q53RT3和Q5D862 (Uniprot/Swissprot標號)表示的序列、其片段、或其具有至少85%的序列同一性和相同性質(zhì)的生物活性的同系物。
[0043]根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的肽能夠通過親和力與來自SASPase的氨基酸序列結(jié)合。尤其根據(jù)本發(fā)明所考慮的來自SASPase的氨基酸序列可以是由Q53RT3序列(Uniprot/Swissprot標號)所表示的氨基酸序列，優(yōu)選地從該序列的位置85延伸至位置343的氨基酸序列。從Q53RT3序列的位置85延伸至位置343的氨基酸序列被推定表示包含259個氨基酸的SASPase的活性形式，提供的分子量大約為28kDa。[0044]本發(fā)明的肽可以來自于FLG2。尤其，適合于本發(fā)明的絲聚合蛋白_2可以是人類絲聚合蛋白-2,尤其是具有標號Q5D862 (Uniprot/Swissprot標號)所表示的氨基酸序列的絲聚合蛋白_2。該序列包括2391個氨基酸，具有大約為948kDa的分子量。
[0045]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式變型，本發(fā)明涉及由序列SEQ ID N0.:9、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物所表示的氨基酸序列的分離肽。這樣的肽能夠通過親和力與來自SASPase的氨基酸序列結(jié)合。
[0046]由SEQ ID N0.:9表不的氨基酸序列表不從絲聚合蛋白_2的標號Q5D862的序列的位置2延伸至位置95的氨基酸序列。
[0047]根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的肽尤其可以由來自序列SEQ ID N0.:9的3至50個連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選6至30個連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選8至20個連續(xù)的氨基酸、更優(yōu)選8至16個連續(xù)的氨基酸、甚至10至16個連續(xù)的氨基酸而構(gòu)成。
[0048]更優(yōu)選的是，本發(fā)明的肽尤其可以由來自序列SEQ ID N0.:9的3至10個連續(xù)的氨基酸組成。更特別地，這樣的肽可以適合于美容用途，例如用在局部施用或經(jīng)皮施用的美容組合物中。
[0049]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式變型，本發(fā)明的肽可以由選自以下的氨基酸序列表示:SEQ ID N0.:10、SEQ ID N0.:11、SEQ ID N0.:12、SEQ ID N0.:13、SEQ ID N0.:14、SEQ IDN0.: 15、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物。
[0050]這些肽能夠通過親和力與來自SASPase的氨基酸序列結(jié)合。
[0051]根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的肽能夠通過親和力與來自FLG2的氨基酸序列結(jié)合。尤其根據(jù)本發(fā)明所考慮的來自FLG2的氨基酸序列可以是由Q5D862序列(UnipiOt/Swissprot標號)所表示的氨基酸序列，優(yōu)選地從該序列的位置2延伸至位置213的氨基酸序列。
[0052]根據(jù)一個實施方式變型，本發(fā)明的肽能夠與來自FLG2的氨基酸序列的二聚物結(jié)
口 ο
[0053]根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的能夠通過親和力與來自FLG2的氨基酸序列結(jié)合的肽可以來自于SASPase。適合于本發(fā)明的SASPase或“皮膚天冬氨酸蛋白酶”可以是人類SASPase,尤其可以是具有由標號Q53RT3 (Uniprot/Swissprot標號)表示的氨基酸序列的SASPase0該序列包括343個氨基酸，具有大約為37kDa的分子量。
[0054]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式變型，本發(fā)明涉及由SEQ ID N0.: 16、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物表示的氨基酸序列的分離肽。優(yōu)選地，這樣的肽能夠通過親和力與來自FLG2的氨基酸序列結(jié)合。
[0055]由SEQ ID N0.: 16表示的氨基酸序列表示從SASPase的Q53RT3序列(Uniprot/Swissprot標號)的位置97延伸至位置173的氨基酸序列。
[0056]根據(jù)一個實施方式,本發(fā)明的能夠通過親和力與來自SASPase的氨基酸序列結(jié)合的肽可以通過由選自SEQ ID N0.: 1、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物的序列表示的核酸序列編碼。
[0057]優(yōu)選地，本發(fā)明 的能夠通過親和力與來自SASPase的氨基酸序列結(jié)合的肽可以通過由 SEQ ID N0.:1、SEQ ID N0.:2、SEQ ID N0.:3、SEQ ID N0.:4、SEQ ID N0.:5、SEQ IDN0.:6、SEQ ID N0.:7、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物表示的核酸序列編碼。
[0058]根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的能夠通過親和力與來自FLG2的氨基酸序列結(jié)合的肽可以通過由選自SEQ ID N0.:8、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物的序列表示的核酸序列編碼。
[0059]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明的肽的分離的核酸序列、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物，尤其如上文所限定。
[0060]本發(fā)明的核酸序列可以用于制備本發(fā)明的任何氨基酸序列，尤其用于制備如在下文中指出的嵌合肽。
[0061]適合于本發(fā)明的核酸序列可以具有任何可能的來源，即:動物、尤其哺乳類、甚至更特別的是人類；或者植物；或者來自于微生物，如病毒、噬菌體、細菌或真菌，而關于這些微生物是否天然地存在于所述的生物體中沒有任何先入之見。
[0062]氨基酸序列或核酸序列的“同系物”這一術語意在表示與所述序列具有至少85%、尤其至少90%、尤其至少98%、更特別的至少99%的同一性并且具有相同性質(zhì)的生物活性的序列。
[0063]可以由本領域的技術人員通過在本領域中任何通常用的技術來確定序列同源性。舉例來說，可以通過 使用在NCBI網(wǎng)站(地址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov)上可買到的配置有默認參數(shù)的BLAST計算機界面來確定序列同源性。
[0064]例如，氨基酸序列的同系物可以通過氨基酸的一個或多個缺失和/或嵌入、和/或一個或多個替換而區(qū)別于該序列。同樣地，例如，核酸序列的同系物可以通過堿基或密碼子的一個或多個缺失和/或嵌入、和/或一個或多個替換而區(qū)別于該序列。這些改變可被組
口 ο
[0065]根據(jù)一個實施方式變型，氨基酸序列或核酸序列的同系物可以包括一個或多個保守氨基酸替換或密碼子替換。
[0066]在序列中，保守替換是:一個氨基酸被另一個氨基酸取代，所述另一個氨基酸具有與原氨基酸的物理化學性質(zhì)基本上相似或充分接近的物理化學性質(zhì)，使得蛋白質(zhì)的或肽的性質(zhì)和功能不受影響或基本上不受影響。同樣地，在核酸序列中，保守替換是一個密碼子被另一個密碼子取代，所述另一個密碼子編碼的氨基酸與原氨基酸相同或具有與原氨基酸的物理化學性質(zhì)基本上相似或充分接近的物理化學性質(zhì)，核酸序列的性質(zhì)和功能不受影響或基本上不受影響。
[0067]以上示出的氨基酸序列或核酸序列的改變一般可以稱為“突變”。因此，本發(fā)明的同系物也涉及本發(fā)明的氨基酸序列或核酸序列的突變體和變型。
[0068]根據(jù)一個實施方式，來自于SASPase的氨基酸序列可以包括一個或多個突變。
[0069]關于可被考慮在本發(fā)明中的SASPase突變的例子，可以提到，一個或多個氨基酸殘基由具有相似的親水指數(shù)的氨基酸殘基取代，而基本上不影響SASPase的生物性質(zhì)，尤其不影響其與其配對肽相互作用的性質(zhì)。親水指數(shù)為根據(jù)氨基酸的疏水性和電荷指派給氨基酸的指數(shù)(Kyte&Doolittle，J.Mol.Biol.，1982，157:105)。
[0070]適合于本發(fā)明的氨基酸序列可以包括一個或多個翻譯后修飾。
[0071]詞語“翻譯后修飾”意在包含氨基酸序列在細胞中合成結(jié)束時易于經(jīng)受的所有的修飾，例如，一個或多個磷酸化、一個或多個糖基化、一個或多個瓜氨酸化、一個或多個脂化(如法尼基化或棕櫚酰化)、或結(jié)構(gòu)重排(如二硫鍵形成和/或在肽序列內(nèi)的裂解)。
[0072]本發(fā)明的氨基酸序列的“相同性質(zhì)的生物活性”這一詞語尤其表示其通過親和力與配對氨基酸序列結(jié)合的能力。核酸序列的“相同性質(zhì)的生物活性”這一詞語尤其表示其被轉(zhuǎn)錄和翻譯成氨基酸序列的能力。
[0073]根據(jù)一個實施方式變型，關于SASPase，相同性質(zhì)的生物活性也可以被理解為其蛋白水解活性，尤其關于角膜鎖鏈蛋白的蛋白水解活性。
[0074]根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式變型，當使用SASPase的非活性突變體時，詞語“相同性質(zhì)的生物活性”主要表示突變體的通過親和力與本發(fā)明的來自FLG2的氨基酸序列結(jié)合的性質(zhì)。
[0075]因此，適合于本發(fā)明的SASPase氨基酸序列必定至少具有與FLG2氨基酸序列相互作用的性質(zhì)。
[0076]關于來自FLG2的氨基酸序列，相同性質(zhì)的生物活性也可以被理解為其促進和/或增強SASPase的蛋白水解活性的性質(zhì)。
[0077]根據(jù)本發(fā)明的另一個變型，相同性質(zhì)的生物活性也可以被理解為本發(fā)明的復合物關于表皮細胞的增殖和/或分化的生物活性。
[0078]為了本發(fā)明的目的，氨基酸序列的“片段”這一術語表示來自于該序列、由3至50個連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選6至30個連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選8至20個連續(xù)的氨基酸、更優(yōu)選10至16個連續(xù)的氨基酸而構(gòu)成 的任何部分，并且該部分具有與該氨基酸序列表達的性質(zhì)相同性質(zhì)的生物活性。
[0079]關于核酸序列，術語“片段”表示來自于該序列、由9至150個堿基、優(yōu)選18至90個堿基，優(yōu)選24至60個堿基、更優(yōu)選30至48個堿基而構(gòu)成的任何部分，并且該部分編碼由該序列編碼的氨基酸序列的片段。
[0080]根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的氨基酸序列可以是天然的或合成的氨基酸序列，在適當情況下，能夠通過化學的或生物的合成、或通過從生物組織(如皮膚)中提取而獲得，該生物組織自然地或轉(zhuǎn)導后表達氨基酸序列以及其各種翻譯后形式。
[0081 ] 本發(fā)明的肽也可以選自于模擬肽。本發(fā)明的模擬肽可以通過修飾本發(fā)明的氨基酸序列或通過合成模擬此類序列的化合物(如類肽或β_肽)而獲得。所考慮的修飾可以基于將“非自然的”改變引入到氨基酸序列中，如主鏈的修飾或非天然氨基酸的結(jié)合。
[0082]本發(fā)明的主題還是一種嵌合肽，該嵌合肽包含與第二氨基酸序列、親水的或疏水的靶向劑、生物能轉(zhuǎn)換前驅(qū)體、和親和標記物(例如，熒光標記物、冷光標記物、放射性標記物或比色標記物)融合或偶聯(lián)的第一氨基酸序列。
[0083]以非限制的方式，作為可與本發(fā)明的氨基酸序列偶聯(lián)的化合物的例子，可以提到:熒光蛋白(如綠色熒光蛋白)、熒光化合物(如羅丹明、熒光素或德克薩斯紅)、磷光化合物、放射性元素(如3H、35S、99Tc、121I或1251)、或比色標記物(如對半乳糖苷酶、過氧化物酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、熒光素酶或堿性磷酸酶的作用敏感的顯色底物)、或其他的親和標記物(尤其 His-tag 型、GST 型或 MBP 型)。
[0084]根據(jù)可以與本發(fā)明的氨基酸序列偶聯(lián)的化合物的性質(zhì)，通過本領域的技術人員熟知的任何化學方法或任何分子生物學方法可以進行耦聯(lián)。在分子生物學方法的情況下，提到融合肽或融合蛋白、或嵌合肽或嵌合蛋白。[0085] 因此，本發(fā)明的主題還是一種嵌合肽，該嵌合肽包括與第二氨基酸序列融合的第一氨基酸序列，其中，該第一氨基酸序列表示如先前所限定的本發(fā)明的肽。
[0086]根據(jù)一個實施方式，根據(jù)本發(fā)明的嵌合肽可以包括作為第二氨基酸序列的選自于突光蛋白、親和標記物、信號肽和促滲透肽(propenetrating peptide)的序列,優(yōu)選親和標記物。
[0087]根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的嵌合肽的第一氨基酸序列可以是來自FLG2或來自SASPase、更優(yōu)選地來自序列SEQ ID N0.:9或SEQ ID N0.: 16的氨基酸序列。
[0088]作為本發(fā)明的嵌合肽的優(yōu)選的第二氨基酸序列，可以提到熒光蛋白，尤其是GFP(綠色熒光蛋白)、ECFP (增強型藍綠色熒光蛋白)、DsRed2FP (DsRed熒光蛋白)、EGFP (增強型綠色熒光蛋白)、EYFP (增強型黃色熒光蛋白)JPEBFP (增強型藍色熒光蛋白)。
[0089]作為適合于本發(fā)明的親和標記物，尤其可以提到谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(THX)、Myc標記物、FLAF標記物、His標記物、或THX-Hi s-tag 或 THX-Hi s-S-tag 標記物。
[0090]通過本領域的技術人員熟知的任何分子生物方法，尤其如由Sambrook等描述的方法(Molecular Cloning:A laboratory Manual,Ed.Cold Spring Harbor,2001),可以獲得本發(fā)明的嵌合肽。
[0091]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及一種分離復合物，該分離復合物通過第一氨基酸序列和來自SASPase或其具有至少85%的序列同一性的同系物的第二氨基酸序列的相互作用而形成，其中，所述第一氨基酸序列表示來自于FLG2的肽，優(yōu)選正如在先前所限定的肽。
[0092]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式變型，本發(fā)明的復合物的第二氨基酸序列可以表示來自于如先前所限定的SASPase的肽。
[0093]篩選
[0094]本發(fā)明涉及至少一種本發(fā)明的復合物用于篩選能夠調(diào)節(jié)表皮細胞的增殖和/或分化的化合物的用途。
[0095]根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明涉及一種用于篩選能夠調(diào)節(jié)表皮細胞的增殖和/或分化的化合物的方法。
[0096]優(yōu)選地，這樣的化合物可以調(diào)節(jié)通過來自FLG2的第一氨基酸序列或該序列的二聚物與來自SASPase的第二氨基酸序列的相互作用而形成的復合物的三維構(gòu)象。
[0097]更優(yōu)選地，這樣的化合物可以調(diào)節(jié)通過來自FLG2的第一氨基酸序列或該序列的二聚物與來自SASPase的第二氨基酸序列的相互作用而形成的復合物的形成。
[0098]有利的是，F(xiàn)LG2和SASPase的氨基酸序列可以是正如先前所限定的序列。
[0099]根據(jù)一個實施方式變型，在考慮之中的復合物可以是本發(fā)明的正如先前所限定的復合物。
[0100]本發(fā)明的方法可以至少包括在于以下的步驟:
[0101]a)在有利于本發(fā)明的復合物的形成的條件下，提供所述復合物，
[0102]b)在步驟a)之前或繼步驟a)之后，將第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列與實體結(jié)合，第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列與所述實體形成能夠在接觸激發(fā)波長后發(fā)射信號的組合件，實施步驟a)和步驟b)引起獲得所述復合物，[0103]c)使所述復合物經(jīng)受所述激發(fā)波長，以便獲得表示該復合物的特征的第一信號SI，
[0104]d)定量地或定性地確定該信號SI，
[0105]e)將該復合物與假定包含待篩選的化合物的介質(zhì)接觸，
[0106]f )使在步驟e)中獲得的介質(zhì)經(jīng)受該激發(fā)波長，以便獲得第二信號S2，
[0107]g)定量地或定性地確定該信號S2，和
[0108]h)比較第一信號SI和第二信號S2,以便得出關于在所篩選的化合物存在下,該復合物的三維構(gòu)象可能改變的結(jié)論。
[0109]根據(jù)一個實施方式，適合于本發(fā)明的實體可以選自于適合于表面等離子體共振的載體、熒光標記物、抗體或一抗和二抗的組合，該抗體或該二抗帶有熒光標記物。
[0110]本發(fā)明的第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列可以通過本領域的技術人員熟知的任何方法與實體結(jié)合，并且適應于必須與第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列組合的載體的性質(zhì)。將自然地選擇偶聯(lián)方法，以便不影響所用氨基酸序列的結(jié)合性能或親和性倉泛。
[0111]根據(jù)一個實施方式，通過化學耦聯(lián)、分子生物學、或特異性強親和相互作用可以進行第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列之間的結(jié)合。
[0112]尤其，通過化學耦聯(lián)、尤其通過反應性化學官能團、或通過分子生物學方法可以進行結(jié)合。
[0113]當通過化學方法進行結(jié)合時，待反應的化學官能團可以天然地存在于第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列上，或者可以在化學反應之前被引入到第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列和實體上。
[0114]作為適合于本發(fā)明的反應性化學官能團的例子，例如，可以提到通常被用在“點擊化學”反應中的反應性化學官能團。
[0115]作為適合于實體和第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列之間的結(jié)合的分子生物學方法的例子，可以提到通常用在克隆方法中的分子生物學方法，該克隆方法尤其包括:制備適當?shù)暮怂嵝蛄?、使核酸序列連接并將其引入到合適的表達載體(如質(zhì)粒)中、和將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至能夠允許表達和生成本發(fā)明的嵌合肽的宿主細胞中。
[0116]根據(jù)另一個實施方式，實體和第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列可以通過一種或多種特異性強親和相互作用而與彼此結(jié)合。
[0117]根據(jù)一個實施方式,尤其適合于本發(fā)明的實體可以是抗體或一組一抗和二抗。
[0118]適合于本發(fā)明的抗體可以通過本領域的技術人員熟知的任何方法，尤其是正如在“Antibodies:A Laboratory Manual，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.(1990)中描述的方法而獲得。
[0119]關于適合于本發(fā)明的抗體的類型，可提到單克隆抗體或多克隆抗體、以及免疫球蛋白片段，該免疫球蛋白片段能夠結(jié)合抗原，并且可通過本領域的技術人員熟知的任何基因工程技術或通過整個抗體的酶法裂解或化學裂解而生成。
[0120]更特別地，適合于本發(fā)明的抗體可以選自于單克隆抗體、多克隆抗體、雙價抗體、scFv抗體、F(ab’)2抗體、Fab’抗體、嵌合抗體、人源化抗體、和重組抗體。
[0121]根據(jù)一個實施方式，適合于本發(fā)明的抗體可以對其所針對的第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列的一部分具有親和力，或者對由第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列所攜帶的特定的親和標記物具有親和力。
[0122]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列可以攜帶由抗體識別的親和標記物。
[0123]適合于本發(fā)明的親和標記物可以尤其選自于先前指出的親和標記物。
[0124]作為適合于本發(fā)明的抗體的例子，尤其可以提到用在下文中陳述的實施例中的抗體。[0125]根據(jù)另一個實施方式，第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列分別與第一實體和第二實體結(jié)合，所述實體分別包括熒光基團A和熒光基團B，該基團A和基團B限定了適合于通過熒光共振實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移的熒光能量受體-供體配對。
[0126]作為可根據(jù)本發(fā)明使用的受體-供體配對的例子，以非限制的方式，可提到BFP(藍色熒光蛋白)/GFP (綠色熒光蛋白)配對、CFP (藍綠色熒光蛋白)/YFP (黃色熒光蛋白)配對、CFP/DsRed (紅色熒光蛋白)配對、GFP/DsRed配對、和EuK (銪穴狀化合物)/XL665配對所組成。優(yōu)選地，適合于本發(fā)明的受體-供體配對可以是EuK/XL665。
[0127]根據(jù)一個實施方式變型，第一實體和第二實體可以是突光標記物。這樣的突光標記物可以選自于通常在本領域中使用的熒光分子或熒光蛋白。優(yōu)選地，所使用的熒光標記物可以選自于尤其是正如先前指出的通過分子生物學與第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列融合的熒光蛋白。
[0128]根據(jù)另一個實施方式變型，第一實體和第二實體可以是帶有熒光標記物的抗體，并且可以能夠與分別由第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列所攜帶的第一親和標記物和第二親和標記物分別結(jié)合。
[0129]根據(jù)一個實施方式，在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟d)中定量地或定性地測定的信號SI可以是通過在熒光能量供體的激發(fā)波長下進行的照射而獲得的熒光信號。
[0130]在本方法的步驟g)中定量地或定性地測定的信號S2可以是通過在激發(fā)波長下對熒光能量供體照射而獲得的熒光信號。
[0131]可以采用適合于本發(fā)明的且為本領域的技術人員所熟知的任何裝置測量熒光信號SI和突光信號S2。作為適合于本發(fā)明的裝置的例子,可提到酶標儀、突光顯微鏡、突光分光計或熒光掃描儀。
[0132]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的方法可以在微孔板中以高通量進行，熒光信號可以通過酶標儀(例如Pherastar酶標儀(BMG))測量。
[0133]在待篩選的化合物的存在下，信號S2明顯高于信號SI可以指示提升本發(fā)明的復合物的三維構(gòu)象的平衡性和穩(wěn)定性的化合物。
[0134]優(yōu)選地，這樣的化合物可以促進第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之間的相互作用，或者是第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之間的相互作用的激動劑。
[0135]相反地，在待篩選的化合物的存在下，信號S2明顯低于信號SI可以表示使本發(fā)明的復合物的三維構(gòu)象不穩(wěn)定或發(fā)生改變的化合物。
[0136]優(yōu)選地，這樣的化合物可以使第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之間的相互作用不穩(wěn)定，或者是第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之間的相互作用的拮抗劑。
[0137]根據(jù)本發(fā)明的方法使得可以篩選調(diào)節(jié)表皮細胞的增殖和/或分化的試劑。[0138]為了本發(fā)明的目的，詞語“調(diào)節(jié)化合物”意思是任何易于或能夠直接地或間接地對包括來自FLG2的第一氨基酸序列或該序列的二聚物與來自SASPase的第二氨基酸序列的結(jié)合的復合物作用來調(diào)節(jié)該結(jié)合的三維構(gòu)象的化合物。
[0139]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，所篩選的化合物可以是該結(jié)合的激動劑或拮抗劑。
[0140]根據(jù)一個實施方式變型，調(diào)節(jié)化合物可以促進該結(jié)合或是該結(jié)合的激動劑。可替選地，根據(jù)另一個實施方式變型，調(diào)節(jié)化合物可以是使該結(jié)合不穩(wěn)定的化合物，或是該結(jié)合的拮抗劑。
[0141]調(diào)節(jié)化合物關于該結(jié)合的激動劑性質(zhì)或拮抗劑性質(zhì)將更特定地根據(jù)對表皮細胞的增殖和/或分化待施加的調(diào)節(jié)作用而選擇。
[0142]因此，根據(jù)待預防或治療的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷或病理紊亂的性質(zhì)，將更加特定地使用作為該結(jié)合的激動劑或拮抗劑的調(diào)節(jié)化合物。
[0143]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，所篩選的化合物能夠預防和/或治療與表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷或病理紊亂。
[0144]根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的篩選方法還可以包括至少一個額外的步驟，該步驟在于評估調(diào)節(jié)表皮細胞的分化和/或增殖的所篩選化合物的性能。
[0145]這樣的評估可以在體外或間接體內(nèi)、尤其在培養(yǎng)中的表皮細胞上而進行。該細胞可以是細胞系中的細胞，即，利用病毒轉(zhuǎn)化的細胞，或腫瘤區(qū)域的細胞，以便使細胞不死。
[0146]或者，該細胞可以是原代培養(yǎng)細胞，即，取自于活的生物體組織的細胞(例如，來自于人類的表皮)。
[0147]優(yōu)選地，培養(yǎng)中的細胞可以是成纖維細胞，甚至是角化細胞，尤其該細胞是分層的?？梢愿鶕?jù)本領域的技術人員熟知的任何方法準備細胞培養(yǎng)。
[0148]同樣地，體外評估可以在重建的表皮模型上進行。這樣的表皮模型可以是市場上可買到的(例如，Episkin模型)。
[0149]根據(jù)本發(fā)明的所篩選的化合物的體外或間接體內(nèi)的評估可以通過本領域的技術人員熟知的任何方案而進行，目的在于將由測試化合物給出的效果與對照值或標準值進行比較。
[0150]在體外或間接體內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的所篩選的化合物的效果可以通過測量與表皮細胞的分化和/或增殖有特定關系的已知的生物標記而被確定。
[0151]例如，這樣的標記可以選自于測量角質(zhì)層的厚度，測量角質(zhì)層的屏障功能，測量谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶1、絲聚合蛋白、半胱天冬酶14、SASPase、角膜鎖鏈蛋白、橋粒芯糖蛋白或Κ?67蛋白的表達和/或活化。
[0152]例如，這些標記可以根據(jù)本領域的技術人員熟知的任何方案，通過免疫印跡或免疫熒光而確定。
[0153]用途和組合物
[0154]本發(fā)明的所篩選的化合物、肽或核酸序列可以用于化妝品行業(yè)，作為用于預防和/或治療與表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷的美容活性劑。
[0155]本發(fā)明的所篩選的化合物、肽或核酸序列可以用于制備用來預防和/或治療與表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的病理紊亂的治療組合物。
[0156]同樣地，本發(fā)明涉及一種治療組合物，該治療組合物包括作為活性劑的本發(fā)明的用于預防和/或治療與表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的病理紊亂的所篩選的化合物、肽或核酸序列。
[0157]本發(fā)明的所篩選的化合物、肽或核酸序列的美容的或治療的應用取決于繼表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂之后由皮膚和/或其附屬物表達出的病征的表現(xiàn)性質(zhì)、甚至表現(xiàn)程度或表現(xiàn)強度。評定該表現(xiàn)性質(zhì)或該表現(xiàn)強度，以及實施適當?shù)膽茫诒绢I域的技術人員的常識之內(nèi)。
[0158]本發(fā)明的一個特定的實施方式涉及本發(fā)明的肽或編碼這樣的肽的核酸序列的作為用于預防和/或治療與表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷的美容活性劑的美容用途。
[0159]本發(fā)明考慮的美學缺陷可選自于皮膚老化的體征、表皮屏障功能紊亂、皮膚干燥的體征、皮脂分泌過多的皮膚體征、皮膚膚色的改變、皮膚或頭皮脫皮癥、和愈合缺陷和/或再上皮化缺陷。
[0160]本發(fā)明考慮的美學缺陷也可以是多汗癥和/或體臭問題。
[0161]根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的肽或核酸序列也可以用于化妝品行業(yè)，作為用于在皮膚用力擦洗或去角質(zhì)處理后促進再上皮化的活性劑。
[0162]根據(jù)另一個實施方式，根據(jù)本發(fā)明的肽或核酸序列也可以用于化妝品行業(yè)，作為用于預防和/或治療脫發(fā)和/或促進頭發(fā)恢復、或預防體毛再生長的活性劑。
[0163]根據(jù)一個實施方式，病理紊亂可以選自于癌癥、牛皮癬、白癜風、酒糟鼻、特應性皮炎、脂溢性皮炎和痤瘡。
[0164]根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的美容用途可以優(yōu)選采用本發(fā)明的尤其正如先前限定的肽或編碼這樣的肽的核酸序列作為用于預防和/或治療表皮老化和/或改善表皮屏障功能的美容活性劑，該肽來自于FLG2，并能夠通過親和力與來自SASPase的氨基酸序列結(jié)合。
[0165]根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的美容用途可以優(yōu)選采用本發(fā)明的尤其正如先前限定的肽作為用于預防和/或治療表皮老化和/或改善表皮屏障功能的美容活性劑，該肽來自于SASPase，并能夠通過親和力與來自絲聚合蛋白_2的氨基酸序列結(jié)合。
[0166]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及美容組合物，該美容組合物在生理上可接受的介質(zhì)中包括有效量的至少一種本發(fā)明的肽或有效量的編碼這樣的肽的核酸序列。
[0167]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及美容組合物或治療組合物，該組合物包括有效量的至少一種本發(fā)明的肽或編碼此類肽的核酸序列作為用于治療和/或預防與表皮細胞的增殖和/或分化的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷或病理紊亂的活性劑。
[0168]為了本發(fā)明的目的，詞語“有效量”意思是對于皮膚和/或其附屬物的美學缺陷或病理紊亂施加預防效果和/或治療效果所充分的且必需的活性劑的量。
[0169]這樣的組合物可以口服給藥、不經(jīng)腸道給藥、或局部給藥。
[0170]這樣的實施途徑是本領域的技術人員熟知的。
[0171]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及包括至少一種編碼本發(fā)明的肽的核酸序列的組合物。[0172]這樣的組合物可專用于使得本發(fā)明的肽在細胞、生物組織或器官中表達。
[0173]這樣的組合物可以用于美容的目的、治療的目的、或診斷的目的。
[0174]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及用于預防和/或治療個體中的與表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷的美容治療方法，該方法包括至少一個向該個體給藥有效量的作為活性劑的至少一種本發(fā)明的肽或核酸序列的步驟。
[0175]有利地，可以局部地、口服地、或不經(jīng)腸道地實施此類方法，尤其是局部地或口服地。
[0176]不經(jīng)腸道的途徑尤其包括皮內(nèi)途徑和皮下途徑。
[0177]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及有效量的至少一種本發(fā)明的肽、或至少一種本發(fā)明的核酸序列、或至少一種本發(fā)明的所篩選的化合物的用于制備和/或改進尤其是表皮的或粘膜的類型的多層細胞模型、特別是重建的皮膚模型的用途。
[0178]有利地，將本發(fā)明的肽或核酸序列、或本發(fā)明的所篩選的化合物加入到培養(yǎng)基中，多層培養(yǎng)模型在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在本發(fā)明的氨基酸或核酸序列、或本發(fā)明的所篩選的化合物的存在下所進行的細胞模型培養(yǎng)步驟和培養(yǎng)時間由本領域的技術人員根據(jù)待獲得的細胞模型和待獲得的效果而被自然地調(diào)整。
[0179]為了本發(fā)明的目的，詞語“重建的皮膚模型”表示一種模型，其中，各種細胞類型(如，尤其是自然存在于皮膚中的細胞，像角化細胞、成纖維細胞、朗格爾漢斯細胞和黑色素細胞)組合在該模型中?？梢赃x擇地照射成纖維細胞類型的細胞。
[0180]此類模型和其制備是本領域的技術人員所熟知的。
[0181]在以下的描述和實施例中，除非特別說明，百分比為質(zhì)量百分比，以“在…至…之間”形式書寫的值的范圍包括規(guī)定的下限和上限。
[0182]在下面給出的實施例作為本發(fā)明的非限制性說明而被呈現(xiàn)。
【具體實施方式】
[0183]實施例
[0184]實施例1
[0185]SASPase-FLG2相互作用和識別該相互作用所涉及的肽域
[0186]采用野生形式的完整的28kDa的SASPase蛋白(SASPase_28，基因庫標號gi 16553767)和在催化天冬氨酸下突變的形式的完整的28kDa的SASPase蛋白(SASPase_28D128A)、以及完整的37kDa的SASPase形式(SASPase_37，基因庫標號gil89409121)、和對應于關于SASPase_28序列的蛋白質(zhì)的84個氨基酸的N-末端的片段(SASPase_27N84)，進行利用“雙雜交”技術的首次研究。
[0187]除了根據(jù)取向N-SASPase_28N84-LexA_C 與 LexA 域融合的 SASPase_28N84 序列以外，SASPase序列根據(jù)取向N_LexA_SASPase_C與DNA結(jié)合域LexA融合，以便保持SASPase的C-末端自由。
[0188]獵物(prey)序列與Gal4轉(zhuǎn)錄激活域融合。
[0189]野生型或突變的SASPase_28、SASPase_37和SASPase_28N84沒有表現(xiàn)出雙雜交系統(tǒng)的自激活。因此，利用SASPase_28序列或SASPase_37序列進行的篩選使得可以以非常好的置信分數(shù)來識別與絲聚合蛋白-2 (FLG2)的相互作用。[0190]采用識別為與SASPase_28序列和SASPase_37序列相互作用并且對應于基因庫序列:g1:62122916的氨基酸2-213的絲聚合蛋白_2片段作為誘餌，發(fā)現(xiàn)了與SASPase的相互作用。
[0191]根據(jù)取向N-LexA-FLG22_213_C，序列與DNA結(jié)合域LexA融合。
[0192]獵物序列與Gal4轉(zhuǎn)錄激活域融合。
[0193]絲聚合蛋白-2的N-末端片段表現(xiàn)出雙雜交系統(tǒng)的輕微的自激活，因此濃度為5mM的3-氨基三唑用于篩選。
[0194]篩選使得證實與SASPase相互作用。
[0195]進行了補充實驗，以便降低和識別負責SASPase_28和絲聚合蛋白_2之間的該相互作用的序列的大小。
[0196]這些實驗可以表明SASPase_28的N-末端片段(氨基酸11_86，SEQ ID N0.:16)對于與FLG2相互作用是充分的。
[0197]關于FLG2，這些補充實驗表明，絲聚合蛋白_2的N-末端SlOO域(氨基酸2_95，SEQID N0.:9)參與與SASPase的相互作用。
[0198]實施例2
[0199]通過FLG2調(diào)節(jié)SASPase的蛋白水解活性
[0200]由從與硫氧還蛋白-His-S.Tag (THX-His-S-tag)親和標記物融合的由標號Q5D862 (標號:Uniprot/Swissprot)表示的序列的位置2延伸至位置213的氨基酸所組成的重組絲聚合蛋白-2 (FLG2)制備在親本質(zhì)粒pET32c (Novagen)中(FLG22-213-硫氧還蛋白-His-S.Tag 或 FLG2-HS)。
[0201]按照由Bernard 等描述的方法(J.1nvest.Dermatol., 2005,125:278-287)制備由從標號Q53RT3 (Uniprot/Swissprot標號)所表示的序列的位置85延伸至位置343的氨基酸所組成的重組的28kDa的SASPase (SASPase_28)。
[0202]在0.01mM 的比色底物 Dabcyl-QIDRIMEK-Edans (ProductionJerini Peptide 標號 D17:JPT Peptide Technologies GmbH)存在下，0.025mg/mL 的 SASPase_28 存在于 PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)中。
[0203]以SASPase 的最終濃度(0.025mg/mL)的 0.01 倍、0.02 倍、0.04 倍、0.08 倍、0.16倍、0.31 倍、0.63 倍、1.25 倍、2.5 倍、5 倍或 10 倍使用 FLG2_Hs。
[0204]通過活化的SASPase水解比色底物導致EDANS熒光染料和其減活化劑(或淬滅劑)Dabcyl的分離，并且導致EDANS熒光的增加。
[0205]在λ ex340nm/ λ em490nm 處測量熒光信號。在 37 °C 下，利用 SPECTRAMAX M5e(Molecular Devices),每10分鐘讀取突光，持續(xù)I小時30分鐘。
[0206]所獲得的結(jié)果表明，在濃度增大的FLG2-HS的存在下，SASPase的酶活性顯著地增強。
[0207]利用從FLG2即SEQ ID N0.:9的位置71延伸至位置90的氨基酸序列，合成具有8至20個氨基酸的肽。
[0208]通過用如此制備的每個肽替代FLG2-HS，重復先前的酶學測定。
[0209]在被測試的肽中，由序列SEQ ID N0.: 10,SEQ ID N0.=IUSEQ ID N0.:12、SEQ IDN0.:13, SEQ ID N0.:14和SEQ ID N0.: 15表示的肽顯示具有特別顯著的增強SASPase的催化活性的能力。
[0210]實施例3
[0211 ] 篩選調(diào)節(jié)來自于FLG2的肽和SASPase之間的相互作用的試劑
[0212]根據(jù)本發(fā)明的方法可以采用均相時間分辨熒光(或HTRF)技術。
[0213]來自于SASPase的、在其C-末端處與GST (日本血吸蟲的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)親和標記物融合的氨基酸序列(SEQ ID N0.:16)制備在pGEX-4-T3載體中(基因庫U13855)(SASPaseSEQ ID N0.:16-GST)。
[0214]如下制備來自于FLG2的、在其N末端處與硫氧還蛋白-His-S.Tag親和標記物融合的氨基酸序列(SEQ ID N0.:9) (FLG2SEQIDN。.:9-His-Thx)。
[0215]所獲得的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化勝任的大腸桿菌。然后，在IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)存在下，誘導該轉(zhuǎn)化的細菌，然后離心，通過超聲溶解。嵌合肽通過對在適當?shù)臉渲系腍IS標記物或GST標記物的親和力而被提純，然后用緩沖液透析。然后通過Bradford法分析所獲得的嵌合肽。
[0216]分別識別GST親和標記物或His-S.Tag親和標記物并分別帶有EuK熒光供體基團(銪穴狀化合物 λ ex337nm/ λ em620nm)或 XL1665 熒光受體基團(λ ex570-630nm/ λ em665nm)的抗體用來監(jiān)測肽-SASPase相互作用。
[0217]此類肽是市場上可買到的，例如，來自于Cisco公司的標號為61GSTKLB (抗-GSTK抗體)或6IHISKLB (抗-6HIS K抗體)的產(chǎn)品。
[0218]通過在EuK熒光標記物和XL1665熒光標記物之間的熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)觀測到SASPaseSEQ ID N0.:16_GST/FLG2seq ID N0.:9-His-THX 相互作用。EuK 熒光供體在 λ ex337nm 處被激發(fā)，來自于XL1665突光受體的突光發(fā)射在λ em665nm被測量。
[0219]獨立于肽之間的相互作用之外發(fā)生的λ effl620nm的EuK熒光發(fā)射用來使信號標準化。
[0220]通過來自Perkin Elmer的Janus自動化設備，于pH為7.4的PBS磷酸鹽緩沖液中，在384-孔板中進行篩選方法。
[0221]無待篩選的化合物的緩沖液或稀釋溶液作為對照。
[0222]預培養(yǎng)SASPaseSEQ ID N0.:16_GST 和所測試的化合物，然后將 FLG2SEQ ID N0.:9_His-THX加入到培養(yǎng)介質(zhì)中。
[0223]然后將對親和標記物特異的抗體加入到該培養(yǎng)介質(zhì)中。
[0224]在通過PHERASTAR 酶標儀(BMG)讀取熒光(λ ex337nm/ λ em665nm,在 λ em620nm 處標準化)之前，將混合物留下來培養(yǎng)。
[0225]采用下面的公式計算結(jié)果:
[0226]Delta_F=100x [比例(100%)-比例(背景)]/ 比例(背景)
[0227]其中，“比例(100%)”表示在 SASPaseSEQ ID N0.:g-GST 和 FLG2SEQ ID N0.:4-His-THX 存在下突光抗體的突光λ em665/ λ em620的比例比例(背景)”表不在肽不存在下突光抗體的突光 λ em665/ λ em620 的比例 ο
[0228]在測試化合物(對照物在二甲亞砜(DMSO)中)存在下(“Delta_F分析”)或不存在下(“Delta_F 對照”)，確定 Delta_F。
[0229]然后采用下面的公式計算反映肽的相互作用的抑制百分比或活化百分比的“最終比例”:
[0230]最終比例=IOOx (061七&_卩分析-061七&_卩對照)/ (Delta_F對照)
[0231]該最終比例的降低表明存在能夠預防或動搖SASPaseSEQ ID N0.:16-GST/FLG2seq ID N0.:9-Hi s-THX相互作用的化合物。
[0232]該最終比例的增大表明存在能夠穩(wěn)定或促進該相互作用的化合物。
[0233]對于識別能夠正面地或負面地調(diào)節(jié)在來自于FLG2的肽和SASPase之間或在來自于FLG2的肽和來自于SASPase的肽之間的相互作用的活性化合物，本發(fā)明的篩選方案證明是特別有利的。
[0234]關于由表皮細胞的增殖和/或分化的缺陷造成的皮膚和/或其附屬物的審美紊亂或病理紊亂，這些所篩選的活性化合物能夠被有利地采用。
【權利要求】
1.一種分離的肽，所述分離肽由選自SEQ ID N0.:9、SEQ ID N0.:16、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物的氨基酸序列表示，并且能夠改變由來自絲聚合蛋白-2的第一氨基酸序列和來自SASPase的第二氨基酸序列的相互作用而形成的復合物的三維構(gòu)象。
2.根據(jù)權利要求1所述的肽，其中，所述肽由序列SEQID N0.:9、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物表示，并且能夠通過親和力與來自SASPase的所述第一氨基酸序列結(jié)合。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的肽，其中，所述肽由來自序列SEQID N0.:9的3至50個連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選6至30個連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選8至20個連續(xù)的氨基酸、更優(yōu)選10至16個連續(xù)的氨基酸構(gòu)成。
4.根據(jù)前述權利要求中的任意一項所述的肽，其中，所述肽由選自SEQID N0.:10,SEQID N0.: 11、SEQ ID N0.: 12、SEQ ID N0.: 13、SEQ ID N0.: 14、SEQ ID N0.: 15、其片段、或其具有至少85%的序列同一'I"生的同系物的氨基酸序列表不。
5.根據(jù)前述權利要求中的任意一項所述的肽，其中，所述肽通過選自SEQID N0.:1、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物的序列所表示的核酸序列編碼。
6.根據(jù)權利要求1所述的肽，其中，所述肽由序列SEQID N0.: 16、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物表示，并且能夠通過親和力與來自絲聚合蛋白-2的所述第二氨基酸序列結(jié)合。
7.根據(jù)前一項權利要求所述的肽，其中，所述肽通過由SEQID N0.:8、其片段、或其具有至少85%的序列同一性的同系物表示的核酸序列編碼。
8.一種嵌合肽，包括與第二氨基酸序列融合的第一氨基酸序列，其中，所述第一氨基酸序列表示在權利要求1至7的任意一項中所限定的肽。
9.根據(jù)前一項權利要求所述的嵌合肽，其中，所述第二氨基酸序列選自于熒光蛋白、親和標記物、信號肽和促滲透肽，優(yōu)選為親和標記物。
10.一種分離的復合物，該分離的復合物通過第一氨基酸序列和第二氨基酸序列相互作用形成，所述第二氨基酸序列來自SASPase或其具有至少85%的序列同一'I"生的同系物，其中，所述第一氨基酸序列表示在權利要求1至5、權利要求8或9中的任意一項中所限定的肽。
11.根據(jù)前一項權利要求所述的復合物，其中，所述第二氨基酸序列表示如在權利要求1和權利要求6至9的任意一項中所限定的來自SASPase的肽。
12.至少一種如在權利要求10或11中所限定的復合物用于篩選能夠調(diào)節(jié)表皮細胞的增殖和/或分化的化合物的用途。
13.一種用于體外或間接體內(nèi)地篩選能夠調(diào)節(jié)表皮細胞的增殖和/或分化的化合物的方法，所述方法至少包括在于以下的步驟: a)在有利于權利要求10或11中所限定的復合物的形成的條件下，提供所述復合物； b)在步驟a)之前或繼步驟a)之后，將所述第一氨基酸序列和/或所述第二氨基酸序列與實體結(jié)合，所述第一氨基酸序列和/或所述第二氨基酸序列與所述實體形成在接觸激發(fā)波長后能 夠發(fā)射信號的組合件，步驟a)和步驟b)的實施導致獲得所述復合物， c)使所述復合物經(jīng)受所述激發(fā)波長，以便獲得表示所述復合物的特征的第一信號SI，d)定量地或定性地確定該信號S1， e)將所述復合物與假定含有待篩選的化合物的介質(zhì)接觸， f )使在步驟e)中獲得的所述介質(zhì)經(jīng)受所述激發(fā)波長，以便獲得第二信號S2， g)定量地或定性地確定所述信號S2，和 h)比較所述第一信號SI和所述第二信號S2，以便得出與在所篩選的化合物存在下所述復合物的三維構(gòu)象的可能的改變相關的結(jié)論。
14.根據(jù)前一項權利要求所述的方法，其中，所述實體選自于適合于表面等離子體共振的載體、熒光標記物、抗體、或一抗和二抗的組合，所述抗體或所述二抗帶有熒光標記物。
15.根據(jù)權利要求13或14所述的方法，其中，所述第一氨基酸序列和/或所述第二氨基酸序列通過化學耦聯(lián)、分子生物學、或特異性強親和相互作用與所述實體結(jié)合。
16.根據(jù)權利要求13至15中的任意一項所述的方法，其中，所述實體是抗體或一組一抗和二抗。
17.根據(jù)權利要求13至16中的任意一項所述的篩選方法，其中，所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列分別與第一實體和第二實體結(jié)合，所述第一實體和第二實體分別包括熒光基團A和熒光基團B，所述基團A和所述基團B限定適合于通過熒光共振實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移的熒光能量受體-供體配對。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其特征在于，所述信號SI和/或所述信號S2通過在所述熒光能量供體的激發(fā)波長下進行的照射而獲得的熒光信號。
19.根據(jù)權利要求13至18中的任意一項所述的方法，其特征在于，所述所篩選的化合物是所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列之間的相互作用的激動劑或拮抗劑。
20.根據(jù)權利要求13至19中的任意一項所述的方法，其特征在于，所述所篩選的化合物能夠預防和/或治療與表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷或病理紊亂。
21.權利要求1至9中的任意一項所限定的肽或編碼這樣的肽的核酸序列作為用于預防和/或治療與表皮細胞的分化和/或增殖的功能紊亂關聯(lián)的皮膚和/或其附屬物的美學缺陷的美容活性劑的美容用途。
22.根據(jù)權利要求21所述的用途，其中，所述肽如在權利要求1至5和權利要求8至9中的任意一項所限定，并且能夠通過親和力與來自SASPase的氨基酸序列或編碼這樣的肽的核酸序列結(jié)合，且作為用于預防和/或治療表皮老化和/或改善表皮屏障功能的美容活性劑。
23.根據(jù)權利要求21所述的用途，其中，所述肽如在權利要求6至9中的任意一項所限定，并且能夠通過親和力與來自絲聚合蛋白-2的氨基酸序列結(jié)合，作為用于預防和/或治療表皮老化和/或改善表皮屏障功能的美容活性劑。
24.一種美容組合物，包括在生理上可接受的介質(zhì)中的有效量的至少一種如在權利要求I至9中的任意一項所限定的肽或有效量的編碼這樣的肽的核酸序列。
25.一種組合物，包括至少一種編碼權利要求1至9中的任意一項所限定的肽的核酸序列。
【文檔編號】C07K14/47GK103596969SQ201180067024
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2011年12月5日 優(yōu)先權日:2010年12月7日
【發(fā)明者】D·伯納德, A·托馬斯-克里基努恩 申請人:歐萊雅