一種弓形蟲gra10復(fù)合表位肽及其制備的疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及弓形蟲疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽及其制備的疫苗，其基于弓形蟲GRAlO的復(fù)合抗原表位，用殼聚糖微球裝載的弓形蟲疫苗，用于人或動物弓形蟲病的預(yù)防。
【背景技術(shù)】
[0002]弓形蟲(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生原蟲，廣泛寄生于人體及動物的有核細(xì)胞內(nèi)，引起嚴(yán)重的人獸共患病。弓形蟲感染孕早期婦女可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)甚至死產(chǎn)，亦可通過胎盤引起新生兒畸形和胎兒眼部并發(fā)癥。對于免疫力缺乏或者低下的人群(如艾滋病和腫瘤患者)，弓形蟲可導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀(如弓形蟲腦病)甚至死亡。在免疫功能正常的宿主體內(nèi)，弓形蟲往往形成慢性感染，引起不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視力的損害。作為一種機(jī)會致病性胞內(nèi)寄生的原蟲，弓形蟲在宿主體內(nèi)主要引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，是通過識別抗原蛋白的十幾個氨基酸序列發(fā)揮作用，這就是抗原表位。研制針對弓形蟲同時具有人類及BALB/c小鼠MHC分子限制性T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的新疫苗是非常迫切和必要的。
[0003]弓形蟲GRA家族是構(gòu)成弓形蟲速殖子納蟲空泡膜和緩殖子囊壁的主要成分，在修飾調(diào)理納蟲泡形成過程中起著重要作用，其中GRAlO蛋白更與蟲體在胞內(nèi)的生長和發(fā)育息息相關(guān)。我們通過篩選獲得了 GRAlO蛋白的T細(xì)胞和B細(xì)胞優(yōu)勢表位，通過實驗驗證了這些表位肽的免疫保護(hù)性。
[0004]此外，疫苗載體的選擇，對于疫苗的作用效果也極為關(guān)鍵；作為非病毒載體，微球顆粒材料具有較好的生物相容性和獨特的理化性質(zhì)，如易于加工修飾、促進(jìn)功能分子入胞、保護(hù)DNA和蛋白質(zhì)等免受降解，在疫苗載體或佐劑的研究與開發(fā)過程中逐漸成為關(guān)注的熱點。針對弓形蟲所使用種類的抗原，如何選擇合適的載體來增強(qiáng)疫苗免疫效果，也是本領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，發(fā)明人通過實驗研究，提供了一種弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽及其制備的疫苗。
[0006]首先，本發(fā)明提供了一種人工合成弓形蟲GRAlO蛋白復(fù)合表位肽一SGFSLSSGSGVSVVEGSLGYCALLPLGSTQSPPESRKKRRRSGKKKRGKRSV ；
[0007]所述復(fù)合表位肽是通過如下方法獲得的:用IEDB篩選出的同時具有人類及BALB/C小鼠MHC分子限制性的弓形蟲GRAlO的CD+8T細(xì)胞優(yōu)勢表位(GRAlO161 169)和CD+4T細(xì)胞優(yōu)勢表位(GRAlOiffl 94)，用DNAStar-Protean軟件綜合分析預(yù)測GRAlO的B細(xì)胞優(yōu)勢表位(GRAlO192 215)，通過兩個氨基酸序列GS連接起來，人工合成弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽。
[0008]其次，本發(fā)明提供了所述人工合成弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽用于制備弓形蟲疫苗的應(yīng)用；
[0009]優(yōu)選的，用于制備用于預(yù)防和/治療人或動物弓形蟲病的疫苗。
[0010]進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了裝載所述弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗，可用于預(yù)防人或動物弓形蟲病。
[0011]所述弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽殼聚糖微球疫苗采用乳化交聯(lián)法獲得殼聚糖微球顆粒，使之吸附結(jié)合GRAlO復(fù)合表位肽，獲得裝載GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗，并觀察該疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠的免疫原性和小鼠抗RH株弓形蟲(I型株，主要為速殖子造成急性期感染)和PRU株弓形蟲(II型株，易形成包囊的蟲株)攻擊的保護(hù)效果。
[0012]本發(fā)明的裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗，對BALB/c小鼠進(jìn)行肌肉注射免疫。通過測定細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)指標(biāo)來評價疫苗的免疫原性，通過計數(shù)PRU株弓形蟲攻擊實驗后小鼠大腦中包囊的數(shù)量及RH株弓形蟲攻擊后小鼠生存率來評估疫苗的免疫保護(hù)性。結(jié)果表明:與對照組相比，裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗組能有效地降低免疫小鼠在弓形蟲PRU株(II型)攻擊后大腦包囊的形成率，提高弓形蟲攻擊后小鼠的免疫保護(hù)性反應(yīng)及生存率。本發(fā)明的突出效果是:該疫苗可作為控制弓形蟲慢性感染過程中腦組織包囊形成及急性感染時提高免疫反應(yīng)及生存率的有效的候選疫苗。
[0013]上述評估該疫苗的免疫原性的方式為:將微球疫苗經(jīng)肌肉注射免疫BALB/c小鼠2次，間隔3周。分別于第I次免疫前和免疫后2周，第2次免疫后2周和4周，于免疫鼠眼內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，測定血樣中的IgG及分型。于末次免疫后4周，無菌取免疫鼠的脾臟，通過200目銅網(wǎng)研磨制備脾單細(xì)胞懸液，加入GRAlO復(fù)合表位肽刺激培養(yǎng)后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子來評估該疫苗的的免疫原性。
[0014]上述評估該疫苗的免疫保護(hù)性的方式為:小鼠于末次免疫后4周，用II型弓形蟲PRU蟲株包囊20個攻擊。8周后處死小鼠，無菌條件下取腦，物理研磨制備腦組織勻漿液。顯微鏡下包囊計數(shù)。通過比較實驗組和對照組小鼠腦的包囊數(shù)來評價疫苗的免疫保護(hù)性。
[0015]本發(fā)明取得了以下有益效果:
[0016](I)通過疫苗的免疫原性試驗，證明了人工合成弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽及其制備的疫苗，具有極好的免疫原性，可有效地引發(fā)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答；
[0017](2)提高了生物體在弓形蟲攻擊下的存活率；
[0018](3)減少免疫小鼠的大腦包囊形成的數(shù)量，有效的保護(hù)免疫動物免于弓形蟲包囊的攻擊；
[0019](4)對于控制弓形蟲慢性感染，起到良好效果。
【附圖說明】
[0020]圖1:裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗的構(gòu)建。將篩選出的弓形蟲GRAlO的CD+8T細(xì)胞優(yōu)勢表位(GRAlO161 169)、CD+4T細(xì)胞優(yōu)勢表位(GRA1sq 94)和B細(xì)胞優(yōu)勢表位(GRAlO192 215)通過兩個氨基酸序列GS連接起來，人工合成弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽。采用乳化交聯(lián)法獲得殼聚糖微球顆粒，使之吸附結(jié)合GRAlO復(fù)合表位肽，獲得裝載GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗。
[0021]圖2:裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗的掃描電鏡成像示意圖。
[0022]圖3:免疫鼠血清中抗弓形蟲免疫球蛋白IgG含量的測定。分別在第0，14，35，49天免疫鼠內(nèi)眼眥取血法取血，分離血清。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清中總抗弓形蟲免疫球蛋白(Ig)的含量。如圖所示，在兩次免疫接種后，與對照組PBS和空微球CS組相比，微球疫苗CS-GlOE免疫組的抗體滴度水平增加明顯，在第35天和第49天，微球疫苗CS-GlOE免疫組小鼠中均檢測到高水平的弓形蟲特異性IgG抗體(P〈0.01)。
[0023]圖4:免疫鼠脾細(xì)胞中細(xì)胞因子(IL-2和IFN-γ)含量的測定。于末次免疫后4周，無菌取免疫鼠的脾臟，通過200目銅網(wǎng)研磨制備脾單細(xì)胞懸液，加入GRAlO復(fù)合表位肽刺激培養(yǎng)后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子的含量。如圖所示，與對照組PBS和空微球CS組相比，微球疫苗CS-GlOE免疫組的細(xì)胞因子含量顯著增加(P〈0.01)
[0024]圖5:裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗的免疫保護(hù)性。小鼠經(jīng)口感染懸浮于0.1毫升PBS中的弓形蟲包囊20個。感染兩個月后，所有小鼠均被處死，分離小鼠大腦進(jìn)行物理研磨，制備腦組織勻漿液。將腦組織勻漿液混勻，取10微升于顯微鏡下計數(shù)三次取平均值，小鼠腦的包囊數(shù)為10倍的平均值。免疫小鼠的攻擊實驗表明:與對