照組PBS和空微球CS組相比，微球疫苗CS-GlOE免疫組的小鼠存活率明顯提高，且腦中檢測到包囊數(shù)量顯著減少(Ρ〈0.01)
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0026]本發(fā)明中未詳盡描述的試劑、方法均為所屬領(lǐng)域的常規(guī)試劑、方法。
[0027]實例1.弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的合成
[0028]將篩選出的弓形蟲GRAlO的CD+8T細(xì)胞優(yōu)勢表位(GRAlO161 169)、CD+4T細(xì)胞優(yōu)勢表位(GRA1sq 94)和B細(xì)胞優(yōu)勢表位(GRAlO192 215)通過兩個氨基酸序列GS連接起來，人工合成弓形蟲 GRAlO 復(fù)合表位肽(SGFSLSSGSGVSVVEGSLGYCALLPLGSTQSPPESRKKRRRSGKKKRGKRSV)(圖1)。
[0029]實例2.裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗
[0030]將殼聚糖原材料溶于2%的醋酸中作為水相，制備含有5% SpanSO的液體石蠟作為油相，將水相逐滴加入油相，機(jī)械攪拌2h，逐漸滴加25%戊二醛(交聯(lián)劑)，繼續(xù)攪拌2h，3000rpm收集產(chǎn)物，依次用石油醚、異丙醇和蒸餾水各清洗3次，置于真空冷凍干燥機(jī)凍干，獲得空白殼聚糖微球顆粒。掃描電鏡下觀測微球形態(tài)，粒徑均勻，分散性好(圖2)。將弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽和乳化交聯(lián)法獲得的殼聚糖微球置于4°C連續(xù)震蕩24小時，獲得裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗。
[0031 ] 實例3.弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗免疫BALB/c鼠
[0032]SPF級雌性BALB/c鼠(6_8周)購自山東大學(xué)實驗動物中心。45只小鼠隨機(jī)分成3組，實驗組每組小鼠經(jīng)后腿肌肉注射667 μ g微球疫苗CS-GlOE (含100 μ gGlOE)，對照組注射免疫667 μ g空殼聚糖微球顆粒CS和100 μ I PBSo小鼠共免疫兩次，間隔三周。
[0033]實例4.免疫鼠體液免疫和細(xì)胞免疫水平的測定
[0034]分別在第0，14，35，49天小鼠內(nèi)眼眥取血法取血，血樣先在室溫下靜置3h，然后3000rpm，離心30min，收集血清。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清中總抗弓形蟲免疫球蛋白(Ig)的含量。結(jié)果如圖3所示。在兩次免疫接種后，與對照組PBS和空微球CS組相比，疫苗免疫組的抗體滴度水平增加明顯，在第35天和第49天，微球疫苗CS-GlOE免疫組小鼠中檢測到高水平的弓形蟲特異性IgG抗體(P〈0.01)(圖3)。
[0035]在末次免疫后4周，無菌取免疫鼠的脾臟，通過200目銅網(wǎng)研磨制備脾單細(xì)胞懸液。使用紅細(xì)胞裂解緩沖液除去脾細(xì)胞中的紅細(xì)胞后，重懸于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞懸浮液的濃度為3 X 17個細(xì)胞/ml，加入GRAlO復(fù)合表位肽刺激培養(yǎng)后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子的含量。結(jié)果表明，微球疫苗CS-GlOE免疫組的小鼠脾細(xì)胞中檢測出大量的IL-2及IFN-γ，明顯高于對照組(P〈0.01)。提示該微球疫苗主要誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖4)。
[0036]實例5.裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗的免疫保護(hù)性研究
[0037]末次免疫后4周，免疫小鼠進(jìn)行攻擊實驗。小鼠經(jīng)口感染懸浮于0.1毫升PBS中的弓形蟲包囊20個。感染兩個月后，所有小鼠均被處死，分離小鼠大腦進(jìn)行物理研磨，制備腦組織勻漿液。將腦組織勻漿液混均，取10微升于顯微鏡下計數(shù)三次取平均值，小鼠腦的包囊數(shù)為10倍的平均值。免疫小鼠的攻擊實驗表明:與對照組PBS或空微球CS組相比，微球疫苗CS-GlOE免疫組的小鼠存活率明顯提高，且腦中檢測到包囊數(shù)量顯著減少(P〈0.01)(圖 5)。
[0038]綜上所述，裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗可以有效的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。微球疫苗免疫不僅可以成功地提升體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，提高小鼠生存率，而且有效的保護(hù)免疫小鼠免于弓形蟲包囊的攻擊，減少免疫小鼠的大腦包囊形成的數(shù)量。該疫苗可作為控制弓形蟲急性或慢性感染的有效的候選疫苗，用于人和動物弓形蟲病的預(yù)防。
[0039]上述雖然對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽，其特征在于，該復(fù)合表位肽的序列為SGFSLSSGSGVSVVEGSLGYCALLPLGSTQSPPESRKKRRRSGKKKRGKRSVo2.編碼權(quán)利要求1所述復(fù)合表位肽的核酸。3.權(quán)利要求1所述肽或權(quán)利要求2所述核酸用于制備弓形蟲疫苗的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗用于預(yù)防和/治療人或動物弓形蟲病。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗用于控制弓形蟲急性或慢性感染。6.一種弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽殼聚糖微球疫苗的制備方法，其特征在于，制備獲得權(quán)利要求1所述弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽，然后用乳化交聯(lián)法獲得殼聚糖微球顆粒，使之吸附結(jié)合GRAlO復(fù)合表位肽，最終獲得裝載GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，將殼聚糖原材料溶于醋酸中作為水相，制備含有Span80的液體石蠟作為油相，將水相逐滴加入油相，機(jī)械攪拌，逐漸滴加戊二醛，攪拌收集產(chǎn)物，清洗，凍干，獲得空白殼聚糖微球顆粒；將弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽和乳化交聯(lián)法獲得的殼聚糖微球置于4°C連續(xù)震蕩24小時，獲得裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述方法，其特征在于，將殼聚糖原材料溶于2%醋酸中作為水相，制備含有5% SpanSO的液體石蠟作為油相，將水相逐滴加入油相，機(jī)械攪拌2h，逐漸滴加25%戊二醛，繼續(xù)攪拌2h，3000rpm收集產(chǎn)物，依次用石油醚、異丙醇和蒸餾水各清洗3次，置于真空冷凍干燥機(jī)凍干，獲得空白殼聚糖微球顆粒；將弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽和乳化交聯(lián)法獲得的殼聚糖微球置于4°C連續(xù)震蕩24小時，獲得裝載弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗。9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項所述方法制備得到的弓形蟲GRAlO復(fù)合表位肽殼聚糖微球疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種弓形蟲GRA10復(fù)合表位肽及其制備的疫苗，將篩選出的弓形蟲GRA10的三段表位(GRA1080-94、GRA10161-169、GRA10192-215)人工合成為復(fù)合表位肽，與乳化交聯(lián)法獲得的殼聚糖微球相結(jié)合，獲得裝載弓形蟲GRA10復(fù)合表位肽的殼聚糖微球疫苗。本發(fā)明的微球疫苗可有效地增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，有效地降低免疫小鼠在接受弓形蟲PRU株(II型)攻擊后大腦包囊的形成率，以及延長弓形蟲攻擊后小鼠的存活時間。該疫苗可作為預(yù)防弓形蟲感染，控制宿主腦組織中包囊形成的有效候選疫苗。
【IPC分類】C07K14/45, A61P33/02, C12N15/30, A61K47/36, A61K39/002
【公開號】CN105153292
【申請?zhí)枴緾N201510563797
【發(fā)明人】叢華, 尹繪權(quán), 張曉麗, 叢海滋, 周懷瑜, 何深一
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月7日