本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其是一株用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的溫度敏感型菌株及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

適宜的溫度是微生物生長所必需的條件，不同的溫度對微生物的能量代謝途徑可能造成一定影響。不同微生物其最適的生長溫度也不一樣，從而它們的遺傳物質(zhì)也會有一定差異。微生物外在環(huán)境溫度對微生物細(xì)胞膜的磷脂中飽和脂肪酸及不飽和脂肪酸的比例亦有影響。當(dāng)外界環(huán)境溫度下降時，不飽和脂肪酸的比例會隨之增高，而飽和脂肪酸的比例會下降。因?yàn)椴伙柡椭舅岷休^飽和脂肪酸多的雙鍵，熔點(diǎn)較低，所以在外界環(huán)境溫度降低時，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸比例的增加，可能具有使細(xì)胞膜流動性增加的功能，使細(xì)胞膜正常生理功能得以部分維持。當(dāng)外界環(huán)境溫度降低時，對微生物的影響主要還是在細(xì)胞中的蛋白質(zhì)上，因蛋白質(zhì)的斥水鍵強(qiáng)度在低溫時有減弱的情形，細(xì)胞中蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)會因之改變，使蛋白質(zhì)酵素與其它分子如一些反應(yīng)物間的作用方式或親和力發(fā)生變化，造成蛋白質(zhì)的功能及其調(diào)控方式與正常環(huán)境溫度不相同，因而影響微生物在低溫時生理代謝無法正常運(yùn)作。

溫度敏感菌株在培養(yǎng)基上對溫度敏感，這暗示溫度改變時會影響某些蛋白的生成。正常溫度下其蛋白可以正確構(gòu)象，一旦溫度升高則引起其蛋白變性。而且，溫度敏感型菌株，其細(xì)胞內(nèi)可能存在某些特定的溫度敏感元件，可以調(diào)控某些基因的表達(dá)及終止。這對于細(xì)胞呼吸、凋亡等過程的機(jī)理研究將有一定意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一株用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的溫度敏感型菌株。

本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述溫度敏感型菌株的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一株用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的溫度敏感型菌株，保藏編號為CGMCC 11808。

優(yōu)選的，上述用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的溫度敏感型菌株，18S rDNA序列為序列表<400>1所示序列，經(jīng)過18S rDNA鑒定，該菌株為被孢霉屬。

上述溫度敏感型菌株是從西藏雪山取樣，經(jīng)過初篩、分離、純化菌株，再經(jīng)過篩選及性能分析的步驟，獲得了一株溫度敏感型菌株。該菌株與菌種保藏中心的高山被孢霉ATCC 16266形態(tài)、最適生長溫度等方面存在差異。

優(yōu)選的，上述用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的溫度敏感型菌株，為溫度敏感型菌株，該菌株在溫度為25℃時可以正常生長，當(dāng)溫度高于26℃時其菌絲不能夠正常延伸，溫度高于27℃時，其菌落形態(tài)明顯變小，溫度高于30℃時則完全不生長。

上述用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的溫度敏感型菌株的應(yīng)用，所述菌株在25℃的條件下以發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，經(jīng)氣相色譜檢測其可產(chǎn)生多種不飽和脂肪酸。

優(yōu)選的，上述溫度敏感型菌株的應(yīng)用，所述不飽和脂肪酸為棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亞油酸或γ-亞麻酸。

上述用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的溫度敏感型菌株的發(fā)酵方法，高山被孢霉菌株孢子接種到PDA平板上：25℃黑暗培養(yǎng)4-5d，將孢子洗下后將孢子濃度調(diào)整到1×10⁵/mL并接種到種子培養(yǎng)基，25℃、200rpm培養(yǎng)24h，按10％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中25℃、200rpm發(fā)酵培養(yǎng)5d。

優(yōu)選的，上述溫度敏感型菌株的發(fā)酵方法，所述種子培養(yǎng)基按g/L計為：葡萄糖30，酵母浸出物6，KH₂PO₄ 2，MgSO₄·7H₂0 0.5，NaNO₃ 2，pH＝6.0，115℃滅菌20min。

優(yōu)選的，上述溫度敏感型菌株的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L計為：葡萄糖50，酵母浸出物10，KH₂PO₄ 2，MgSO₄·7H₂0 1，pH＝6.0，115℃滅菌20min，發(fā)酵培養(yǎng)條件：發(fā)酵培養(yǎng)基中25℃、200rpm發(fā)酵培養(yǎng)5d。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明將來源于西藏雪山的土樣，經(jīng)過初篩、分離、純化菌株，再經(jīng)過篩選及性能分析的步驟，獲得了一株溫度敏感型菌株。

2、本發(fā)明首次篩選和發(fā)現(xiàn)了溫度敏感型菌株，使得對高山被孢霉基因組中可能存在溫度敏感型元件的研究成為可能。

3、本發(fā)明所篩選出的溫度敏感型菌株，其基因組中可能存在溫度敏感型啟動子，為將來進(jìn)一步的研究提供了豐富的基因資源。

4、本發(fā)明中篩選的產(chǎn)油霉菌高山被孢霉能產(chǎn)生多種不飽和脂肪酸，在以葡萄糖為主要碳源的培養(yǎng)基中，可產(chǎn)生多種不飽和脂肪酸。

保藏信息

分類名詞：高山被孢霉Mortierella alpina

保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2015年12月07日

保藏號：CGMCC 11808

附圖說明

圖1為本發(fā)明18S rDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2為所述菌株在25℃時在PDA平板上的正反形態(tài)圖。

圖3為所述菌株在PDA培養(yǎng)基上不同時間不同溫度的菌落形態(tài)圖。結(jié)果顯示，該菌株在20℃-25℃時，菌落形態(tài)較大，當(dāng)溫度高于26℃時，菌落變小，菌絲皺縮，溫度高于28℃時則完全不生長。

圖4為所述菌株S266與ATCC16266在PDA培養(yǎng)基上生長5天不同溫度的菌落形態(tài)比較。結(jié)果顯示，ATCC16266在不同溫度條件下菌落形態(tài)變化不大，而所述菌株的菌落形態(tài)則有較大差異。

圖5為所述菌株與ATCC16266在25℃和30℃培養(yǎng)條件下其菌絲的顯微形態(tài)。圖5A為S266在30℃時生長3天其菌絲形態(tài)；圖5B為ATCC16266在30℃時生長3天其菌絲形態(tài)；圖5C為S266在25℃時生長3天其菌絲形態(tài)；圖5D為ATCC16266在25℃時生長3天其菌絲形態(tài)。結(jié)果顯示，在25℃時，二者的菌絲都可以正常延伸，而30℃時ATCC16266的菌絲仍可生長，所述菌株的孢子則沒有萌發(fā)。

圖6為氣相色譜檢測到的該菌株發(fā)酵所產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸。其中，圖6A為脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品；圖6B為本發(fā)明所述菌體所含脂肪酸氣相色譜圖；圖6C為ATCC 16266所含脂肪酸氣相色譜圖。經(jīng)檢測可以看出，S266可產(chǎn)生大量棕櫚酸，十七烷酸，硬脂酸，油酸，亞油酸，γ-亞麻酸等其他脂肪酸。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

一株溫度敏感型菌株的篩選與鑒定

1.平板篩選

將從西藏雪山采集的土樣1g放入裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，充分震蕩后梯度稀釋至10^-5。因在自然條件下雪山處于高寒地區(qū),溫度較低。取上述各梯度的稀釋液0.2mL涂布PDA平板，在20℃恒溫倒置培養(yǎng)至長出單菌落。

2.18S rDNA的鑒定

根據(jù)篩選出單菌落的菌株，合成真菌18S rDNA的特異性引物，擴(kuò)增DNA，純化PCR產(chǎn)物并測序。

表1所用引物序列

步驟如下：

1.PCR擴(kuò)增：選用真菌ITS1/ITS4通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。

2.PCR產(chǎn)物純化：純化PCR產(chǎn)物。

3.測序：正反向兩個反應(yīng)測序。

PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2μl，dNTP(2mM)2μl，MgSO₄(25mM)0.8μ，上游引物ITS1和下游引物ITS4各0.6μl，模板(篩選出的溫度敏感型菌株全基因組DNA)1μl，KOD plus(購自TOYOBO公司)聚合酶0.4μl，加無菌水至終體積為20μl。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性15s，58℃退火30s，68℃延伸50s，反應(yīng)35個循環(huán)，68℃后延伸10min。

經(jīng)過18S rDNA鑒定，該菌株為被孢霉屬高山被孢霉，將其編號為S266，18S rDNA序列為序列表<400>1所示序列。該菌株與菌種保藏中心的高山被孢霉ATCC16266菌落形態(tài)、最適生長溫度等方面存在差異。所述18S rDNA鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1,圖中M為DNA Marker,從上至下依次為10000,8000,6000,5000,4000,3500,3000,2500,2000,1500,1000,750,500,250bp。1,2為S266以ITS1/ITS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的純化產(chǎn)物。18S rDNA序列為序列表<400>1所示序列。

3.對該菌株的表型分析及插片顯微觀察

1.表型分析

將所得菌株挑取單菌落接種到PDA平板，倒置于不同溫度培養(yǎng)箱中觀察其菌絲延伸狀態(tài)見圖2-4。

2.顯微形態(tài)

將高山被孢霉菌株接種到PDA平板上25℃黑暗培養(yǎng)4-5d，將孢子洗下后吸取10μ緩慢加到插有插片的PDA培養(yǎng)基，將其放于不同溫度培養(yǎng)箱，生長2天后取下插片用顯微鏡觀察其菌絲延伸狀態(tài)，見圖5。

實(shí)施例2

高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)物不飽和脂肪酸的分析

將高山被孢霉菌株接種到PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)4-5d，將孢子洗下后將孢子濃度調(diào)整到1-2×10⁵/ml接種到種子培養(yǎng)基，25℃、200rpm培養(yǎng)24h，按1％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中25℃、200rpm發(fā)酵培養(yǎng)5d。發(fā)酵結(jié)束后真空抽濾收集菌體，將菌體于50℃烘干至恒重。

培養(yǎng)基配方如下：

種子培養(yǎng)基，按g/L計為：葡萄糖 30g，酵母膏6g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂0 0.5g，NaNO₃ 2g，其余為蒸餾水，pH＝6.0，115℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L計為：葡萄糖 50g，酵母浸出物 10g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂0 1g，其余為蒸餾水，PH＝6.0，115℃滅菌20min。其中葡萄糖配制50％，115℃滅菌20min。

樣品處理方法如下：

取干菌體0.1g，進(jìn)行油脂的提取

⑴加入2mL濃HCl劇烈振蕩重懸菌體，并將濕菌體轉(zhuǎn)入具塞試管中，劇烈振蕩1min。

⑵70℃消化1-1.5h，直至菌體完全溶解(可每隔15min劇烈振蕩混勻1次)。

⑶加入1.5mL 10％鹽酸甲醇溶液，劇烈振蕩1min。

⑷62℃酯化2h，冷卻后加入3mL正己烷，劇烈振蕩1min。

⑸4℃、6000r/min離心5min。

⑹吸取上層用0.22有機(jī)濾膜過濾到樣品瓶中。

⑺立即用氣相色譜儀對脂肪酸甲酯進(jìn)行分析。

氣相色譜條件：

用氣相色譜儀配以氫火焰離子檢測器FID和氣相色譜柱(TR-Was MS，30m×0.25mm×0.25μm)，載氣為氮?dú)猓細(xì)鉃闅錃?。柱前壓?4.543Pa，柱流速1mL/min，分流比50:1。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?20℃保持5min，以10℃/min升溫到200℃，保持5min，再以3℃/min升溫到230℃，保持10min，總時間為38min。進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測器溫度為260℃。進(jìn)樣量1μl。結(jié)果如圖6所示，經(jīng)檢測可以看出，該菌株的基因組中也可能存在溫度敏感性啟動子，所述菌株為產(chǎn)多不飽和脂肪酸溫度敏感型菌株，可產(chǎn)生大量棕櫚酸，十七烷酸，硬脂酸，油酸，亞油酸，γ-亞麻酸等其他脂肪酸。說明該菌可以產(chǎn)生多種多不飽和脂肪酸。

上述參照實(shí)施例是對該溫度敏感型菌株的篩選及鑒定的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110> 天津科技大學(xué)

<120> 一種用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的溫度敏感型菌株及應(yīng)用

<130> 2016

<150> 2015108619635

<151> 2015-11-30

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 682

<212> DNA

<213> 高山被孢霉菌株孢子

<220>

<221> 18S rDNA序列

<222> (1)..(682)

<400> 1

tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtagtct tacttgattt gagatcgagt 60

ttacaaagtc agccgcgaag ctgtctctgt gaatcctgca tcagtcagca caagaactca 120

tctcctttat gttagctgca gcaaaggtaa taatctgttt tttaggcaga ctaaatagat 180

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