本發(fā)明涉及功能微生物篩選
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種拜萊青霉及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：磷是植物生長所必須的營養(yǎng)元素之一，磷對植物的重要性不言而喻，同時磷元素是植株體內(nèi)多種化合物的組成成分，參與植物體的新陳代謝，不僅能夠提高作物含量，還能增加植物抗逆性。植株主要利用土壤中的有效磷，但是，土壤中的磷95％以上為植物難以利用的無效磷，為了滿足作物的生長，人們往往會通過施加大量磷肥來提高作物產(chǎn)量，這導(dǎo)致磷酸鹽迅速在土壤中積累，不僅造成磷素資源的浪費，而且對水體環(huán)境安全構(gòu)成一定的威脅。因此，提高土壤中難溶性磷的利用效率對于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展具有重要意義。研究表明，土壤中大量存在一些能夠轉(zhuǎn)化難溶磷的溶磷微生物，溶磷微生物在轉(zhuǎn)化土壤難溶磷方面已經(jīng)引起了國內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注，被世界公認為經(jīng)濟高效環(huán)保的生物措施。溶磷微生物是土壤中存在的一些能將難溶態(tài)的無機磷或有機磷轉(zhuǎn)化為易于被植物吸收利用的水溶性磷，提高了土壤的供磷水平，從而增加作物產(chǎn)量。另外，溶磷微生物還能分泌生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進農(nóng)作物植物根系對鋅、銅等其它營養(yǎng)元素的吸收，增強植物抗病能力，并減少環(huán)境污染。具有溶磷作用的微生物種類繁多，大體上可分為三大類：溶磷細菌、溶磷真菌和溶磷放線菌。溶磷細菌現(xiàn)研究報道的有：芽孢桿菌屬(Bacillus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、腸細菌屬(Enterbacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、固氮菌屬(Azotobacter)等的26個菌屬；溶磷真菌報道的有青霉菌屬(penicillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉菌屬(Aspergillu)、小菌核菌屬(Sclerotium)和根霉菌屬(Rhizopus)等；溶磷放線菌主要為鏈霉菌屬(Streptomyces)、AM菌根菌等。Narsian等(2000)通過對不同溶磷菌溶磷能力的比較，得出曲霉在不同的溶磷菌中的溶磷活性最高，并將磷礦粉中45％的磷溶解出來。Agnihotri等(1970)研究的一株拜萊青霉可以將磷礦粉中80％的磷溶解出來。Kucey和Leggett(1989)將拜萊青霉菌(Penicilliumbilaji)接種與盆栽土壤中，同時加入磷礦石，研究發(fā)現(xiàn)接種菌的油菜吸磷量與施用磷肥油菜額定的吸磷量沒有差異。范丙全(2010)將溶磷青霉菌P8接種于土壤中，發(fā)現(xiàn)接種青霉菌P8后能提高作物的吸磷量，青霉菌P8對作物的促生效果較為明顯。研究證明，溶磷微生物不僅能提高土壤有效磷，還可以促進作物的生長，提高作物的抗逆性，應(yīng)用溶磷微生物，提高當(dāng)季磷肥使用率，增加土壤難溶磷的轉(zhuǎn)化率，節(jié)省磷肥的浪費，對延長我國有限磷礦使用年限和促進農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展意義重大，并且對解決施加磷肥帶來的環(huán)境污染問題具有深遠的實踐意義。因此，篩選出溶磷穩(wěn)定、增產(chǎn)穩(wěn)定、環(huán)境適應(yīng)力強，高效的溶磷微生物菌株刻不容緩。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種高效解磷的拜萊青霉(Penicilliumbilaji)菌株以及該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。所述拜萊青霉菌株是從山東省萊州市彭家磷礦區(qū)的土壤中篩選得到的，能高效利用土壤中的難溶磷，并有效降低土壤中的重金屬含量，應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明一方面提供了一種拜萊青霉VLD-11(PenicilliumbilajiVLD-11)，已于2015年11月23日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2015690。本發(fā)明另一方面提供了一種微生物制劑，是通過將上述拜萊青霉VLD-11進行發(fā)酵得到的。本發(fā)明還提供了一種解磷菌劑，包含所述微生物制劑。所述解磷菌劑還包含枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、丁酸梭菌、草酸青霉、黑曲霉中的任意一種或兩種或多種的組合。本發(fā)明還提供了所述拜萊青霉在農(nóng)作物育苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述拜萊青霉在土壤修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種土壤修復(fù)劑，包含所述拜萊青霉和羥磷灰石。本發(fā)明篩選到的拜萊青霉VLD-11能將難溶性無機磷液體培養(yǎng)基中的難溶磷(Ca3(PO4)2)分解成可溶性的有效磷，使培養(yǎng)基中有效磷含量高達1.976mg/mL，解磷效果顯著。在油菜大田栽培實驗中，拜萊青霉VLD-11處理組油菜的平均鮮重和干重比空白對照組分別提高了354.7％和297.8％，比培養(yǎng)基處理組分別提高350.9％和292.7％，有效磷含量比空白處理組提高了89.8％，比培養(yǎng)基處理組提高了87.1％。本發(fā)明提供的拜萊青霉VLD-11還能顯著提高水稻的育苗質(zhì)量。與空白對照組相比，拜萊青霉VLD-11處理組水稻秧苗的莖粗，根數(shù)，葉齡，1-2葉間距分別提高了25％，20.5％，31.9％，31.4％，株高，第二葉長和葉綠素含量也得到不同程度的提高，效果非常顯著。此外，所述拜萊青霉VLD-11能與羥磷灰石協(xié)同作用，有效促進游離態(tài)重金屬的固定，降低土壤中游離態(tài)重金屬的含量，在一定程度上的恢復(fù)重金屬污染土壤，前景廣闊。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。對于實施例中所用到的具體方法或材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明技術(shù)思路的基礎(chǔ)上，根據(jù)已有的技術(shù)進行常規(guī)的替換選擇，而不僅限于本發(fā)明實施例的具體記載。本發(fā)明所選用的設(shè)備和試劑可以選自市售任意一種。實施例1具有解磷功能的微生物篩選與鑒定1、初篩土壤樣品：取自山東省萊州市彭家磷礦區(qū)的土壤；土壤稀釋液的制備：稱取0.5g土壤樣品溶于4.5ml無菌水中制成1：10的土壤溶液，然后從中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml無菌水中，制成1：100的土壤溶液，以此方法類推，制備1：106-107的土壤稀釋溶液。取0.1ml土壤稀釋溶液均勻涂布于難溶性無機磷固體培養(yǎng)基(葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KC10.3g，MgSO4·7H200.3g，F(xiàn)eSO4.7H200.03g，MnSO4.4H200.03g，Ca3(PO4)25.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.5，瓊脂20g，115℃滅菌30min)上，30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3天，觀察培養(yǎng)基上長出的菌落，其中有11個菌落周圍產(chǎn)生了明顯的顏色變化，并有透明圈產(chǎn)生，將其分別命名為VLD-1，VLD-2，……，VLD-11。2、復(fù)篩將實施例1初篩得到的11株菌分別接種到難溶性無機磷固體培養(yǎng)基(葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KC10.3g，MgSO4·7H200.3g，F(xiàn)eSO4.7H200.03g，MnSO4.4H200.03g，Ca3(PO4)25.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.5，瓊脂20g，115℃滅菌30min)上，30℃培養(yǎng)3天后，觀察菌落周圍透明圈的大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)透明圈最大的3株菌株分別為VLD-2，VLD-9，VLD-11。將上述3株菌分別接種到50mL難溶性無機磷液體培養(yǎng)基(葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KC10.3g，MgSO4.7H200.3g，F(xiàn)eSO4.7H200.03g，MnSO4.4H200.03g，Ca3(PO4)25.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.5，115℃滅菌30min)中，30℃，200rpm，培養(yǎng)7天，同時以不加任何菌的液體解磷培養(yǎng)基作為對照組；分別檢測培養(yǎng)液中的有效磷的含量，具體結(jié)果見表1。2.1磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制依次吸取5mg/l的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0ml于試管中，然后各加入鉬銻抗顯色劑2ml，蒸餾水定容至20ml，搖勻靜置20min，700nm波長下測定吸光度。此時各管中磷的濃度分為：0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.00mg/l。以磷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2培養(yǎng)液有效磷含量測定在無菌條件下分別取上述3株菌的培養(yǎng)液各5ml，8000rpm，離心5min，取上清液，稀釋到合適的濃度，吸取0.5ml稀釋液至試管中，加5ml蒸餾水，加2滴2,4-二硝基酚指示劑，加2ml鉬銻抗顯色劑，然后用蒸餾水定容至20ml，搖勻靜置20min，于700nm波長下比色，吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液中的有效磷含量，具體結(jié)果見表1。表1不同菌株的解磷效果樣品有效磷含量(mg/mL)空白對照組0VLD-21.254VLD-91.139VLD-111.976從表1中的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明從磷礦區(qū)土壤中篩選到的三株菌株均具有較強的解磷能力，能將培養(yǎng)基中的難溶磷(Ca3(PO4)2)分解成可溶性的有效磷，其中VLD-11菌株的的解磷效率最高，其培養(yǎng)液中有效磷含量高達1.976mg/mL，取得了意料不到的效果。3、菌株鑒定申請人采用分子生物學(xué)的方法對篩選到的VLD-11菌株進行鑒定，測得其18srDNA序列，并在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行blast比對。結(jié)果顯示，其18srDNA序列與拜萊青霉(Penicilliumbilaji)的序列相似度最高，達99％。申請人確認VLD-11菌株為拜萊青霉(Penicilliumbilaji)，并將其命名為拜萊青霉VLD-11(PenicilliumbilajiVLD-11)。申請人已于2015年11月23日將上述拜萊青霉VLD-11(PenicilliumbilajiVLD-11)于保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2015690。實施例2拜萊青霉VLD-11在油菜大田栽培實驗中的應(yīng)用1、拜萊青霉VLD-11菌液的制備：先將上述拜萊青霉VLD-11接種到PDA固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-4天至孢子成熟，將長好的孢子用適量無菌生理鹽水洗下，轉(zhuǎn)接入馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，充分混合均勻，于30℃培養(yǎng)4天，發(fā)酵液中孢子含量為109-1010CFU/mL。2、實驗地點：青島市嶗山區(qū)枯桃村油菜種植大棚，土壤整體狀況較為均勻。3、實驗過程：選取2m×2m的方形區(qū)域作為一個實驗區(qū)，共設(shè)置30個實驗區(qū)，且每個實驗區(qū)之間保持1米的間隔。實驗共設(shè)3個組：①空白對照組：不添加任何物質(zhì)；②培養(yǎng)基處理組：在每個實驗區(qū)中按40mL/m2的比例均勻噴灑上述滅菌的馬鈴薯液體培養(yǎng)基，然后將表層5-10cm厚的土壤進行有效混勻；③拜萊青霉VLD-11處理組：在每個實驗區(qū)中按40mL/m2的比例均勻噴灑上述拜萊青霉VLD-11發(fā)酵菌液，然后將表層5-10cm厚的土壤進行有效混勻。每個組隨機選擇10個實驗區(qū)。1)種子處理：用5％的次氯酸鈉表面滅菌油菜種子10min，用蒸餾水清洗3-4次除去次氯酸鈉后在常溫下放置30min自然干燥。2)播種與收獲：在每個實驗區(qū)均勻播種30g油菜種子，定時澆水和管理，不施加肥料。播種45天后，收獲全部油菜，并分別檢測每個實驗區(qū)油菜的鮮重和干重，計算每個處理組油菜的平均鮮重和平均干重，進行比較。3)收獲油菜的同時，分別采集每個實驗區(qū)的土樣，采用Olsen法檢測土樣中有效磷的含量，并進行比較。試驗結(jié)果表明：與空白對照組相比，培養(yǎng)基處理組油菜的平均鮮重和干重分別提高了5.56％和6.21％，有效磷含量提高了3.1％；拜萊青霉VLD-11處理組油菜的平均鮮重和干重比空白對照組分別提高了354.7％和297.8％，比培養(yǎng)基處理組分別提高350.9％和292.7％，有效磷含量比空白處理組提高了89.8％，比培養(yǎng)基處理組提高了87.1％。從而說明，使用本發(fā)明篩選到的拜萊青霉VLD-11能有效提高土壤中有效磷的含量，進而大幅度提高種植作物的產(chǎn)量，取得了意料不到的效果。本發(fā)明所述拜萊青霉VLD-11可單獨使用，也可與黑曲霉、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、丁酸梭菌、草酸青霉中的任意一種或兩種或多種的組合混合制備解磷菌劑，能使土壤中有效磷的含量普遍提高50％-90％，效果顯著。實施例3拜萊青霉VLD-11在水稻育苗中的應(yīng)用1、實驗地點：黑龍江省鶴崗市寶泉嶺農(nóng)場二隊4號育苗大棚。2、實驗處理組設(shè)計：空白對照組：僅采用育苗基質(zhì)(購自浙江錦海育苗基質(zhì)廠)；拜萊青霉VLD-11處理組：1.2kg拜萊青霉VLD-11孢子粉(109CFU/g)與1噸育苗基質(zhì)摻勻；以上兩個處理組的播種、灌溉和施肥等管理相同，整個育苗期約為40天。3、實驗結(jié)果及分析(1)水稻秧苗形態(tài)及葉綠素含量評價從各處理組育苗盤的中央隨機抽取100株秧苗，用清水沖洗干凈后進行考苗，并檢測第二葉的葉綠素含量。結(jié)果見表3。表2拜萊青霉VLD-11對水稻苗株生長的影響從表2的結(jié)果可以看出，本發(fā)明提供的拜萊青霉VLD-11能顯著提高水稻的育苗質(zhì)量。與空白對照組相比，拜萊青霉VLD-11處理組水稻秧苗的莖粗，根數(shù)，葉齡，1-2葉間距分別提高了25％，20.5％，31.9％，31.4％，株高，第二葉長和葉綠素含量也得到不同程度的提高，效果非常顯著。(2)水稻秧苗素質(zhì)評價百株干重和壯苗指數(shù)是秧苗素質(zhì)高低的重要指標(biāo)。壯苗指數(shù)＝(莖粗×100株秧苗全株干重)/株高。本發(fā)明所述拜萊青霉VLD-11處理組的水稻秧苗百株干重比空白對照組增加了36.32％，壯苗指數(shù)增加了56.15％，取得了意料不到的技術(shù)效果。綜上所述，本發(fā)明篩選到的拜萊青霉VLD-11不僅能有效提高土壤中有效磷的含量，還能能有效加快水稻秧苗的葉齡進程，有利于爭取積溫；增加莖粗，有利于莖維管束的發(fā)育，為保障水稻穗數(shù)和形成大穗提供了必要的秧苗基礎(chǔ)；增加葉間距和葉長，提高葉片葉綠素含量，有利于促進光合作用和光合產(chǎn)物的積累；增加水稻根數(shù)，有助于加快秧苗移栽后的返青速度。因此，所述拜萊青霉VLD-11能顯著提高水稻秧苗的素質(zhì)，進而直接有利于提高水稻產(chǎn)量。實施例4拜萊青霉VLD-11在土壤修復(fù)中的應(yīng)用采集青島市嶗山區(qū)仰口景區(qū)山地土壤10kg。所釆土壤在干燥通風(fēng)處自然風(fēng)干，研磨過2mm孔徑篩，混勻，污染Pb的添加濃度為2g/kg，以Pb(NO3)2溶液的形式加入土壤后混勻，置通風(fēng)處自然風(fēng)干，老化60天后過2mm孔徑篩，并充分混勻，土壤中Pb2+含量為2.04g/kg。分別稱取過8目的風(fēng)干土壤200g于500mL三角瓶中，處理組1只添加10g羥基磷灰石(100目)；處理組2只添加2g拜萊青霉VLD-11孢子粉(109CFU/g)；處理組3同時添加10g羥基磷灰石(100目)和2g拜萊青霉VLD-11孢子粉(109CFU/g)。將羥基磷灰石、拜萊青霉VLD-11孢子粉與土壤充分混勻，用去離子水調(diào)節(jié)土壤含水量至20％～25％，于室溫培養(yǎng)，同時設(shè)置空白對照組，各處理設(shè)置三個重復(fù)。培養(yǎng)30天后，取樣烘干，分別用二乙三胺五乙酸(DTPA)溶液浸提游離態(tài)重金屬鉛，振蕩過濾，測定濾液中游離鉛的濃度，計算游離鉛的去除率，具體結(jié)果見表1。表1羥基磷灰石和/或拜萊青霉對土壤中游離鉛的去除效果從表1的結(jié)果可以看出，單獨添加5％羥基磷灰石的處理組1土壤中游離鉛的去除率僅為19.75％，而單獨添加1％本發(fā)明提供的拜萊青霉VLD-11孢子粉的處理組2土壤中游離鉛的去除率能達到30.78％，效果非常顯著；同時添加羥基磷灰石和拜萊青霉VLD-11的處理組3土壤中游離鉛的去除率高達90.64％，說明拜萊青霉VLD-11能與羥磷灰石協(xié)同作用，有效促進游離鉛的固定，降低土壤中游離鉛的含量，在一定程度上的恢復(fù)鉛污染土壤。除了鉛污染土壤之外，對于其他重金屬污染土壤，如鋅污染、銅污染、鎘污染、汞污染等，本發(fā)明提供的拜萊青霉VLD-11均具有一定的修復(fù)效果，對游離態(tài)重金屬的去除率能達到30％以上，拜萊青霉VLD-11與羥磷灰石協(xié)同作用，對游離態(tài)重金屬的去除率能達到85％以上，效果顯著，應(yīng)用前景廣闊。當(dāng)前第1頁1 2 3