本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種暗色環(huán)紋炭團菌的分離方法。
背景技術(shù)：
三七具有顯著的活血化瘀、消腫定痛功效，是一種中國傳統(tǒng)名貴藥材。近年來，對三七原材料的需求日益增長，但是栽培過程中的真菌病害嚴重影響了三七生長。三七黑斑病、能侵染三七植株和地下根系，以莖、葉、花軸受害較重，根部感染后呈褐色濕腐狀，四季均可發(fā)生。三七圓斑病可為害植株各個部位，葉片發(fā)病初期葉背面呈現(xiàn)黃色小點，在天氣潮濕或連續(xù)陰雨天，迅速擴大成透明狀圓形，可引起芽腐和莖基腐。三七灰霉病以危害葉為主，多從下部老葉的葉尖或近地部分葉柄發(fā)病，灰褐色病斑，腐爛。在廣西三七的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，由于低海拔及高溫多濕的氣象條件，這種病害往往是同時發(fā)生的，造成了三七的大量減產(chǎn)甚至絕收，給種植戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失。
目前，在三七種植上，防治真菌病害過度依賴化學(xué)農(nóng)藥，大量化學(xué)農(nóng)藥的使用不僅影響了三七的品質(zhì)，也造成了三七藥材的大量農(nóng)藥殘留。因此，開展生物防治三七真菌病害對三七產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展是非常迫切和必要的。為此篩選出能同時拮抗這些病害的拮抗菌具有重大意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種暗色環(huán)紋炭團菌的分離方法，通過此方法首次在三七中分離得到暗色環(huán)紋炭團菌，且分離得到的暗色環(huán)紋炭團菌對三七灰霉病、三七圓斑病和三七黑斑病病原菌菌絲具有很強的抑制作用，同時還對苦玄參褐斑病、艾納香條斑病、廣西莪術(shù)葉斑病、草豆蔻葉斑病和羅漢果斑枯病病原菌菌絲具有很高的抵制率。
為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種暗色環(huán)紋炭團菌的分離方法，暗色環(huán)紋炭團菌是從三七中分離獲得。
優(yōu)選的是，暗色環(huán)紋炭團菌是從三七的莖部分離獲得。
優(yōu)選的是，包括以下步驟：
步驟一、取三七的莖部，用流水將其沖洗干凈，進行無菌消毒處理，在無菌條件下去除表皮組織，加入無菌水研磨得到研磨液，再用無菌水將研磨液稀釋至其體積的100～1000倍，得到稀釋液；取稀釋液涂布于改良的PDA培養(yǎng)基上，置于25～28℃的培養(yǎng)箱中分離培養(yǎng)42～54h，得到多個菌落；再將多個菌落在改良的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)42～54h，培養(yǎng)溫度為25～28℃，得多種菌株，然后將獲得的多種菌株轉(zhuǎn)移至改良的PDA培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)42～54h，培養(yǎng)溫度為25～28℃，然后置于4℃環(huán)境下保存，備用；
其中所述改良的PDA培養(yǎng)基包括PDA、0.04～0.1mg琥珀酸鈉和100～150mL的三七莖葉原漿；
步驟二、將步驟一中保存的多種菌株分別和三七黑斑病病原菌進行對峙培養(yǎng)3～5d，對峙培養(yǎng)溫度為25～28℃，其抑制率大于或等于90％的菌株即為暗色環(huán)紋炭團菌。
優(yōu)選的是，無菌消毒處理具體為：用質(zhì)量分數(shù)為75％的酒精浸泡2～5min，酒精要蓋過三七的莖部，然后將三七的莖部移至質(zhì)量分數(shù)為1％的次氯酸鈉溶液中浸泡3～8min，次氯酸鈉溶液要蓋過三七的莖部，再用無菌水沖洗4～6次。
優(yōu)選的是，在無菌消毒處理之前還包括對三七的莖部進行預(yù)處理：將三七的莖部用質(zhì)量分數(shù)為15％的魔芋粉溶液在30～40℃下浸泡15～20min，魔芋粉溶液要蓋過三七的莖部，取出瀝干后再在三七的莖部表面涂上植物油。
優(yōu)選的是，所述植物油為大豆油或者玉米油或者椰子油。
優(yōu)選的是，步驟一中三七莖葉原漿的制備方法：將三七的莖和葉放入研缽中，加入冰水研磨30min，然后加入濃度均為10μmol/L的胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液，置于超聲波中以60kHz超聲頻率處理40min，再用研缽研磨10min，置于超聲波中以60kHz超聲頻率處理20min，過濾即得，保存在4℃環(huán)境中，備用；
其中三七的莖、葉、冰水、胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液的質(zhì)量體積比例為1g:1g:10mL:1mL:1mL:1mL:1mL。
本發(fā)明還提供了一種采用上述分離方法獲得的暗色環(huán)紋炭團菌的應(yīng)用，在防治三七灰霉病、三七圓斑病、苦玄參褐斑病、艾納香條斑病、廣西莪術(shù)葉斑病、草豆蔻葉斑病和羅漢果斑枯病中的應(yīng)用。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：
第一、首次從三七中分離得暗色環(huán)紋炭團菌；
第二、在PDA培養(yǎng)基中加入琥珀酸鈉和三七莖葉原漿，琥珀酸鈉可以促進暗色環(huán)紋炭團菌吸收營養(yǎng)物質(zhì)，三七莖葉原漿可以提供暗色環(huán)紋炭團菌繁殖所需要的活性物質(zhì)，兩者結(jié)合可以加快暗色環(huán)紋炭團菌繁殖的速度，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)得到更多其菌體；
第三、對三七的莖部消毒處理前，采用魔芋粉溶液浸泡和涂抹植物油的方法，可以在三七的莖表面形成一層保護膜，使其在消毒處理過程中，防止其它化學(xué)物質(zhì)進入三七的莖內(nèi)部，保護其內(nèi)部菌的活性，有利于暗色環(huán)紋炭團菌的分離；
第四、制備三七莖葉原漿時，加入胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液并進行超聲處理，可以促使三七莖葉原漿中活性物質(zhì)的流出，并在低溫環(huán)境中和氨基酸作用下保持其活性，降低活性的損失；
第五、通過本發(fā)明方法分離獲得的暗色環(huán)紋炭團菌對三七灰霉病病原菌、三七圓斑病病原菌、苦玄參褐斑病病原菌、艾納香條斑病病原菌、廣西莪術(shù)葉斑病病原菌、草豆蔻葉斑病病原菌和羅漢果斑枯病病原菌菌絲具有極強的抑制作用。
本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
具體實施方式
下面對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
<實施例1>
一、暗色環(huán)紋炭團菌的分離方法，包括以下步驟：
步驟一、取三七的莖部，用流水將其沖洗干凈，進行無菌消毒處理，在無菌條件下去除表皮組織，加入無菌水研磨得到研磨液，再用無菌水將研磨液稀釋至其體積的1000倍，得到稀釋液；取稀釋液涂布于改良的PDA培養(yǎng)基上，置于28℃的培養(yǎng)箱中分離培養(yǎng)48h，得到多個菌落；再將多個菌落在改良的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度為28℃，得多種菌株，然后將獲得的多種菌株轉(zhuǎn)移至改良的PDA培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度為28℃，然后置于4℃環(huán)境下保存，備用；其中所述改良的PDA培養(yǎng)基包括PDA、0.05mg琥珀酸鈉和100mL的三七莖葉原漿；
步驟二、將步驟一中保存的多種菌株分別和三七黑斑病病原菌進行對峙培養(yǎng)5d，對峙培養(yǎng)溫度為28℃，篩選出抑制率大于或等于90％的菌株，即為暗色環(huán)紋炭團菌；
其中，無菌消毒處理具體為：用質(zhì)量分數(shù)為75％的酒精浸泡2min，酒精要蓋過三七的莖部，然后將三七的莖部移至質(zhì)量分數(shù)為1％的次氯酸鈉溶液中浸泡5min，次氯酸鈉溶液要蓋過三七的莖部，再用無菌水沖洗4次。
<實施例2>
一、暗色環(huán)紋炭團菌的分離方法，包括以下步驟：
步驟一、取三七的莖部，用流水將其沖洗干凈，進行無菌消毒處理，在無菌條件下去除表皮組織，加入無菌水研磨得到研磨液，再用無菌水將研磨液稀釋至其體積的100倍，得到稀釋液；取稀釋液涂布于改良的PDA培養(yǎng)基上，置于25℃的培養(yǎng)箱中分離培養(yǎng)42h，得到多個菌落；再將多個菌落在改良的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)42h，培養(yǎng)溫度為25℃，得多種菌株，然后將獲得的多種菌株轉(zhuǎn)移至改良的PDA培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)42h，培養(yǎng)溫度為25℃，然后置于4℃環(huán)境下保存，備用；
其中所述改良的PDA培養(yǎng)基包括PDA、0.04mg琥珀酸鈉和100mL的三七莖葉原漿；
步驟二、將步驟一中保存的多種菌株分別和三七黑斑病病原菌進行對峙培養(yǎng)3d，對峙培養(yǎng)溫度為25℃，篩選出抑制率大于或等于90％的菌株，經(jīng)DNA鑒定后，確定為暗色環(huán)紋炭團菌。
其中，無菌消毒處理具體為：用質(zhì)量分數(shù)為75％的酒精浸泡2min，酒精要蓋過三七的莖部，然后將三七的莖部移至質(zhì)量分數(shù)為1％的次氯酸鈉溶液中浸泡3min，次氯酸鈉溶液要蓋過三七的莖部，再用無菌水沖洗4次。
<實施例3>
一、暗色環(huán)紋炭團菌的分離方法，包括以下步驟：
步驟一、取三七的莖部，用流水將其沖洗干凈，進行無菌消毒處理，在無菌條件下去除表皮組織，加入無菌水研磨得到研磨液，再用無菌水將研磨液稀釋至其體積的1000倍，得到稀釋液；取稀釋液涂布于改良的PDA培養(yǎng)基上，置于28℃的培養(yǎng)箱中分離培養(yǎng)54h，得到多個菌落；再將多個菌落在改良的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)54h，培養(yǎng)溫度為28℃，得多種菌株，然后將獲得的多種菌株轉(zhuǎn)移至改良的PDA培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)54h，培養(yǎng)溫度為28℃，然后置于4℃環(huán)境下保存，備用；
其中所述改良的PDA培養(yǎng)基包括PDA、0.1mg琥珀酸鈉和150mL的三七莖葉原漿；
步驟二、將步驟一中保存的多種菌株分別和三七黑斑病病原菌進行對峙培養(yǎng)5d，對峙培養(yǎng)溫度為28℃，篩選出抑制率大于或等于90％的菌株，經(jīng)DNA鑒定后，確定為暗色環(huán)紋炭團菌。
其中，無菌消毒處理具體為：用質(zhì)量分數(shù)為75％的酒精浸泡5min，酒精要蓋過三七的莖部，然后將三七的莖部移至質(zhì)量分數(shù)為1％的次氯酸鈉溶液中浸泡8min，次氯酸鈉溶液要蓋過三七的莖部，再用無菌水沖洗6次。
<實施例4>
一、暗色環(huán)紋炭團菌的分離方法，包括以下步驟：
步驟一、取三七的莖部，用流水將其沖洗干凈，進行無菌消毒處理，在無菌條件下去除表皮組織，加入無菌水研磨得到研磨液，再用無菌水將研磨液稀釋至其體積的1000倍，得到稀釋液；取稀釋液涂布于改良的PDA培養(yǎng)基上，置于28℃的培養(yǎng)箱中分離培養(yǎng)48h，得到多個菌落；再將多個菌落在改良的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度為28℃，得多種菌株，然后將獲得的多種菌株轉(zhuǎn)移至改良的PDA培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度為28℃，然后置于4℃環(huán)境下保存，備用；
其中所述改良的PDA培養(yǎng)基包括PDA、0.05mg琥珀酸鈉和100mL的三七莖葉原漿；
步驟二、將步驟一中保存的多種菌株分別和三七黑斑病病原菌進行對峙培養(yǎng)5d，對峙培養(yǎng)溫度為28℃，篩選出抑制率大于或等于90％的菌株，經(jīng)DNA鑒定后，確定為暗色環(huán)紋炭團菌。
其中，無菌消毒處理具體為：用質(zhì)量分數(shù)為75％的酒精浸泡2min，酒精要蓋過三七的莖部，然后將三七的莖部移至質(zhì)量分數(shù)為1％的次氯酸鈉溶液中浸泡5min，次氯酸鈉溶液要蓋過三七的莖部，再用無菌水沖洗4次。
其中，在無菌消毒處理之前還包括對三七的莖部進行預(yù)處理：將三七的莖部用質(zhì)量分數(shù)為15％的魔芋粉溶液在30℃下浸泡20min，魔芋粉溶液要蓋過三七的莖部，取出瀝干后再在三七的莖部表面涂上大豆油。
其中，步驟一中三七莖葉原漿的制備方法具體為：將三七的莖和葉放入研缽中，加入冰水研磨30min，然后加入濃度均為10μmol/L的胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液，置于超聲波中以60kHz超聲頻率處理40min，再用研缽研磨10min，置于超聲波中以60kHz超聲頻率處理20min，過濾即得，保存在4℃環(huán)境中，備用；
其中三七的莖、葉、冰水、胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液的質(zhì)量體積比例為1g:1g:10mL:1mL:1mL:1mL:1mL。
<實施例5>
一、暗色環(huán)紋炭團菌的分離方法，包括以下步驟：
步驟一、取三七的莖部，用流水將其沖洗干凈，進行無菌消毒處理，在無菌條件下去除表皮組織，加入無菌水研磨得到研磨液，再用無菌水將研磨液稀釋至其體積的100倍，得到稀釋液；取稀釋液涂布于改良的PDA培養(yǎng)基上，置于25℃的培養(yǎng)箱中分離培養(yǎng)42h，得到多個菌落；再將多個菌落在改良的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)42h，培養(yǎng)溫度為25℃，得多種菌株，然后將獲得的多種菌株轉(zhuǎn)移至改良的PDA培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)42h，培養(yǎng)溫度為25℃，然后置于4℃環(huán)境下保存，備用；
其中所述改良的PDA培養(yǎng)基包括PDA、0.04mg琥珀酸鈉和100mL的三七莖葉原漿；
步驟二、將步驟一中保存的多種菌株分別和三七黑斑病病原菌進行對峙培養(yǎng)3d，對峙培養(yǎng)溫度為25℃，篩選出抑制率大于或等于90％的菌株，經(jīng)DNA鑒定后，確定為暗色環(huán)紋炭團菌。
其中，無菌消毒處理具體為：用質(zhì)量分數(shù)為75％的酒精浸泡2min，酒精要蓋過三七的莖部，然后將三七的莖部移至質(zhì)量分數(shù)為1％的次氯酸鈉溶液中浸泡3min，次氯酸鈉溶液要蓋過三七的莖部，再用無菌水沖洗4次。
其中，在無菌消毒處理之前還包括對三七的莖部進行預(yù)處理：將三七的莖部用質(zhì)量分數(shù)為15％的魔芋粉溶液在30℃下浸泡15min，魔芋粉溶液要蓋過三七的莖部，取出瀝干后再在三七的莖部表面涂上椰子油。
其中，步驟一中三七莖葉原漿的制備方法具體為：將三七的莖和葉放入研缽中，加入冰水研磨30min，然后加入濃度均為10μmol/L的胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液，置于超聲波中以60kHz超聲頻率處理40min，再用研缽研磨10min，置于超聲波中以60kHz超聲頻率處理20min，過濾即得，保存在4℃環(huán)境中，備用；
其中三七的莖、葉、冰水、胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液的質(zhì)量體積比例為1g:1g:10mL:1mL:1mL:1mL:1mL。
<實施例6>
一、暗色環(huán)紋炭團菌的分離方法，包括以下步驟：
步驟一、取三七的莖部，用流水將其沖洗干凈，進行無菌消毒處理，在無菌條件下去除表皮組織，加入無菌水研磨得到研磨液，再用無菌水將研磨液稀釋至其體積的1000倍，得到稀釋液；取稀釋液涂布于改良的PDA培養(yǎng)基上，置于28℃的培養(yǎng)箱中分離培養(yǎng)54h，得到多個菌落；再將多個菌落在改良的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)54h，培養(yǎng)溫度為28℃，得多種菌株，然后將獲得的多種菌株轉(zhuǎn)移至改良的PDA培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)54h，培養(yǎng)溫度為28℃，然后置于4℃環(huán)境下保存，備用；
其中所述改良的PDA培養(yǎng)基包括PDA、0.1mg琥珀酸鈉和150mL的三七莖葉原漿；
步驟二、將步驟一中保存的多種菌株分別和三七黑斑病病原菌進行對峙培養(yǎng)5d，對峙培養(yǎng)溫度為28℃，篩選出抑制率大于或等于90％的菌株，經(jīng)DNA鑒定后，確定為暗色環(huán)紋炭團菌。
其中，無菌消毒處理具體為：用質(zhì)量分數(shù)為75％的酒精浸泡5min，酒精要蓋過三七的莖部，然后將三七的莖部移至質(zhì)量分數(shù)為1％的次氯酸鈉溶液中浸泡8min，次氯酸鈉溶液要蓋過三七的莖部，再用無菌水沖洗6次。
其中，在無菌消毒處理之前還包括對三七的莖部進行預(yù)處理：將三七的莖部用質(zhì)量分數(shù)為15％的魔芋粉溶液在40℃下浸泡20min，魔芋粉溶液要蓋過三七的莖部，取出瀝干后再在三七的莖部表面涂上玉米油。
其中，步驟一中三七莖葉原漿的制備方法具體為：將三七的莖和葉放入研缽中，加入冰水研磨30min，然后加入濃度均為10μmol/L的胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液，置于超聲波中以60kHz超聲頻率處理40min，再用研缽研磨10min，置于超聲波中以60kHz超聲頻率處理20min，過濾即得，保存在4℃環(huán)境中，備用；
其中三七的莖、葉、冰水、胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液的質(zhì)量體積比例為1g:1g:10mL:1mL:1mL:1mL:1mL。
<實施例7>
采用實施例1的方法，將三七的莖部替換成三七的葉，其它操作方法與實施例1一致。
<實施例8>
采用實施例1的方法，將三七的莖部替換成三七的根部，其它操作方法與實施例1一致。
表1分離情況
如表1所示，通過實施例1、實施例7和實施例8的方法可以從三七的莖部、葉和根部分離獲得暗色環(huán)紋炭團菌，分別獲得18株、4株和2株，從分離獲得的菌株數(shù)據(jù)可以說明暗色環(huán)紋炭團菌主要可以從三七的莖部獲得，從三七的葉和根部分離獲得的暗色環(huán)紋炭團菌較少。
<病原菌抑制試驗>
采用實施例1～3和實施例4～6的方法分離獲得的暗色環(huán)紋炭團菌進行病原菌菌絲抑制試驗：
方法：采用對峙培養(yǎng)法，以PDA為供試培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿上將病原菌分別與各真菌菌株進行對峙培養(yǎng)試驗，每處理3個重復(fù)，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察各菌株和病原菌的生長情況。以單獨培養(yǎng)的病原菌為對照。每天記錄病原菌落指向拮抗菌半徑及對照病原菌菌落半徑，5d后，計算菌株的抑菌率。
抑制率＝(病原菌對照菌落半徑-病原菌落指向拮抗菌的半徑)/病原菌對照菌落半徑×100％
表2暗色環(huán)紋炭團菌對病原菌菌絲的抑制效果對比
如表2所示，實施例1和實施例6的方法分離得到的暗色環(huán)紋炭團菌，對三七灰霉病病原菌、三七圓斑病病原菌、苦玄參褐斑病病原菌、艾納香條斑病病原菌、廣西莪術(shù)葉斑病病原菌、草豆蔻葉斑病病原菌和羅漢果斑枯病病原菌菌絲具有極強的抑制作用。且實施例4～6明顯優(yōu)于實施例1～3，表明實施例4～6中在三七的莖部消毒處理前，采用魔芋粉溶液浸泡和涂抹植物油的方法，有利于暗色環(huán)紋炭團菌的分離；制備三七莖葉原漿時，加入胱氨酸溶液、蘇氨酸溶液、白氨酸溶液和賴氨酸溶液并進行超聲處理，可以促使三七莖葉原漿中活性物質(zhì)的流出，并在低溫環(huán)境中和氨基酸作用下保持其活性，降低活性的損失，進而增強分離所得的暗色環(huán)紋炭團菌的活性，因此增強其對病原菌菌絲的抑制作用。
盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。