本發(fā)明屬于遺傳檢測領域，特別涉及一種用于檢測食管癌易感性的試劑盒及其SNP標志物。
背景技術：
食管癌是食管黏膜上皮及食管腺上皮發(fā)生的惡性腫瘤。或內外大量的關聯(lián)研究表明，食管癌的發(fā)病與遺傳因素有關。
采用單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphsm，SNP)作為基因組標志的關聯(lián)分析方法是目前最常用的疾病的遺傳易感基因檢測方法之一。SNP是指基因組水平上由單核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的發(fā)生頻率大于1％，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。SNP遺傳穩(wěn)定性強，易于檢測，位于基因內部的SNP能直接影響到蛋白質的結構或表達水平，進而影響到組織、器官乃至生理功能。
對常見疾病相關多種遺傳標識進行早期檢測和系統(tǒng)評估將有助于對疾病的早期預防、診斷和治療。目前，研究已經發(fā)現(xiàn)大量與各種常見疾病相關的遺傳學標識，然而，由于缺乏有足夠的靈敏度和可以對多種疾病相關標識進行廣泛(高通量檢測位點、高通量檢測樣本)篩查和檢驗的方法，使得這些常見疾病的遺傳學標識無法廣泛應用。此外，目前常見疾病遺傳標識缺乏系統(tǒng)、有效的整合，大大制約了常見疾病早期預防、診斷和治療方面的發(fā)展?，F(xiàn)有檢測只有單一種疾病或一類疾病的遺傳標識檢測，檢測范圍有限，且某些常見疾病尚無早期檢測的方法。
目前，一些傳統(tǒng)醫(yī)學手段，如組織細胞檢測存在著其固有的缺陷，取材位置不當、組織細胞標本材料不足或認為經驗不足等都將導致子宮內膜癌誤診。其他技術例如影像學雖然已被廣泛應用于子宮內膜癌的檢查和診斷，但其在疾病子宮內膜癌程度的定性上仍存在著很大的局限性。
綜上所述，研發(fā)一種用于通過多個易感位點檢測食管癌易感性的試劑盒對食管癌發(fā)病風險的預測、預防、診斷提供依據(jù)具有重要意義。
技術實現(xiàn)要素：
鑒于上述現(xiàn)有技術存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種用于檢測食管癌易感性的SNP標志物、SNP標志物的PCR擴增引物和單堿基延伸引物及其試劑盒，本發(fā)明的24個SNP位點為食管癌的患病風險評估、診斷參考提供重要依據(jù)。
本發(fā)明的目的將通過以下技術方案得以實現(xiàn)：
一種用于檢測食管癌易感性的SNP標志物，所述SNP標志物包括24個SNP位點，所述24個SNP位點為rs10204525、rs1033667、rs1042026、rs1042522、rs10484761、rs11066015、rs11066280、rs1346044、rs1642764、rs17761864、rs1805034、rs1883965、rs2074356、rs2239612、rs2274223、rs238406、rs2847281、rs35597309、rs4785204、rs4822983、rs63749993、rs671、rs7206735和rs7447927。
上述的SNP標志物的PCR擴增引物和單堿基延伸引物，
所述檢測rs10204525的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：3；
所述檢測rs1033667的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：6；
所述檢測rs1042026的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：9；
所述檢測rs1042522的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：12；
所述檢測rs10484761的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：15；
所述檢測rs11066015的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：18；
所述檢測rs11066280的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：21；
所述檢測rs1346044的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：24；
所述檢測rs1642764的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：27；
所述檢測rs17761864的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：30；
所述檢測rs1805034的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：33；
所述檢測rs1883965的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：36；
所述檢測rs2074356的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：39；
所述檢測rs2239612的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：42；
所述檢測rs2274223的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：45；
所述檢測rs238406的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：48；
所述檢測rs2847281的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：51；
所述檢測rs35597309的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：54；
所述檢測rs4785204的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：57；
所述檢測rs4822983的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：60；
所述檢測rs63749993的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：63；
所述檢測rs671的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：66；
所述檢測rs7206735的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：69；
所述檢測rs7447927的PCR擴增引物的序列分別為SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71，以及單堿基延伸引物的序列為SEQ ID NO：72。
一種用于檢測食管癌易感性的試劑盒，所述試劑盒包括權利要求2所述SNP標志物的PCR擴增引物和單堿基延伸引物，用于檢測外周血DNA中24個SNP位點為rs10204525、rs1033667、rs1042026、rs1042522、rs10484761、rs11066015、rs11066280、rs1346044、rs1642764、rs17761864、rs1805034、rs1883965、rs2074356、rs2239612、rs2274223、rs238406、rs2847281、rs35597309、rs4785204、rs4822983、rs63749993、rs671、rs7206735和rs7447927。
上述的一種用于檢測是食管癌易感性的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應緩沖液、酶切反應緩沖液、去離子水。
本發(fā)明所述的試劑盒是以本發(fā)明人基于多個國際和國內大樣本量的食管癌人群和正常人群食管癌易感基因篩查結果的前期研究為基礎，通過本發(fā)明人自主設計的食管癌SNP篩選流程，從NCBI-pubmed數(shù)據(jù)庫中篩選符合條件的SNP位點：1)查找與食管癌相關的文獻，通過影響因子和發(fā)表年限進行過濾；2)查看候選文獻的摘要，進一步排除與食管癌SNP研究無關的文獻；3)閱讀文獻，找到食管癌對應的SNP位點；4)以選取的SNP位點和食管癌為關鍵詞再一次查閱文獻；5)判斷選取的SNP位點是否與食管癌密切相關，選取與食管癌最密切相關的SNP位點、對應OR值以及突變堿基；6)將上一步驟獲得的SNP位點，通過Sequenom公司軟件Typer 4.0進行在線評估，獲得最終的24個SNP位點列表。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供了一種用于檢測食管癌易感性的檢測方法與試劑盒，還達到了以下效果：本發(fā)明的24個SNP位點經過文獻論證，具有較高的實用性，可用于食管癌的早期評估和大規(guī)模篩查，并且該24個位點檢出成功率高、技術重現(xiàn)性好、性價比高，為食管癌的患病風險評估、診斷參考提供重要依據(jù)，以實現(xiàn)對食管癌疾病的早期評估。
以下便結合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步的詳述，以使技術方案更易于理解、掌握。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得，下面實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明所為的等效實施或變更，均應包含于本專利保護范圍中。
實施例1 用于檢測食管癌易感性相關的SNP位點
其中，rs10204525和rs1033667位于基因HEATR3區(qū)域，rs1042026和rs1042522位于基因CHEK2區(qū)域，rs10484761位于基因ST6GAL1區(qū)域，rs11066015位于基因SMG6區(qū)域，rs11066280位于基因PTPN2區(qū)域，rs1346044位于基因ADH1B區(qū)域，rs1642764位于基因ALDH2區(qū)域，rs17761864位于基因TMEM173區(qū)域，rs1805034位于基因ATP1B2區(qū)域，rs1883965位于基因HLA區(qū)域，rs2074356位于基因PLCE1區(qū)域，rs2239612位于基因MSH2區(qū)域，rs2274223位于基因WRN區(qū)域，rs238406位于基因ERCC2區(qū)域，rs2847281位于基因PD-1區(qū)域，rs35597309位于基因ALDH2區(qū)域，rs4785204位于基因TP53區(qū)域，rs4822983位于基因RANK區(qū)域，rs63749993位于基因mTOR區(qū)域，rs671位于基因UNC5CL區(qū)域，rs7206735位于基因RPL6-PTPN11區(qū)域，rs7447927位于基因C12orf51區(qū)域。
實施例2 檢測食管癌易感性的試劑盒
一、試劑盒的制備：
1、設計和合成所述24個SNP位點的PCR擴增引物和單堿基延伸引物。待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物詳見表1
表1 待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物
2、試劑盒還包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應緩沖液、酶切反應緩沖液、去離子水。
二、試劑盒的檢測方法：
1、DNA的提取
1.1 口腔拭子DNA提取
1)將口腔拭子放在2ml離心管中，加入400μl PBS。
2)加入20μl QIAGEN Protease和400μlBuffer AL。立即渦旋15s混勻。為了保證有效的裂解，樣品和Buffer AL必須立即并充分混合。
3)56℃孵育10min。短暫離心。
4)加入400μl乙醇(96-100％)到樣品中，渦旋混勻。短暫離心以使管蓋上無液體。
5)將液體轉移至離心柱，8000rpm(6000×g)離心1min。
6)柱子放入新的2ml EP管，加500μl Buffer AW1，8000rpm離心1min，棄EP管和廢液。
7)柱子放入新的2mlEP管，加500μl Buffer AW2，14000rpm(20,000×g)離心3min，丟棄EP管和廢液。
8)將柱子放入新的2mlEP管，14000rpm空管離心1min，丟棄EP管。
9)將柱子放入新的1.5mlEP管，加120μl Buffer AE，室溫孵育5min，8000rpm離心1min，-20℃保存。
1.2 全血DNA提取
1)向1.5ml EP管中加入20μl QIAGEN Protease。
2)向管中加200μl全血樣品。注：先加入酶的目的是保證酶與血液的混勻。
3)加200μl Buffer AL，渦旋混勻15s。
4)56℃孵育10min，短暫離心。注：延長孵育時間不能增加產量或提高質量。
5)加入200μl無水乙醇，渦旋15s后，短暫離心以使管蓋上無液體。
6)繼續(xù)口腔拭子5～10步驟。
2、PCR擴增
2.1 在一個新的1.5mlEP管中配制PCR擴增反應體系，見表2
表2 PCR擴增反應體系
以上試劑混勻后每孔各加2μl。
2.2 每孔依次加入DNA 10ng/ul 1μl，0.25uM Primer Mix 2μl，總體積5μl。
2.3 在兼容96孔板的PCR儀上設定PCR反應條件為：94℃ 4min，94℃20s，56℃30min，72℃1min，45個循環(huán)；72℃3min；4℃保持。將96孔PCR反應板放置于PCR儀上，啟動PCR反應。
3、PCR產物堿性磷酸酶處理
3.1 在PCR反應結束后，將PCR產物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。
3.2 配制堿性磷酸酶處理反應體系，見表3
表3 堿性磷酸酶處理反應體系
以上試劑混勻后每孔加2μl。
3.3 在兼容96孔板的PCR儀上，設定PCR反應條件：37℃40min；85℃5min；4℃保持，啟動PCR儀進行堿性磷酸酶處理。
4 單堿基延伸
4.1 在堿性磷酸酶處理結束后，進行單堿基延伸反應。
4.2 配制單堿基延伸反應體系，見表4
表4 單堿基延伸反應體系
以上試劑混勻后每孔加1.06μl
4.3 每孔加入iPLEX Extend Primer Mix 0.94μl，總體積9μl。
4.4在兼容96孔板的PCR儀上，設定PCR反應條件：94℃30s，94℃5s，52℃5s，80℃5s；52℃5s，80℃5s 4個循環(huán)；94℃5s，52℃5s，80℃5s 39個循環(huán)；72℃3min；4℃維持。啟動PCR儀進行單堿基延伸反應。
5、樹脂純化
5.1 將Clean Resin樹脂平鋪到6mg的樹脂板中；
5.2 加16μl水到延伸產物的對應孔內；
5.3 將干燥后的樹脂倒入延伸產物板中，封膜，低速垂直旋轉15min，使樹脂與反應物充分接觸；
5.4 3000rpm 5min離心使樹脂沉入孔底部。
6、芯片點樣
啟動MassARRAY NanodispenserRS1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產物移至96孔固體支持物上，制作出芯片。
7、質譜檢測
將芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization-time offlight)，基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜)分析，檢測結果使用TYPER4.0軟件(Sequenom)分型并輸出結果，分析受試者食管癌發(fā)生風險，以實現(xiàn)對疾病的早期評估。
實施例3 與食管癌密切相關的24個SNP位點引用的文獻，見表5
表5 與食管癌密切相關的24個SNP位點引用的文獻
實施例4 根據(jù)實施例3中引用的文獻得出24個SNP位點與食管癌的關聯(lián)，見表6
表6 24個SNP位點與食管癌的關聯(lián)分析結果
實施例5 24個SNP位點的驗證
采用上述實施例2中試劑盒的質譜檢測方法分析24個SNP位點，檢測結果使用TYPER4.0軟件(Sequenom)分型并輸出結果，其OR值與實施例4中表6的24個SNP位點與食管癌的關聯(lián)分析結果相同，說明該24個位點具有較高的實用性，可用于食管癌的早期評估和大規(guī)模篩查，由于質譜分析技術具有檢出成功率高、技術重現(xiàn)性好、性價比高，因此本發(fā)明采用的是質譜檢測分析該24個位點檢出成功率高、技術重現(xiàn)性好、性價比高，為食管癌的患病風險評估、診斷參考提供重要依據(jù)，以實現(xiàn)對食管癌疾病的早期評估。
上述說明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應在本發(fā)明所附權利要求的保護范圍內。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市核子基因科技有限公司
<120> 一種用于檢測食管癌易感性的試劑盒及其SNP標志物
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gccccaggga acac 14
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<213> 人工序列
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<211> 30
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<213> 人工序列
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ggaggctagg tggag 15