本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種鑒別邵氏鱚與多鱗鱚的分子標(biāo)記引物及方法。
背景技術(shù)：
邵氏鱚為2016年發(fā)現(xiàn)新種，隸屬于鱸形目、鱸亞目、鱚科、鱚屬，目前僅在臺灣海峽近海有分布。其外部形態(tài)與多鱗鱚極為相似：第一背鰭具XI硬棘，第二背鰭具I硬棘及20-22軟條，臀鰭具II硬棘及21-22軟條，具68-73側(cè)線鱗；脊椎骨數(shù)34-37。邵氏鱚體背部青灰色，頭部背側(cè)深色，腹側(cè)白色；體側(cè)側(cè)線下部時有由黑色小點組成的模糊條帶。第一及第二背鰭淡黃色，密布黑色小點；腹鰭和臀鰭黃白色，臀鰭帶黑點；尾叉淺，近截形；尾鰭深褐色至深灰色。邵氏鱚同多鱗鱚一樣，皆為福建近海重要的經(jīng)濟(jì)魚種。其肉質(zhì)細(xì)膩鮮美，具有很高的食用價值。目前用于鑒定邵氏鱚的方法還沒有見正式報道。由于二者形態(tài)非常相似，僅憑借形態(tài)特征很難將兩者區(qū)分。因此尋找區(qū)分邵氏鱚和多鱗鱚的可靠標(biāo)準(zhǔn)，從混雜的種質(zhì)中鑒別、分離種質(zhì)成為一個迫不及待的問題。這將有助于解決種質(zhì)混雜等問題，為種質(zhì)保護(hù)、合理利用以及種質(zhì)的生物多樣性研究提供技術(shù)支撐。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種鑒別邵氏鱚與多鱗鱚的分子標(biāo)記引物及方法，有助于解決鱚屬魚類種質(zhì)混雜問題，本發(fā)明方法操作簡單，易于掌握，準(zhǔn)確性高。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
一種鑒別邵氏鱚與多鱗鱚的分子標(biāo)記引物，所述引物序列為
L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；
H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’。
本發(fā)明還提供一種鑒別邵氏鱚與多鱗鱚的分子標(biāo)記方法，具體步驟如下：提取邵氏鱚與多鱗鱚的DNA，以兩種魚的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行純化、測序，比對測序結(jié)果，種內(nèi)遺傳差異不大于1％；所述邵氏鱚的分子標(biāo)記序列為：
CAGGCATGGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTTATCCGCGCAGAACTCAGCCAACCTGGCGCCCTGCTTGGAGATGACCAAATTTATAATGTTATTGTTACGGCGCATGCCTTCGTAATAATCTTCTTTATGGTAATACCAATTCTTATCGGAGGGTTCGGAAACTGGCTGGTCCCCTTAATGATCGGGGCCCCGGACATGGCCTTCCCCCGCATGAACAACATGAGCTTTTGGCTTCTGCCCCCGTCTTTCCTTCTTCTTCT；
所述多鱗鱚的分子標(biāo)記序列為
CAGGTATGGTGGGCACGGCCCTAAGCCTGCTTATCCGAGCAGAACTTAGCCAACCTGGCGCTCTGCTTGGTGACGACCAAATTTACAATGTCATTGTCACCGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATCCTTATCGGAGGGTTCGGCAACTGGCTTGTTCCCCTGATGATCGGAGCCCCTGATATGGCATTCCCACGAATGAATAACATGAGCTTCTGACTCCTTCCTCCTTCTTTCCTCCTTCTCTT；
所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為：超純水17.5ul，10×buffer2.5ul
dNTPs2ul，rTaq0.15ul，DNA模板1ul，Primer各1ul；
PCR擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
由邵氏鱚和多鱗鱚mtDNA COI基因262bp序列排序結(jié)果可以看出邵氏鱚與多鱗鱚存在40個堿基的差異，表現(xiàn)為12個顛換，28個轉(zhuǎn)換。其結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)。邵氏鱚(東山群體，廈門群體和臺灣群體)的擴(kuò)增結(jié)果一致，表現(xiàn)出高度的一致性。因此基于COI基因的堿基差異可以作為邵氏鱚和多鱗鱚的種質(zhì)區(qū)分的分子標(biāo)記。同時，鑒別方法簡單。
具體實施方法
下面通過實施例來對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實施例任何形式上的限制。
實施例1：
選用福建廈門沿海、福建東山和臺灣彰化的邵氏鱚與福建晉江沿海的多鱗鱚，組成3個不同地理群體的邵氏鱚樣本群和多鱗鱚樣本群，提取4個樣本群體的DNA，然后所提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行純化、測序，比對測序結(jié)果；
所述的引物序列為L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’；H6241：5’-CCTCAACACCTGATGAGGCC-3’；所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為：
0.2ml離心管中依次加入：
PCR擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5min，(94℃變性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec)×35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存∞。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后測序，并對4個群體的測序結(jié)果進(jìn)行比對。
由邵氏鱚和多鱗鱚mtDNA COI基因262bp序列排序結(jié)果可以看出邵氏鱚與多鱗鱚存在40個堿基的差異，表現(xiàn)為12個顛換，28個轉(zhuǎn)換。
3個邵氏鱚群體和多鱗鱚的mtDNA COI基因262bp序列比對結(jié)果為：
其中“*”表示相同的堿基序列位點，JJD：福建晉江沿海多鱗鱚樣品；XMS：福建廈門沿海邵氏鱚樣品；DSS：福建東山沿海邵氏鱚樣品；TWS：臺灣彰化沿海邵氏鱚樣品。
測序結(jié)果表明，邵氏鱚的3個地點采集的21尾樣品擴(kuò)增結(jié)果一致，結(jié)果穩(wěn)定且可重復(fù)性強(qiáng)。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大學(xué)
<120> 一種鑒別邵氏鱚與多鱗鱚的分子標(biāo)記引物及方法
<130> 無
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工設(shè)計的引物序列L5979
<400> 1
tttagtattc ggagcctgag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工設(shè)計的引物序列H6241
<400> 2
cctcaacacc tgatgaggcc 20
<210> 3
<211> 262
<212> DNA
<213> sillage sihama
<400> 3
caggcatggt aggaacagcc ctaagcctgc ttatccgcgc agaactcagc caacctggcg 60
ccctgcttgg agatgaccaa atttataatg ttattgttac ggcgcatgcc ttcgtaataa 120
tcttctttat ggtaatacca attcttatcg gagggttcgg aaactggctg gtccccttaa 180
tgatcggggc cccggacatg gccttccccc gcatgaacaa catgagcttt tggcttctgc 240
ccccgtcttt ccttcttctt ct 262
<210> 4
<211> 262
<212> DNA
<213> sillage sihama
<400> 4
caggtatggt gggcacggcc ctaagcctgc ttatccgagc agaacttagc caacctggcg 60
ctctgcttgg tgacgaccaa atttacaatg tcattgtcac cgcacatgcc tttgtaataa 120
ttttctttat agtaatgcca atccttatcg gagggttcgg caactggctt gttcccctga 180
tgatcggagc ccctgatatg gcattcccac gaatgaataa catgagcttc tgactccttc 240
ctccttcttt cctccttctc tt 262