本發(fā)明屬于甘蔗分子生物學(xué)及分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。更具體涉及一種適合甘蔗外源基因拷貝數(shù)鑒定的內(nèi)源基因篩選與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甘蔗（Saccharum spp. L., Poacccac）是人類最早利用的碳四作物，它的光飽和點(diǎn)高，二氧化碳補(bǔ)償點(diǎn)低，凈光合速率高，相比較其他作物而言，它能夠在各種逆境條件下有較高的生物量，被譽(yù)為第一代生物燃料植物，進(jìn)而用于替代石化能源用于燃料乙醇的生產(chǎn)，對(duì)保護(hù)我們國(guó)家能源安全具有重要意義。自從1890年以來(lái)，荷蘭甘蔗育種家Jeswiet J.創(chuàng)立了甘蔗高貴化育種理論以來(lái)，以高產(chǎn)、高糖的甘蔗熱帶種為輪回親本，以抗逆、抗病的割手密野生種為供體親本，進(jìn)行雜交和回交，育成了第一個(gè)甘蔗栽培種POJ2878，該品種單產(chǎn)比原來(lái)增產(chǎn)21%，產(chǎn)糖率增加了0.48個(gè)百分點(diǎn)（絕對(duì)值），從而極大地振興了當(dāng)時(shí)的甘蔗產(chǎn)業(yè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1900年世界上僅有少數(shù)國(guó)家種植甘蔗，年總產(chǎn)蔗糖僅300萬(wàn)噸，而2015那年總產(chǎn)糖1.357億噸，約占世界食糖總產(chǎn)的77%，在蔗糖生產(chǎn)和能源乙醇的利用方面占有十分重要的地位。

在770萬(wàn)年前，甘蔗與高粱的共同祖先出現(xiàn)分化，甘蔗至少經(jīng)歷了兩輪基因組的加倍而變成八倍體，逐漸分化成5個(gè)種，熱帶種、割手密、大莖野生種、印度種、中國(guó)種，經(jīng)過(guò)不同中間雜交后，使得甘蔗栽培種為遺傳背景十分復(fù)雜的異源多倍體或非整倍體作物，染色體數(shù)目通常大于100，伴隨著基因數(shù)目的改變而使基因組結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，與原基因組相比基因表達(dá)水平以及基因組構(gòu)成發(fā)生了顯著的改變，如染色體重組、親本序列的消除、基因沉默、同源異型轉(zhuǎn)換等，產(chǎn)生大量的同源基因以及基因拷貝數(shù)增加，導(dǎo)致基因冗余、原有基因亞功能化甚至沉默，大大增加了篩選低拷貝或單拷貝目的基因以及克隆基因的難度。

由于甘蔗高度雜合性，雜種F1即產(chǎn)生廣泛分離，且重組概率極低，加之，甘蔗高貴化育種以來(lái)，種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄。因此，甘蔗育種陷于進(jìn)展緩慢，停滯不前的境地。隨著分子生物技術(shù)快速發(fā)展，特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，給甘蔗分子育種帶來(lái)了新的技術(shù)手段。由于甘蔗為無(wú)性繁殖作物，不開(kāi)花或難以開(kāi)花等特點(diǎn)，為了拓寬育種基礎(chǔ)、創(chuàng)制甘蔗新種質(zhì)資源，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外甘蔗育種者開(kāi)展了一系列轉(zhuǎn)基因甘蔗的研究，但是由于甘蔗基因組復(fù)雜，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化甘蔗研究體系尚未建立。因此，目前甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化研究?jī)H僅停留在基因槍轉(zhuǎn)化法上，但基因槍轉(zhuǎn)化法存在很多的缺點(diǎn)，尤其轉(zhuǎn)化后植株存在外源基因高拷貝數(shù)和嵌合體問(wèn)題。傳統(tǒng)的拷貝數(shù)鑒定主要是依靠Southern 雜交法，但該方法又存在工作量大、需要DNA材料較多、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且經(jīng)常用到放射性同位素等危險(xiǎn)藥品，并且該方法在基因組龐大的多倍體上效果較差。因此，為了快速、準(zhǔn)確、高效的鑒定轉(zhuǎn)基因甘蔗外源基因拷貝數(shù)，當(dāng)前迫切需要篩選出一種合適的轉(zhuǎn)基因甘蔗拷貝數(shù)鑒定的內(nèi)源單拷貝基因，作為拷貝數(shù)鑒定的重要依據(jù)，進(jìn)而形成一整套成熟的檢測(cè)方法，是從事甘蔗分子育種者急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問(wèn)題是，鑒于目前甘蔗外源基因拷貝數(shù)鑒定方法復(fù)雜、工作量大、效率低下、準(zhǔn)確性低等問(wèn)題，提供一種適合甘蔗外源基因拷貝數(shù)鑒定的內(nèi)源基因篩選與應(yīng)用，所建立的內(nèi)源基因和外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建方法，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高及可重復(fù)性高，為轉(zhuǎn)基因甘蔗外源基因拷貝數(shù)鑒定提供科學(xué)、準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種用于篩選甘蔗外源基因拷貝數(shù)鑒定內(nèi)源基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷酸序列分別為SEQ ID No.1 所示、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，所述內(nèi)源基因PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為95 bp。

Primer F：5'- CAAATGAACTTCCTCGGGAT-3' 即SEQ ID No: 1；Primer R：5'- GGGTTAGAACTGTGGGCATT -3' 即SEQ ID No: 2；探針序列：5’- CCCAAATGCAAGGACTGAATTTGCT -3’ 即SEQ ID No: 3

（1）內(nèi)源基因單拷貝的鑒定：在研究甘蔗抗銹病關(guān)聯(lián)標(biāo)記時(shí)，發(fā)現(xiàn)已有研究結(jié)果證明甘蔗抗銹病的標(biāo)記來(lái)源于外源大片段的插入，含有三個(gè)BAC片段，分別是SHCIR9O20、22M6、SHCIR12E3，且該片段插入來(lái)源于大莖野生種。本研究經(jīng)過(guò)構(gòu)建雜交組合桂糖35（含有抗銹病標(biāo)記）和科5（不含有抗銹病標(biāo)記）產(chǎn)生雜種后代F1共188個(gè)個(gè)體，利用分子標(biāo)記（引物為R12H16-F-5'-CTACGATGAAACTACACCCTTGTC-3'/ R12H16-R-5'-CTTATGTTAGCGTGACCTATGGTC-3'和9O20-F4-F-5'- TACATAATTTTAGTGGCACTCAGC-3'/ 9O20-F4-R- 5'-ACCATAATTCAATTCTGCAGGTAC-3'）通過(guò)其擴(kuò)增條帶的有無(wú)，經(jīng)過(guò)卡方適合性測(cè)驗(yàn)，該等位基因符合1:1分離。即證明該插入片段在母本基因組上為單劑量標(biāo)記，即為單拷貝插入片段。因此，證明該片段為單一插入，即一個(gè)甘蔗細(xì)胞僅含有一個(gè)大的插入片段，這樣就可以認(rèn)為該片段上的基因?yàn)閱慰截惢颉Ｒ虼?，可作為鑒定甘蔗外源基因拷貝數(shù)的內(nèi)源基因。

（2）內(nèi)源基因與外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建方法：將內(nèi)源基因和外源基因的定量檢測(cè)引物和探針，要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線生成和擴(kuò)增效率的比較。將甘蔗DNA用1xTE依次稀釋為50、25、5、1和0.2 ng/μL等五個(gè)梯度。每個(gè)樣品重復(fù)4次。PCR反應(yīng)體系為25 μL，12．5 μL 2x TaqMan Mix(ABI)，上下游引物(10 μmol/L)各1.0μL，10 μmol/L探針0.5μL；模板DNA 2.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0℃ 10 min，95℃ 5 min，95℃ 25 S，60℃ 1min, 共40個(gè)循環(huán)，ABI 7500軟件將自動(dòng)生成各個(gè)內(nèi)源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。外源基因拷貝數(shù)的計(jì)算參照文獻(xiàn)(Weng et a1., 2004)的公式計(jì)算。X0/R0 = 10[(Ct,X - IX)/SX] -[(Ct,R - IR)/SR]，其中Ct，X為待測(cè)目的基因的Ct值，IX為目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，SX為目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,R為內(nèi)標(biāo)基因的Ct值，IR為內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，SR為內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率?？截悢?shù)的估算即根據(jù)X0/R0的平均值。

步驟（2）中，所述的甘蔗DNA為含有抗銹病標(biāo)記（引物為R12H16和9O20-F4）甘蔗品種。

步驟（2）中，所述的PCR混合液為2x TaqMan Mix。

所述的適合甘蔗外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)源基因在分析甘蔗外源基因拷貝數(shù)的應(yīng)用。

本發(fā)明之一種適合鑒定甘蔗外源基因拷貝數(shù)的內(nèi)源基因在定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因甘蔗轉(zhuǎn)基因成分中的應(yīng)用。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)入的外源基因在轉(zhuǎn)基因甘蔗中的拷貝數(shù)，為下一步的轉(zhuǎn)基因甘蔗的中間試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支撐。

本發(fā)明利用已確定利用不同濃度梯度的DNA模板（50、25、5、1和0.2 ng/μL等五個(gè)梯度），進(jìn)行繪制外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品外源基因和內(nèi)源基因擴(kuò)增的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。本發(fā)明通過(guò)稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品得到不同梯度質(zhì)量濃度所得到的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R²可達(dá)0.998 ～ 0.999，斜率為3.389 ～ 3.553，可保證數(shù)據(jù)的精確度，可在五個(gè)數(shù)量級(jí)上的準(zhǔn)確定量，而且不必涉及構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，更加接近真是擴(kuò)增效率，使用方便，價(jià)格也便宜。

本發(fā)明利用內(nèi)源基因ZKF基因，對(duì)甘蔗外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)操作步驟簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，為獲得高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因甘蔗植株提供重要依據(jù)。本發(fā)明之適合甘蔗外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)源基因擴(kuò)增特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高可用于甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系評(píng)價(jià)及高通量鑒定外源基因拷貝數(shù)，為未知基因拷貝數(shù)評(píng)價(jià)和遺傳特征分析提供很好的技術(shù)基礎(chǔ)，填補(bǔ)了我國(guó)甘蔗轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)高通量檢測(cè)和分析技術(shù)的空白。

附圖說(shuō)明

圖1 抗銹病分子標(biāo)記檢測(cè)桂糖35和科5雜種后代F1共188個(gè)個(gè)體（部分個(gè)體）電泳圖，其中泳道1-24分別代表F1后代中的24個(gè)個(gè)體。上圖為引物R12H16擴(kuò)增結(jié)果，下圖為引物9O20-F4擴(kuò)增后酶切結(jié)果。

圖2-1內(nèi)源基因ZKF，熒光定量引物熔解曲線圖。AB分別為，zinc knuckle檢測(cè)引物1,2。

圖2-2內(nèi)源基因ZKF、tyrosine，熒光定量引物熔解曲線圖。C為，zinc knuckle檢測(cè)引物3；D為，tyrosine檢測(cè)引物1。

圖2-3內(nèi)源基因tyrosine，熒光定量引物熔解曲線圖。EF分別為，tyrosine檢測(cè)引物2,3。

圖2-4內(nèi)源基因APRT，熒光定量引物熔解曲線圖。GH分別為，APRT檢測(cè)引物1,2。

圖2-5內(nèi)源基因APRT、P4H，熒光定量引物熔解曲線圖。I為，APRT檢測(cè)引物3；G為，P4H檢測(cè)引物1。

圖2-6內(nèi)源基因P4H，熒光定量引物熔解曲線圖。KL分別為，P4H檢測(cè)引物2,3。

圖2-7內(nèi)源基因CYC，熒光定量引物熔解曲線圖。MN分別為CYC檢測(cè)引物1,2。

圖2-8內(nèi)源基因CYC，熒光定量引物熔解曲線圖。O分別為，CYC檢測(cè)引物3。

圖3內(nèi)源基因檢測(cè)引物zinc knuckle-3標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程。

圖4外源基因檢測(cè)引物Cry1Ac的標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。

實(shí)施例 1 建立一種適合甘蔗外源基因拷貝數(shù)鑒定的內(nèi)源基因篩選方法

（一）甘蔗內(nèi)源低拷貝基因的選擇：

由于甘蔗為異源多倍體作物，通?？梢哉J(rèn)為8倍體或10倍體以上，因此，選著拷貝數(shù)低或者單拷貝的內(nèi)源基因，可能性很低。目前關(guān)于甘蔗內(nèi)源基因報(bào)到的比較少，利用傳統(tǒng)的Southern 雜交法鑒定單拷貝基因，困難重重。因此，我們?cè)谘芯扛收峥逛P病標(biāo)記時(shí)，發(fā)現(xiàn)已有研究結(jié)果證明甘蔗抗銹病的標(biāo)記來(lái)源于外源大片段的插入，含有三個(gè)BAC片段，分別是SHCIR9O20、22M6、SHCIR12E3，且該片段插入來(lái)源于大莖野生種。經(jīng)過(guò)構(gòu)建雜交組合桂糖35（含有抗銹病標(biāo)記）和科5（不含有抗銹病標(biāo)記）產(chǎn)生雜種后代F1共188個(gè)個(gè)體，利用分子標(biāo)記（引物為R12H16和9O20-F4），如圖1所示，有條帶的個(gè)體是87個(gè)，沒(méi)有條帶的是101個(gè)，經(jīng)過(guò)卡方適合性測(cè)驗(yàn)，該等位基因符合1:1分離。即該插入片段在母本基因組上為單劑量標(biāo)記，即為單拷貝插入片段。因此，證明該片段為單一插入，即一個(gè)甘蔗細(xì)胞僅含有一個(gè)大的插入片段，這樣就可以認(rèn)為該片段上的基因?yàn)閱慰截惢?，可作為鑒定甘蔗外源基因拷貝數(shù)的內(nèi)源基因。本研究所示的ZKF基因，為zinc knuckle family protein gene 基因，在genbank種的登錄號(hào)為FN431661.1。該基因應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定甘蔗外源拷貝數(shù)，ZKF基因作為甘蔗內(nèi)源基因，所述的ZKF基因在Genbank中的登錄號(hào)為FN431661.1。本研究所示內(nèi)源基因ZFK在甘蔗栽培種中為單劑量插入片段，即為單拷貝基因。

（二）用于鑒定甘蔗外源基因拷貝數(shù)的候選內(nèi)源基因引物和探針設(shè)計(jì)：

采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)內(nèi)源基因ZKF（zinc knuckle）、tyrosine 、APRT、P4H和CYC熒光定量引物和探針，其中APRT、P4H和CYC為相關(guān)文獻(xiàn)介紹為甘蔗低拷貝基因（Bantong Xue and Jinlong Guo，2014 ），通過(guò)本研究的單拷貝基因ZKF與上述3個(gè)基因進(jìn)行比較篩選出最低拷貝數(shù)的基因，進(jìn)而為了篩選出每個(gè)基因的最佳檢測(cè)引物和探針，我們每個(gè)基因分別設(shè)計(jì)3對(duì)引物和探針，以便更好驗(yàn)證的待篩選檢測(cè)引物和探針。引物序列如下表所示：

表1 15對(duì)檢測(cè)引物序列

（三）實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源：

實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源于福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的"ROC22" 。分別為甘蔗品種“ROC22”（受體材料）和轉(zhuǎn)Cry1Ac 的甘蔗“ROC22” 共2株。

（四）利用熒光定量PCR的溶解曲線法鑒定檢測(cè)引物的特異性

1.提取待測(cè)甘蔗的DNA ，測(cè)定試樣DNA 質(zhì)量和濃度，統(tǒng)一稀釋成同一濃度50 ng/μL。

2. 定量PCR反應(yīng)體系和程序

按照熒光定量PCR試劑盒（FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系為：50～0.2 ng/μL 模板DNA 2 μL，12.5 μL FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) (2×)，0.3μM 上游引物，0.3μM 下游引物分別0.5 μL，加無(wú)菌超純水至終體積25μL。

將PCR管置于熒光定量PCR儀（ABI PRISM 7500 Sequence Detection System，Applied Biosystems, Foster City, CA, USA），按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：反應(yīng)程序?yàn)?0℃ 10 min，95℃ 5 min，95℃ 25 S，60℃ 1min, 共40個(gè)循環(huán)，ABI 7500軟件將自動(dòng)生成各個(gè)內(nèi)源基因的溶解曲線。所述的方法經(jīng)過(guò)優(yōu)選，每對(duì)引物平行3次，然后重復(fù)檢測(cè)3 次，Ct 值取三次測(cè)定的平均值。

（五）熒光定量PCR的Ct值分析：

Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。本研究通過(guò)設(shè)置相同模板（1 ng/μL）及PCR反應(yīng)條件和體系，比對(duì)各個(gè)檢測(cè)引物間Ct值的大小，初步判斷不同靶基因的起始拷貝數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2所示。從下表Ct值可以大體看出，Ct值最大組為zinc knuckle，Ct值介于31.00-33.10間，依次是P4H、tyrosine 、APRT、CYC基因。Ct值最小組是CYC基因，其Ct值介于24.73-27.93之間。由于部分引物間存在擴(kuò)增產(chǎn)物大小不一致和非特異性擴(kuò)增存在，其Ct值不能完全反應(yīng)出各個(gè)靶基因的準(zhǔn)確拷貝數(shù)，但是從結(jié)果基本可以得出，不同靶基因各自拷貝數(shù)的差異，即拷貝數(shù)最低的靶基因?yàn)閦inc knuckle。

表2 15對(duì)引物定量擴(kuò)增的Ct值結(jié)果

（六）熒光定量PCR溶解曲線分析：

采用SYBR Green熒光染料法檢測(cè)時(shí)，由于SYBR Green 可以嵌合進(jìn)所有的雙鏈DNA 的小溝區(qū)域，受激發(fā)而發(fā)出熒光，因此必需做PCR 反應(yīng)的特異性檢測(cè)，一般通過(guò)溶解曲線來(lái)分析其擴(kuò)增特異性。理想的溶解曲線應(yīng)該是單峰型曲線，且熒光閾值越高越好，如果出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上的峰，說(shuō)明有引物二聚體或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)5個(gè)不同靶基因的溶解曲線分析（圖2-1~2-8）可以看出，符合上述兩個(gè)條件的引物對(duì)，分別是zinc knuckle-3，tyrosine -3，APRT-2，P4H-2，CYC-1，其余的引物對(duì)溶解曲線存在呈現(xiàn)多峰，或者存在引物擴(kuò)增效率偏低，導(dǎo)致熒光信號(hào)較低等問(wèn)題。

（七）熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：

將ROC22號(hào)葉片DNA用1xTE依次稀釋為50、25、5、1和0.2 ng/μL等五個(gè)梯度。每個(gè)樣品重復(fù)4次。PCR反應(yīng)體系為25 μL，12．5 μL 2 Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)，上下游引物(10 μmol/L)各1.0μL，模板DNA 2.0μL。反應(yīng)程序?yàn)?0℃ 10 min，95℃ 5 min，95℃ 25 S，60℃ 1min, 共40個(gè)循環(huán)，ABI 7500軟件將自動(dòng)生成各個(gè)內(nèi)源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)R²和擴(kuò)增效率E。獲得各個(gè)內(nèi)源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別為

zinc knuckle-3引物對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.391X+30.025 R²=0.989 E=97.18

tyrosine -3 引物對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.52X+27.329 R²=0.982 E=92.342

APRT-2 引物對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.638X+26.589 R²=0.991 E=98.295

P4H-2 引物對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.267X+29.096 R²=0.992 E=102.344

CYC-1 引物對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.827X+27.134 R²=0.993 E=92.516.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)R² 范圍都在0.98-0.99間，擴(kuò)增效率E也在0.9-1.2之間，所有參數(shù)都是在可以接受的正常范圍之內(nèi)。因此，綜合表2中的Ct值和其相應(yīng)引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，我們選擇在相同擴(kuò)增體系下，即（1 ng/μL）及PCR反應(yīng)條件和體系，通過(guò)比對(duì)各個(gè)基因引物間Ct值的大小，zinc knuckle基因是在甘蔗基因組內(nèi)拷貝數(shù)最低，且為1個(gè)拷貝，對(duì)應(yīng)的zinc knuckle-3引物對(duì)為最適合甘蔗外源基因拷貝數(shù)鑒定的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增引物對(duì)。

實(shí)施例2：轉(zhuǎn)Cry1Ac 基因的甘蔗株系中外源基因的拷貝數(shù)分析

zinc knuckle 內(nèi)源基因引物：Primer F：5'- CAAATGAACTTCCTCGGGAT-3' 即SEQ ID No: 1；Primer R：5'- GGGTTAGAACTGTGGGCATT -3' 即SEQ ID No: 2；探針序列：5’- CCCAAATGCAAGGACTGAATTTGCT -3’ 即SEQ ID No: 3；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系為：50～0.2 ng/μL 模板DNA 2 μL，12.5 μL Fast Start Universal Probe Master(ROX) (2×)，0.3μM 上游引物，0.3μM 下游引物分別0.5 μL，加無(wú)菌超純水至終體積25μL。反應(yīng)程序?yàn)?0℃ 10 min，95℃ 5 min，95℃ 25 S，60℃ 1min, 共40個(gè)循環(huán)，ABI 7500軟件將自動(dòng)生成各個(gè)內(nèi)源基因的溶解曲線。所述的方法經(jīng)過(guò)優(yōu)選，每對(duì)引物平行3次，然后重復(fù)檢測(cè)3 次，Ct 值取三次測(cè)定的平均值。

Cry1Ac 外源基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 引物與探針：

Primer F ：5’- GGGAAATGCGTATTCAATTCAAC -3’；

Primer R ：5’- TTCTGGACTGCGAACAATGG -3’；

探針序列：5’- ACATGAACAGCGCCTTGACCACAGC -3’；

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：將受體為“ROC22”的轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片DNA用1xTE依次稀釋為50、25、5、1和0.2 ng/μL等五個(gè)梯度，制作內(nèi)源基因和外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)樣品重復(fù)4次。PCR反應(yīng)體系為25 μL，12．5 μL 2x TaqMan Mix(ABI)，上下游引物(10 μmol/L)各1.0μL，10 μmol/L探針0.5μL；模板DNA 2.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0℃ 10 min，95℃ 5 min，95℃ 25 S，60℃ 1min, 共40個(gè)循環(huán)，ABI 7500軟件將自動(dòng)生成內(nèi)源基因和外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見(jiàn)圖3和圖4所示。反應(yīng)結(jié)束后，利用軟件將反應(yīng)中的數(shù)據(jù)分析生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中R²表示標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)，Slope 表示標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，Efficiency表示反應(yīng)的擴(kuò)增效率，Y-intercept表示Y軸的截距。正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)滿足以下條件：R²﹥0.99，-3.5﹤Slope﹤-3.0， 0.9﹤Efficiency﹤1.2。獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線：zinc knuckle 內(nèi)源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.392X+30.025 R²=0.989 E=97.18；Cry1Ac 外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=-3.267X+29.096 R²=0.992 E=101.22。本實(shí)施例構(gòu)建的內(nèi)源基因和外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程完全滿足上述條件。

外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)：隨機(jī)挑選待測(cè)轉(zhuǎn)基因甘蔗株系16K-2、16K-3、16K-4、16K-5和甘蔗“ROC22”受體植株，分別選取各植株幼嫩葉片，采用試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司 DNA提取試劑盒（DP350））提取DNA，稀釋至100 ng/μL待用；分別取2 μL 對(duì)各個(gè)樣品的內(nèi)源基因和外源基因進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為25 μL，12．5 μL 2x TaqMan Mix(ABI)，上下游引物(10 μmol/L)各1.0μL，10 μmol/L探針0.5μL；模板DNA 2.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0℃ 10 min，95℃ 5 min，95℃ 25 S，60℃ 1min, 共40個(gè)循環(huán)。拷貝數(shù)的估算參照文獻(xiàn)(Weng et a1., 2004)的公式計(jì)算。X0/R0 = 10[(Ct,X - IX)/SX] -[(Ct,R - IR)/SR]，其中Ct，X為待測(cè)目的基因的Ct值，IX為目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，SX為目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,R為內(nèi)標(biāo)基因的Ct值，IR為內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，SR為內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率?？截悢?shù)的估算即根據(jù)X0/R0的平均值。根據(jù)上述各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，確定了4份樣品中的外源基因拷貝數(shù)分別為，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3不同轉(zhuǎn)基因株系外源基因Cry1Ac拷貝數(shù)的檢測(cè)

由表3可知，轉(zhuǎn)基因甘蔗的內(nèi)源基因特異性引物和探針在4個(gè)不同轉(zhuǎn)基因甘蔗無(wú)性系中均能分別檢測(cè)到外源基因擴(kuò)增，根據(jù)拷貝數(shù)的計(jì)算公式得出了16K-2、16K-3、16K-4、16K-5外源基因Cry1Ac的拷貝數(shù)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建農(nóng)林大學(xué)

<120> 一種適合甘蔗外源基因拷貝數(shù)鑒定的內(nèi)源基因篩選與應(yīng)用

<130> 50

<160> 50

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaatgaact tcctcgggat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggttagaac tgtgggcatt 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccaaatgca aggactgaat ttgct 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctacgatgaa actacaccct tgtc 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cttatgttag cgtgacctat ggtc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tacataattt tagtggcact cagc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

accataattc aattctgcag gtac 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cagggttaga tggcctgaac tg 22

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caaggtcgcg aggattgg 18

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcacggttct cttggaagtc ccttttcc 28

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcctctatca ctttgccctg agt 23

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgaaggaaaa ccccaaagg 19

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccccaaaacc aacagaccta ccctgg 26

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caaatgaact tcctcgggat 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

actggcaatg gtcccaactc 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aataccgtcc ccaatgtcct t 21

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aactcccccg ccccccacc 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aggagacggt actgcaggtt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aaacagccga cgactaaggt 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttacaaggct gcccatccga tg 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cagtatctaa ggcgcagcaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctcatctgca tttggcttgt 20

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ttgaagcctt cagtcttccc tgca 24

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agggaagtgg ttcggtgatg 20

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgataaagag cacatgaacc aaca 24

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgtcagtgga aaaacccggt cacca 25

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctccttgagg ttgggaatgt 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ggttgtggaa ttaccggttc 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ccacgcttcc caccacacat g 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggaaccggta attccacaac 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggttcggtga tgtttgtcag 20

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

aacccggtca ccacagtgtt gg 22

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gtgaaaatat agtaaaaact gcgaagga 28

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ttgtactctc cgcggtttct c 21

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tgaagccatc aacattagcc ctgagga 27

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ccatcaacat tagccctgag 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ccgaacttgt cctgattcct 20

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tgtactctcc gcggtttcac ctttc 25

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ccgtccttaa tcccatacca 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

agggctaatg ttgatggctt 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

caaagcacga ggctgccagc 20

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

cagatatgga aagcacaaaa atgact 26

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gcttaccaag ggctaagtaa tgtca 25

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

atgacattcc cttgcctatg ctgtcgg 27

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gcacccgata ttgacagttg 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tttgtaggga cacagcttgc 20

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cacagccagg gagtttcctg ca 22

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tgatgacatt cccttgccta 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tcctgcatca caactgtcaa 20

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tcgggtgctg cctcctcaat atc 23