本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特異性多肽。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)相關(guān)的疾病是影響當(dāng)今人類健康的一個(gè)嚴(yán)峻的世界性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球有20億的人口感染HBV，而其中有3.5-4億人轉(zhuǎn)為慢性感染，并且僅我國(guó)的慢性感染患者就已經(jīng)占據(jù)了慢性感染總數(shù)中的30％左右(1.2億)，每年有一百萬(wàn)人死于HBV引發(fā)的慢性肝炎，肝硬化以及肝癌。在亞洲，乙肝和丙肝感染是肝臟疾病發(fā)生的主要原因。

HBV是一種3.2kb大小的DNA病毒，能特異性的侵染肝臟細(xì)胞并在其中復(fù)制，是慢性乙型肝炎的致病根源。HBV在肝細(xì)胞中編碼的蛋白包括7個(gè)：Core、Pre-core、Pre S1、Pre S2、S、X，Pol。在進(jìn)化過程中，HBV具備了一套對(duì)抗宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制，其中最為突出的是頻繁的突變，并且能通過補(bǔ)償突變提高交叉抵抗能力去適應(yīng)宿主的抗病毒效應(yīng)，這導(dǎo)致了慢性乙肝的治療異常的困難。如今，深入研究HBV與宿主之間的作用機(jī)制，研發(fā)新型小分子藥物，是有效治療慢性乙型肝炎亟待解決的問題，但是現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)乙型肝炎病毒X蛋白的相關(guān)小分子藥物鮮有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

(一)解決的技術(shù)問題

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種能降解的特異性多肽，該特異性肽段能與HBx蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互作用從而導(dǎo)致HBx的泛素化降解，為相關(guān)小分子藥物的研發(fā)及生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

(二)技術(shù)方案

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特異性多肽，其包含如SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列或其功能片段、或者所述氨基酸序列及其功能片段的功能變體。

優(yōu)選的，所述多肽的作用位點(diǎn)位于所述多肽序列的第30個(gè)位點(diǎn)的組氨酸。

本發(fā)明還提供一種能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特異性多肽在治療乙型肝炎病毒藥物上的應(yīng)用。

(三)有益效果

本發(fā)明提供了一種能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特異性多肽TRIM5g，所述肽段為37個(gè)氨基酸，它能與HBX相互作用，從而使得HBX發(fā)生降解，且降解效果顯著，這為該肽段的發(fā)現(xiàn)將為相關(guān)小分子藥物的研發(fā)及生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1：TRIM5g特異性降解HBX蛋白圖；

圖2：TRIM5g與HBX蛋白相互作用圖；

圖3：BBOX與HBX的相互作用圖；

圖4：HBX與BBOXWT、Mut和空載體與HBX的相互作用圖；

圖5：TRIM5g基因敲除后，HBX在HepG2細(xì)胞中表達(dá)情況；

圖6：組氨酸對(duì)HBV復(fù)制的抑制情況。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：

一種能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特異性多肽，其包含如SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列或其功能片段、或者所述氨基酸序列及其功能片段的功能變體。

所述多肽的作用位點(diǎn)位于所述多肽序列的第30個(gè)位點(diǎn)的組氨酸。

本發(fā)明還提供一種能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特異性多肽在治療乙型肝炎病毒藥物上的應(yīng)用。

特異性多肽對(duì)乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)的降解實(shí)驗(yàn)

1、TRIM5g降解蛋白

在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBX蛋白，同時(shí)轉(zhuǎn)染HBV的其它5個(gè)蛋白或4個(gè)其它ISG蛋白表達(dá)質(zhì)粒，28小時(shí)后，收取細(xì)胞裂解，western檢測(cè)各蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1～3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：TRIM5g能降解HBX，但不能降解HBV的其它5個(gè)蛋白，同樣除了TRIM5g，4個(gè)其它的ISGs也不能降解HBX(圖1)。

在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBX和TRIM5g的表達(dá)質(zhì)粒，4小時(shí)后，免疫共沉淀檢測(cè)兩個(gè)蛋白的相互作用，結(jié)果表明，HBX與TRIM5g有明顯的很強(qiáng)的相互作用(圖2)。

293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染BBOX和HBX表達(dá)質(zhì)粒，24小時(shí)后，免疫共沉淀檢測(cè)兩個(gè)蛋白的相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BBOX能與HBX發(fā)生相互作用并導(dǎo)致HBX的降解(圖3)。

對(duì)照實(shí)驗(yàn)：采用基因快速定點(diǎn)突變的方法將如下所氨基酸突變，用293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBX表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)轉(zhuǎn)染BBOXWT(野生型)，293T細(xì)胞Mut(突變型)以及293T細(xì)胞空載體，24小時(shí)后，免疫共沉淀檢測(cè)兩個(gè)蛋白的相互作用，結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果表明H123A阻斷了BBOX與HBX的相互作用及HBX的降解，同時(shí)在HepG2細(xì)胞中H123A也阻斷了HBX的降解。

空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)：

用CRISPR的方法將HepG2細(xì)胞的TRIM5g基因敲除后，檢測(cè)BX在TRIM5g基因敲除HepG2細(xì)胞中表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明在WT和KO的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBX后，HBX在KO細(xì)胞中明顯升高。

2、組氨酸對(duì)抑制HBV的復(fù)制的抑制情況

(1)在HepG2WT或TRIM5gKO細(xì)胞轉(zhuǎn)染pHBV1.3HBV全基因組表達(dá)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染TRIM5g，BBOXWT，Mut或空載體對(duì)照，72小時(shí)后Elisa檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBeAg以及Q-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6A。

(2)按上述方法轉(zhuǎn)染pHBV1.3，共轉(zhuǎn)BBOX WT，Mut或空載體對(duì)照，72小時(shí)后Elisa檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBeAg以及Q-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6B，6C。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：從圖6中得到TRIM5g敲除能明顯增強(qiáng)HBV在HepG2細(xì)胞中的復(fù)制，重新轉(zhuǎn)染表達(dá)TRIM5g的外援質(zhì)粒又能抑制HBV的復(fù)制，說明TRIM5g在抑制HBV復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)BBOX也能很好的抑制HBV的復(fù)制，H123位點(diǎn)的突變是BBOX的抑制功能消失，說明第123位的組氨酸在BBOX抑制HBV復(fù)制過程中是必不可少的。

需要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語(yǔ)僅僅用來將一個(gè)實(shí)體或者操作與另一個(gè)實(shí)體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實(shí)體或操作之間存在任何這種實(shí)際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語(yǔ)句“包括一個(gè)……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素。

以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。

SEQ ID NO：1：

hcarhgekll lfcqedgkvi cwlcersqeh rghhtfl