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3.發(fā)明背景

3.1綜述

循環(huán)的膽固醇經(jīng)由血液中轉(zhuǎn)運脂質(zhì)的、脂質(zhì)與蛋白質(zhì)組成的血漿脂蛋白復合物顆粒運送。血漿中循環(huán)的脂蛋白顆粒具有以下四種主要類別并且均包括在脂肪轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中：乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。乳糜微粒構(gòu)成了腸內(nèi)脂肪吸收的短壽命產(chǎn)物。VLDL尤其是LDL負責將膽固醇由肝(膽固醇在肝中合成或由飲食來源獲得)遞送至肝外的組織，包括動脈壁。相反，HDL介導膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(RCT)，膽固醇脂質(zhì)的去除，具體地，由肝外組織至肝，膽固醇在肝中儲存、分解代謝、消除或再循環(huán)。HDL在炎癥、轉(zhuǎn)運氧化的脂質(zhì)和白細胞介素中也起有益作用。

脂蛋白顆粒具有包含膽固醇(通常為膽固醇酯的形式)和甘油三酯的疏水核。該核為包含磷脂、未酯化的膽固醇和載脂蛋白的表層所圍繞。載脂蛋白介導脂質(zhì)轉(zhuǎn)運，并且載脂蛋白中的一部分可與脂質(zhì)代謝中涉及的酶相互作用。已經(jīng)鑒別了至少十種載脂蛋白，其包括：ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V、ApoB、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、ApoJ和ApoH。還發(fā)現(xiàn)其它蛋白質(zhì)如LCAT(卵磷脂：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶)、CETP(膽固醇脂轉(zhuǎn)移蛋白)、PLTP(磷脂轉(zhuǎn)移蛋白)和PON(對氧磷酶)也與脂蛋白有關。

心血管疾病，如冠心病、冠狀動脈疾病和動脈粥樣硬化在極大程度上與血清中升高的膽固醇濃度有關。例如，動脈粥樣硬化是一種緩慢進展型疾病，其經(jīng)由動脈壁內(nèi)膽固醇(和膽固醇酯)的蓄積而表征。在巨噬細胞中的膽固醇和膽固醇酯的蓄積導致泡沫細胞的形成，其動脈粥樣硬化斑塊的標志。

令人信服的證據(jù)支持以下理論：在動脈粥樣硬化病變中沉積的脂質(zhì)主要來自于血漿LDL；因此，LDL已被普遍地認為是“有害的”膽固醇，相反，HDL血清濃度與冠心病成反比。事實上，HDL的較高血清濃度被認為是負向的風險因素。據(jù)假設，較高濃度的血漿HDL不僅保護性地對抗冠狀動脈疾病，而且實際上可以誘導動脈粥樣硬化斑塊的消退(參見，例如,Badimon et al.,1992,Circulation 86(Suppl.III):86-94；Dansky and Fisher,1999,Circulation 100:1762-63；Tangirala et al.,1999,Circulation 100(17):1816-22；Fan et al.,1999,Atherosclerosis 147(1):139-45；Deckert et al.,1999,Circulation 100(11):1230-35；Boisvert et al.,1999,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19(3):525-30；Benoit et al.,1999,Circulation 99(1):105-10；Holvoet et al.,1998,J.Clin.Invest.102(2):379-85；Duverger et al.,1996,Circulation 94(4):713-17；Miyazaki et al.,1995,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.15(11):1882-88；Mezdour et al.,1995,Atherosclerosis 113(2):237-46；Liu et al.,1994,J.Lipid Res.35(12):2263-67；Plump et al.,1994,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91(20):9607-11；Paszty et al.,1994,J.Clin.Invest.94(2):899-903；She et al,1992,Chin.Med.J.(Engl).105(5):369-73；Rubin et al.,1991,Nature 353(6341):265-67；She et al.,1990,Ann.NY Acad.Sci.598:339-51；Ran,1989,Chung Hua Ping Li Hsueh Tsa Chih(also translated as:Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi)18(4):257-61；Quezado et al.,1995,J.Pharmacol.Exp.Ther.272(2):604-11；Duverger et al.,1996,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16(12):1424-29；Kopfler et al.,1994,Circulation；90(3):1319-27；Miller et al.,1985,Nature 314(6006):109-11；Ha et al.,1992,Biochim.Biophys.Acta 1125(2):223-29；Beitz et al.,1992,Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 47(2):149-52)。因此，HDL已普遍被認為是“好”膽固醇(參見，例如，Zhang,et al.,2003 Circulation 108:661-663)。

HDL的“保護性”作用在大量研究中得以證實(例如,Miller et al.,1977,Lancet 1(8019):965-68；Whayne et al.,1981,Atherosclerosis 39:411-19)。在這些研究中，LDL升高的濃度似乎與增加的心血管風險相關，而較高的HDL濃度好像具有心血管保護作用。體內(nèi)研究已經(jīng)進一步證明了HDL的保護作用，其顯示注入兔中的HDL可以阻礙膽固醇誘發(fā)的動脈病變的形成(Badimon et al.,1989,Lab.Invest.60:455-61)和/或者可以誘導所述動脈病變消退(Badimon et al.,1990,J.Clin.Invest.85:1234-41)。在對新靶標(TNT)研究的處理的事后分析中，預測HDL-CHOL是用他汀類治療的患者中，甚至在LDL-CHOL小于70mg/dl的患者中的主要心血管事件。

在最近的臨床試驗中，煙酸和兩個CETP抑制劑(Torcetrapib(Pfizer)and Dalcetrapib(Roche))在長期治療中未能降低冠狀動脈事件的發(fā)生率，雖然這些研究中的一些可能遭受了一些混雜因素(Boden et al.,2011,N Engl J Med 365:2255–2267；HPS2-THRIVE Collaborative Group,2013,Eur.Heart J.34:1279-1291；Barter et al.,2007,N Engl J Med 357:2109-2122；Schwartz et al.,2012,N.Engl.J.Med.367:2089-2099)。兩個孟德爾遺傳研究質(zhì)疑了HDL-膽固醇和心血管疾病的風險之間的關聯(lián)(Voight et al.,Lancet DOI:10.1016/S0140-6736(12)60312-2,published online May 17,2012；Holmes et al.,Eur Heart J doi:10.1093/eurheartj/eht571,published online January 27,2014)。這些研究進一步強調(diào)了這樣的想法：功能性HDL顆粒的數(shù)目和逆向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運的增強，而非HDL膽固醇(HDL-C)的升高是用于預防心血管事件的重要因素(Barter et al.,2007,N Engl J Med 357:2109-22；Group et al.,2010,N Engl J Med 362:1563-74；Nissen et al.,2007,The New England journal of medicine 356:1304-16)。的確，在超過5000名患者的MESA臨床試驗中，與CHD和心血管事件的發(fā)生率相關的最佳因素是HDL顆粒的數(shù)目，而不是HDL成分的膽固醇含量(即HDL-c)(Mackey et al.,2012,Journal of the American College of Cardiology 60:508-16；van der Steeg et al.,2008,Journal of the American College of Cardiology 51:634-42)。在有效的他汀類的治療的設置中，HDL顆粒數(shù)目可能比化學測量的HDL-CHOL或ApoA-I更好的殘余風險的標志物(Mora et al.2013,Circulation DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.113.002671)。

3.2反向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、HDL和載脂蛋白A-I

HDL顆粒的保護功能可以通過其在逆脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(RLT)途徑，也稱為逆膽固醇轉(zhuǎn)運(RCT)途徑中的作用來進行解釋。RLT(Tall,1998,Eur Heart J 19:A31-5)途徑負責從動脈除去膽固醇并且將其運輸?shù)礁闻K中以從體內(nèi)消除它們，該途徑主要涉及4個基本步驟。

第一步是通過新生HDL顆粒從動脈中去除膽固醇，該過程稱為“膽固醇去除”。膽固醇是維護在囊泡運輸和信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控中重要的結(jié)構(gòu)域的膜組成成分。在大多數(shù)細胞中，膽固醇是不被分解代謝的。因此，細胞固醇流出的調(diào)節(jié)在細胞固醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵性的作用。細胞固醇可通過非調(diào)節(jié)的被動擴散機制和通過受體，如ABCA1和ABCG1轉(zhuǎn)運體介導的活躍的，受調(diào)節(jié)的，能量依賴性過程兩種流至胞外固醇受體。

LCAT(RCT中的關鍵酶)由腸和肝產(chǎn)生并在主要與HDL成分締合的血漿中進行循環(huán)。LCAT將源自細胞的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，所述膽固醇酯在指定去除的HDL中被分離(參見Jonas 2000,Biochim.Biophys.Acta 1529(1-3):245-56)。膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)與磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)致力于循環(huán)的HDL群的進一步改造。CETP將LCAT生成的膽固醇酯運至其它的脂蛋白，特別是包括ApoB的脂蛋白，如VLDL和LDL。PLTP向HDL供應卵磷脂。HDL甘油三酯通過細胞外的肝甘油三酯脂肪酶進行代謝，并且脂蛋白膽固醇通過肝經(jīng)由幾種機制而除去。

HDL顆粒的功能特征主要通過它們的主要載脂蛋白組分如ApoA-I和ApoA-II而確定。還觀察到與HDL締合的微量ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoA-IV、ApoE、ApoJ。HDL根據(jù)RCT代謝級聯(lián)或通路過程的重構(gòu)狀態(tài)而以多種不同的尺寸以及上述成分的不同混合物存在。

每個HDL顆粒通常包含至少1個分子的，并且通常包括2至4個分子的ApoA-I。如Prof.Gerd Assmann所描述的，HDL顆粒也可以只包括ApoE(γ-LpE顆粒)，其還被認為負責膽固醇外流(參見,例如,von Eckardstein et al.,1994,Curr Opin Lipidol.5(6):404-16)。ApoA-I作為前原載脂蛋白A-I(preproapolipoprotein A-I)由肝和小腸合成，并作為原載脂蛋白A-I(proapolipoprotein A-I)(原ApoA-I(proApoA-I))分泌且快速地發(fā)生裂解從而產(chǎn)生血漿形式的ApoA-I，其是一種243個氨基酸的單多肽鏈(Brewer et al.,1978,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:623-30)。在實驗中直接注射入血流的前原ApoA-I也可以裂解為血漿形式的ApoA-I(Klon et al.,2000,Biophys.J.79(3):1679-85；Segrest et al.,2000,Curr.Opin.Lipidol.11(2):105-15；Segrest et al.,1999,J.Biol.Chem.274(45):31755-58)。

ApoA-I包含由連接體部分(經(jīng)常為脯氨酸)間隔開的6至8個不同的22個氨基酸的α-螺旋或者功能性重復。該重復單元以兩親的螺旋形構(gòu)型存在(Segrest et al.,1974,FEBS Lett.38:247-53)并賦予ApoA-I的主要生物學活性，即，脂質(zhì)結(jié)合和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)活化。

ApoA-I與脂質(zhì)形成以下三種類型的穩(wěn)定復合物：稱為前-β-1HDL的、貧脂質(zhì)的小復合物；稱為前-β-2HDL的、包含極性脂質(zhì)(磷脂和膽固醇)的平盤狀顆粒；以及稱為球狀或成熟HDL(HDL₃和HDL₂)的、包含極性和非極性脂質(zhì)的球狀顆粒。循環(huán)群中的大部分HDL包含ApoA-I和ApoA-II(“AI/AII-HDL成分”)。然而，只包含ApoA-I的HDL成分(“AI-HDL成分”)在RCT中表現(xiàn)更有效。一些流行病學研究證明了Apo-AI-HDL成分抗動脈粥樣硬化的假設(Parra et al.,1992,Arterioscler.Thromb.12:701-07；Decossin et al.,1997,Eur.J.Clin.Invest.27:299-307)。

HDL顆粒由幾種具有不同尺寸、脂質(zhì)組成和載脂蛋白組成的顆粒群制成。可以根據(jù)它們的性能而進行分離，所述性能包括其水合密度、載脂蛋白組成和荷電特征。例如，前-β-HDL成分的特征為具有比成熟α-HDL少的表面電荷。由于這種電荷差異，而使得前-β-HDL和成熟α-HDL在瓊脂糖凝膠中具有不同的電泳遷移率(David et al.,1994,J.Biol.Chem.269(12):8959-8965)。

前-β-HDL與成熟α-HDL的代謝也不同。前-β-HDL具有以下兩種代謝歸宿：由血漿除去以及通過腎代謝或者是重構(gòu)成優(yōu)先通過肝降解的中等尺寸HDL(Lee et al.,2004,J.Lipid Res.45(4):716-728)。

盡管由細胞表面轉(zhuǎn)移膽固醇的機制(即，膽固醇外流)是未知的，但是仍認為貧脂質(zhì)的復合物，前-β-1HDL是從RCT中涉及的外周組織轉(zhuǎn)移的膽固醇的優(yōu)選受體(參見Davidson et al.,1994,J.Biol.Chem.269:22975-82；Bielicki et al.,1992,J.Lipid Res.33:1699-1709；Rothblat et al.,1992,J.Lipid Res.33:1091-97；and Kawano et al.,1993,Biochemistry 32:5025-28；Kawano et al.,1997,Biochemistry 36:9816-25)。在膽固醇由細胞表面募集的這種過程中，前-β-1HDL快速地轉(zhuǎn)化為前-β-2HDL。PLTP可以增加前-β-2HDL盤(disc)形成的速率，但缺少表明PLTP在RCT中的作用的數(shù)據(jù)。LCAT優(yōu)先與盤狀的小(前-β)HDL和球狀的(即成熟)HDL反應，而將卵磷脂或其它磷脂的2-?；D(zhuǎn)移至膽固醇的游離羥基殘基以形成膽固醇酯(保留在HDL中)和溶血卵磷脂。LCAT反應需要ApoA-I作為活化劑；即，ApoA-I是LCAT的天然輔因子。在HDL中分離的膽固醇至其酯的轉(zhuǎn)化防止了膽固醇重新進入細胞中，且凈結(jié)果為膽固醇作為細胞的成分從細胞除去并且維持了HDL。

ApoAI-HDL成分(即，包括ApoA-I而無ApoA-II)中成熟HDL顆粒中的膽固醇酯經(jīng)由肝除去并比源自包含ApoA-I和ApoA-II的HDL(A1/AII-HDL成分)的那些更有效地加工入膽汁中。這可部分地歸因于ApoAI-HDL與肝細胞膜的更有效的結(jié)合。已經(jīng)假定存在HDL受體，并且已將B類I型清除劑受體(SR-BI)鑒別為HDL受體(Acton et al.,1996,Science 271:518-20；Xu et al.,1997,Lipid Res.38:1289-98)。SR-BI在生成類固醇的組織(如，腎上腺)及肝中最大量表達(Landschulz et al.,1996,J.Clin.Invest.98:984-95；Rigotti et al.,1996,J.Biol.Chem.271:33545-49)。對于HDL受體的綜述，參見Broutin et al.,1988,Anal.Biol.Chem.46:16-23。

經(jīng)由ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子AI(ABCA1)的最初脂化對于血漿HDL的形成以及對于前-β-HDL顆粒的膽固醇外流能力而言是至關重要的(Lee and Parks,2005,Curr.Opin.Lipidol.16(1):19-25)。根據(jù)這些作者，這種最初的脂化使得前-β-HDL更有效地起膽固醇受體的作用并且防止了ApoA-I與預存在的血漿HDL顆粒快速締合，從而得到前-β-HDL顆粒更強的膽固醇外流能力。

ABCA1缺乏是家族性主要低α-脂蛋白血癥(Familial primary低α-脂蛋白血癥)的潛在原因之一。家族性主要低α-脂蛋白血癥是由負責HDL合成/成熟的基因之一，如ABCA1的遺傳缺陷引起的，并且與非常低數(shù)目的高密度脂蛋白(HDL)顆粒相關聯(lián)，也反映為非常低的載脂蛋白Al(ApoA-I)的血漿濃度。該疾病還通常與低HDL-膽固醇(HDL-C)或過早心血管疾病的陽性家族史相關聯(lián)。

純合的ABCA1缺乏癥(Homozygous ABCA1 deficiency)，也稱為Tangier病，其特征在于HDL，載脂蛋白A-L(ApoA-1)的嚴重血漿缺失或不存在，和膽固醇酯在整個身體的組織中的蓄積(Puntoni et al,2012)。具有Tangier病的受試者表現(xiàn)為大，黃-橙色扁桃體和/或神經(jīng)病。其他臨床特征包括肝腫大，脾腫大，過早心肌梗塞或中風，血小板減少，貧血，和角膜混濁。

最近，第二個ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ABCG1)被描述為介導細胞內(nèi)膽固醇的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。ABCG1的表達通過與含有主要是球形的，中型到大型HDL顆粒，以及大型盤狀HDL顆粒的膽固醇的相互作用增強了膽固醇的流出。作為ABCG1的受體，較大的顆粒與較小的HDL顆粒一樣有效。

通過肝X受體轉(zhuǎn)錄因子增加了ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體ABCA1和ABCG1(Costet et al.,2000,J Biol Chem 275:28240-5；Kennedy et al.,2001,J Biol Chem 276:39438-47)，從而在通過ABCA1和ABCG1轉(zhuǎn)運體兩種調(diào)節(jié)膽固醇的流出中了起到了關鍵的作用。在體內(nèi)，肝X受體通過膽固醇裝載細胞中的特定氧化固醇激活。在巨噬細胞中，ABCA1和ABCG1是肝X受體的關鍵靶基因(Janowski et al.,1996,Nature 383:728-31)。雖然ABCA1促進膽固醇流出至膽固醇缺失和磷脂缺失的ApoA-L和apoE復合體，但ABCG1促進其流出至HDL顆粒(Duong et al.,2006,Journal of lipid research 47:832-43；Mulya et al.,2007,Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology 27:1828-36；Wang et al.,2004,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101:9774-9)。ABCA1和ABCG1轉(zhuǎn)運體表達的增加與膽固醇從質(zhì)膜的內(nèi)部到外部小葉的再分布相關，促進膽固醇從膽固醇裝載的泡沫細胞流出到HDL顆粒(Pagler et al.,2011,Circulation research 108:194-200)。已經(jīng)從動物研究證實了ABCA1和ABCG1的協(xié)調(diào)參與在介導細胞膽固醇流出。ABCA1在小鼠中的單一缺失導致動脈粥樣硬化的中度增加，而且ABCG1的缺失沒有影響；然而，組合缺失導致明顯加快的病變發(fā)展(Yvan-Charvet et al.,2007,The Journal of clinical investigation 117:3900-8)。雙敲除巨噬細胞表現(xiàn)出顯著缺失的膽固醇流出至HDL和ApoA-I，和當用脂多糖處理時增加的炎癥反應(Yvan-Charvet et al.,2008,Circulation 118:1837-47)。

最近也用微RNA(miRNA)研究了膽固醇穩(wěn)態(tài)，微RNA是參與生理過程的小的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼RNA(Rayner et al.,2010,Science(New York,N.Y.)328:1570-3；Najafi-Shoushtari et al.,2010,Science(New York,N.Y.)328:1566-9；Marquart et al.,2010,PNAS)。MIR-33，是位于編碼固醇調(diào)控元件內(nèi)結(jié)合因子-2的基因內(nèi)的內(nèi)含子miRNA，同時抑制ABCA1和ABCG1的肝表達，降低HDL-C的濃度(Yvan-Charvet et al.,2008,Circulation 118:1837-47；Marquart et al.,2010,PNAS)，以及抑制巨噬細胞中的ABCA1表達，從而導致降低的膽固醇流出(Yvan-Charvet et al.,2008,Circulation 118:1837-47)。MIR-33的拮抗提高HDL-C，減少動脈粥樣硬化的小鼠模型(雷納等人，2011，臨床研究雜志121：2921-31)的寡核苷酸。小鼠模型中通過寡核苷酸進行的MIR-33的拮抗提高HDL-C，并減少動脈粥樣硬化(Rayner et al.,2011,The Journal of Clinical Investigation 121:2921-31)。

ABCA1和ABCG1受細胞內(nèi)膽固醇含量高度調(diào)節(jié)。過載細胞脂質(zhì)導致氧化固醇(oxysterol))的形成，其激活核肝X受體(LXR以誘導ABCA1和ABCG1的轉(zhuǎn)錄，因此導致膽固醇流出(Jakobsson et al.,2012,Trends in pharmacological sciences 33:394-404)。因此，膽固醇流出是通過HDL顆粒的胞外濃度和組成以及ABC轉(zhuǎn)運體的活性兩者來確定的。

有趣的是，看起來ABCA1的表達在已經(jīng)裝載了HDL顆粒的細胞介質(zhì)的存在下(Langmann等，1999，生化和生物物理研究通訊257：29-33)下調(diào)(Langmann et al.,1999,Biochemical and biophysical research communications 257:29-33)。

作為細胞膽固醇穩(wěn)態(tài)的關鍵調(diào)節(jié)的膽固醇流出對許多細胞功能，例如細胞增殖和造血干細胞的運動發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)步驟(Tall et al.,2012,Arterioscler Thromb Vasc Biol 32:2547-52)。

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G4(ABCG4)介導膽固醇流出到HDL，這導致巨核細胞增殖(Murphy et al.,2013,Nature medicine 19:586-94)。

膽固醇流出調(diào)節(jié)單核細胞和巨噬細胞的炎癥反應(Westerterp et al.,2013,Circulation research 112:1456-65)，淋巴細胞的擴充(Sorci-Thomas et al.,2012,Arterioscler Thromb Vasc Biol 32:2561-5)，通過內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)進行的一氧化氮(NO)的產(chǎn)生(Terasaka et al.,2010,Arterioscler Thromb Vasc Biol 30:2219-25)，和來自胰腺β細胞的胰島素產(chǎn)生(Kruit et al.,2012,Diabetes 61:659-64)。

CETP還可在RCT中起重要作用。CETP活性或其受體VLDL和LDL的變化在HDL群的“重構(gòu)”中起重要作用。例如，在CETP不存在下，HDL變成不可清除的大顆粒。(對于RCT和HDL的綜述，參見Fielding and Fielding,1995,J.Lipid Res.36:211-28；Barrans et al.,1996,Biochem.Biophys.Acta 1300:73-85；Hirano et al.,1997,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17(6):1053-59)。

HDL也在其它脂質(zhì)和非極性分子的逆轉(zhuǎn)運以及解毒作用中起重要作用，即，將脂質(zhì)由細胞、器官和組織轉(zhuǎn)運至肝進行分解代謝和排出。此類脂質(zhì)包括鞘磷脂(SM)、氧化的脂質(zhì)和溶血磷脂酰膽堿。例如，Robins和Fasulo(1997,J.Clin.Invest.99:380-84)已經(jīng)證明了HDL刺激植物甾醇經(jīng)由肝轉(zhuǎn)運入膽汁分泌物中。

HDL的主要組分ApoA-I可以與SM于體外締合。當使用牛腦SM(BBSM)對ApoA-I進行體外重構(gòu)(reconstituted)時，在臨近BBSM相變溫度的溫度28℃產(chǎn)生最大的重構(gòu)率(Swaney,1983,J.Biol.Chem.258(2),1254-59)。在BBSM:ApoA-I比值為7.5:1或更低(wt/wt)時，形成了一種重構(gòu)的均質(zhì)HDL顆粒，每個顆粒包含三分子ApoA-I并且具有360:1的BBSM:ApoA-I摩爾比。該HDL顆粒在電子顯微鏡下為盤狀的復合物，其類似于通過在磷脂/蛋白質(zhì)升高的比值下將ApoA-I與磷脂酰膽堿進行重組而獲得的復合物。然而，BBSM:ApoA-I比值為15:1(wt/wt)時，形成了具有較高磷脂:蛋白質(zhì)摩爾比(535:1)的、較大直徑的盤狀復合物。這些復合物與使用磷脂酰膽堿形成的ApoA-I復合物相比，明顯更大、更穩(wěn)定并且對于變性更具抵抗力。

初期膽固醇受體(前-β-HDL以及γ-遷移ApoE包含脂蛋白)中鞘磷脂(SM)增多，表明SM可以增強這些顆粒促進膽固醇外流的能力(Dass and Jessup,2000,J.Pharm.Pharmacol.52:731-61；Huang et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1834-38；Fielding and Fielding 1995,J.Lipid Res.36:211-28)。

3.3.HDL和ApoA-I的保護機制

近來對于HDL保護機制的研究焦點在于載脂蛋白A-I(ApoA-I)，即HDL的主要組分。較高血漿濃度的ApoA-I與冠狀病變的缺失或減少有關(Maciejko et al.,1983,N.Engl.J.Med.309:385-89；Sedlis et al.,1986,Circulation 73:978-84)。

在實驗動物中注入ApoA-I或HDL可產(chǎn)生顯著的生物化學變化，以及降低動脈粥樣硬化病變的程度及嚴重性。在Maciejko和Mao(1982,Arteriosclerosis 2:407a)、Badimon等人(1989,Lab.Invest.60:455-61；1989,J.Clin.Invest.85:1234-41)的最初報告之后，發(fā)現(xiàn)通過注入HDL(d＝l.063-1.325g/ml)可顯著地降低喂食膽固醇的兔中動脈粥樣硬化病變的程度(降低45％)以及降低其膽固醇酯含量(降低58.5％)。他們還發(fā)現(xiàn)注入HDL使確定的病變出現(xiàn)接近50％的消退。Esper等人(1987,Arteriosclerosis 7:523a)已經(jīng)證明，注入HDL可以顯著地改變患有遺傳性高膽固醇血癥的、Watanabe兔的血漿脂蛋白組成，所述遺傳性高膽固醇血癥可發(fā)展成早期的動脈病變。在這些兔中，注入HDL可使保護性HDL與導致動脈粥樣硬化的LDL之間的比值超過兩倍。最近，CER-001，重組人載脂蛋白A-I改造的前-βHDL(apolipoprotein A-I engineered pre-βHDL)的幾次輸注能夠在LDL受體敲除小鼠中減少血管炎癥并促進飲食誘導的動脈粥樣硬化的消退，此小鼠是用于家族性的高膽固醇血癥的臨床前模型(HDLTardy et al.,Atherosclerosis 232(2014)110-118)。

通過ApoA-I在體外發(fā)揮溶纖維蛋白活性的觀察結(jié)果進一步強調(diào)了HDL在動物模型中預防動脈疾病的潛力(Saku et al.,1985,Thromb.Res.39:1-8)。Ronneberger(1987,Xth Int.Congr.Pharmacol.,Sydney,990)證明ApoA-I可以增加Beagle犬與Cynomologous猴的血纖蛋白溶解。發(fā)現(xiàn)在體外的人血漿中具有類似的活性。Ronneberger能夠證實在經(jīng)ApoA-I治療的動物中，脂質(zhì)沉積和動脈斑塊形成的減少。

體外研究表明，ApoA-I與卵磷脂的復合物可以促進游離的膽固醇由培養(yǎng)的動脈平滑肌細胞外流(Stein et al.,1975,Biochem.Biophys.Acta,380:106-18)。HDL通過這種機制還可以減少這些細胞的增殖(Yoshida et al.,1984,Exp.Mol Pathol.41:258-66)。

也已證明使用包括ApoA-I或ApoA-II模擬肽的HDL灌注療法通過ABCA1轉(zhuǎn)運子而調(diào)節(jié)血漿HDL濃度，從而產(chǎn)生了治療心血管疾病的效力(參見,例如,Brewer et al.,2004,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24:1755-1760)。

已經(jīng)分離出ApoA-I的兩種天然形成的人多態(tài)性，其中精氨酸殘基被半胱氨酸取代。在載脂蛋白A-I_Milano(ApoA-I_M)中，這種取代出現(xiàn)在殘基173，而在載脂蛋白A-I_巴黎(ApoA-I_p)中，這種取代出現(xiàn)在殘基151(Franceschini et al.,1980,J.Clin.Invest.66:892-900；Weisgraber et al.,1983,J.Biol.Chem.258:2508-13；Bruckert et al.,1997,Atherosclerosis 128:121-28；Daum et al.,1999,J.Mol.Med.77:614-22；Klon et al.,2000,Biophys.J.79(3):1679-85)。還已經(jīng)分離了另外的ApoA-I的天然形成的人多態(tài)性，其中亮氨酸在144位被精氨酸取代。該多態(tài)性已經(jīng)稱為載脂蛋白A-I Zaragoza(ApoA-I_Z)且與嚴重的α低脂蛋白血癥和高密度脂蛋白(HDL)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的增強作用相關(Recalde et al.,2001,Atherosclerosis 154(3):613-623；Fiddyment et al.,2011,Protein Expr.Purif.80(1):110-116)。

包含ApoA-I_M或ApoA-I_p的二硫化物連接的同源二聚體的重構(gòu)HDL顆粒與包含野生型ApoA-I的重構(gòu)HDL顆粒相比，其清除二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)乳狀液的能力及其促進膽固醇外流的能力相似(Calabresi et al.,1997b,Biochemistry 36:12428-33；Franceschini et al.,1999,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19:1257-62；Daum et al.,1999,J.Mol.Med.77:614-22)。在兩種突變體中，雜合的個體降低了HDL的濃度，但是自相矛盾地是，其也降低了動脈粥樣硬化的風險(Franceschini et al.,1980,J.Clin.Invest.66:892-900；Weisgraber et al.,1983,J.Biol.Chem.258:2508-13；Bruckert et al.,1997,Atherosclerosis 128:121-28)。盡管包含任一變體的重構(gòu)HDL顆粒與包含野生型ApoA-I的重構(gòu)HDL顆粒相比時具有降低的效力，但是其能夠活化LCAT(Calabresi et al.,1997,Biochem.Biophys.Res.Commun.232:345-49；Daum et al.,1999,J.Mol.Med.77:614-22)。

ApoA-I_M突變體作為常染色體顯性性狀遺傳；并且已經(jīng)鑒別了該家族內(nèi)的八代載體(Gualandri et al.,1984,Am.J.Hum.Genet.37:1083-97)。單個ApoA-I_M載體狀態(tài)的特征為顯著降低的HDL-膽固醇濃度。盡管單個載體顯著降低HDL膽固醇濃度，但是其并未明顯地表現(xiàn)出任何增加的動脈疾病風險。事實上，通過研究系譜檔案(genealogical records)發(fā)現(xiàn)這些受試者受到“保護”而使其免于動脈粥樣硬化(Sirtori et al.,2001,Circulation,103:1949-1954；Roma et al.,1993,J.Clin.Invest.91(4):1445-520)。

ApoA-I_M在突變體載體中的、可能的保護作用機制似乎與ApoA-I_M突變體的結(jié)構(gòu)修飾有關，而在該結(jié)構(gòu)中，缺失了一個α-螺旋并且增加了暴露的疏水性殘基(Franceschini et al.,1985,J.Biol.Chem.260:1632-35)。多個α-螺旋緊密結(jié)構(gòu)的缺失使該分子的柔韌性增加，而所述分子與正常的ApoA-I相比，更易于與脂質(zhì)締合。此外，脂蛋白復合物對變性更敏感，從而表明在突變體中，也可以改善脂質(zhì)的遞送。

Bielicki等人(1997,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17(9):1637-43)已經(jīng)證明ApoA-I_M與野生型ApoA-I相比，具有募集膜膽固醇的有限能力。此外，由ApoA-I_M與膜脂質(zhì)締合而形成的初生HDL主要是7.4nm的顆粒，而不是由野生型ApoA-I形成的、較大的9nm和11nm的復合物。這些觀察結(jié)果表明，在ApoA-I基本序列中Arg₁₇₃→Cys₁₇₃的取代干擾了細胞膽固醇募集和初生HDL組裝的正常過程。該突變明顯與從細胞除去膽固醇的降低的效力有關。因此，其抗動脈粥樣硬化的性質(zhì)可能與RCT無關。它也可能是由于其限制HDL成熟為小顆粒的能力。

歸因于Arg₁₇₃→Cys₁₇₃取代的、最顯著的結(jié)構(gòu)變化是ApoA-I_M的二聚作用(Bielicki et al.,1997,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17(9):1637-43)。ApoA-I_M可以與自身形成同源二聚體而與ApoA-II形成異源二聚體。對于包含載脂蛋白混合物的血液成分的研究表明，循環(huán)中二聚體和復合物的存在是造成載脂蛋白消除半衰期延長的原因。已在突變體載體的臨床研究中觀察到此類消除半衰期的延長(Gregg et al.,1988,NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants:From Gene Structure to Phenotypic Expression,Limone S G)。其它研究表明，ApoA-I_M二聚體(ApoA-I_M/ApoA-I_M)在體外的HDL顆粒互變中起抑制因子的作用(Franceschini et al.,1990,J.Biol.Chem.265:12224-31)。

3.4.目前用于血脂異常及相關病癥的治療

血脂異常障礙是與升高的血清膽固醇和甘油三酯濃度以及較低的血清HDL:LDL比值相關的疾病，并且其包括高脂血癥(特別是高膽固醇血癥)、冠心病、冠狀動脈疾病、血管和血管周圍疾病、以及諸如動脈粥樣硬化的心血管疾病。也可以包括與動脈粥樣硬化相關的綜合征，比如由動脈機能不全引起的短暫性腦缺血發(fā)作或者間歇性跛行。目前具有大量可用于降低與血脂異常障礙相關的、高血清膽固醇和甘油三酯的治療。但是，鑒于療效、副作用和患病人群，而使得每種治療具有各自的缺點和限制。某些血脂異常病癥與HDL缺失相關，這是由于在負責HDL合成，成熟或消除的基因中的突變，所述血脂異常病癥例如但不限于Tangier病，ABCA1缺陷，ApoA-I缺失，LCAT缺失或魚眼病。這些病癥可以重新編組到家族性原發(fā)性低α-脂蛋白血癥(FPHA)的術(shù)語下。

膽汁酸結(jié)合樹脂是一類中斷膽汁酸從腸到肝的再循環(huán)的藥物；例如考來烯胺(QuestranBristol-Myers Squibb)，鹽酸考來替泊(The Upjohn Company)和鹽酸考來維侖(Daiichi-Sankyo Company)。當口服時，這些帶正電荷的樹脂結(jié)合腸中的帶負電荷的膽汁酸。因為樹脂不能從腸中吸收，所以它們與攜帶的膽汁酸一起排出。然而，這樣的樹脂的使用最多只將血清膽固醇水平降低約20％，并且與胃腸道副作用相關，包括便秘和某些維生素缺乏。此外，由于樹脂結(jié)合其它藥物，所以必須在攝取樹脂之前至少一小時或四至六小時服用其它口服藥物；從而使心臟病患者的藥物方案復雜化。

他汀類(statins)是降膽固醇藥物，其通過抑制膽固醇生物合成通路中所涉及的關鍵酶，即HMGCoA還原酶而阻斷膽固醇的合成。他汀類有時可結(jié)合膽汁酸結(jié)合樹脂使用，所述他汀類的例子如洛伐他汀辛伐他汀普伐他汀氟伐他汀和阿伐他汀他汀類顯著降低血清膽固醇和血清LDL的濃度，并且延緩冠狀動脈粥樣硬化的進程。然而，血清HDL膽固醇的濃度僅中等地增加。LDL作用減弱的機制可能涉及VLDL濃度的降低以及LDL受體細胞表達的誘導，而其造成了產(chǎn)量減少和/或LDL分解代謝增強。包括肝和腎功能障礙的副作用與這些藥物的使用有關(The Physicians Desk Reference,56^th Ed.,2002,Medical Economics)。

煙酸(尼克酸)是一種水溶性的維生素B-復合物，其作為食物添加物和抗高血脂藥使用。煙酸減少了VLDL的形成并且在降低LDL方面是有效的。在一些情況中，煙酸與膽汁酸結(jié)合樹脂結(jié)合使用。當煙酸以足夠的劑量使用時，可以增加HDL，但是當以這樣高的劑量使用時，其有效性受到嚴重副作用的限制。是一種延長釋放的煙酸形式，其與純煙酸相比產(chǎn)生更少的副作用。煙酸/洛伐他汀是一種含有煙酸和洛伐他汀的制劑，其聯(lián)合了每種藥物的益處。ARBITER 6-HALTS(動脈生物學，其用于調(diào)查降低膽固醇6-HDL和LDL的治療策略在動脈粥樣硬化中的治療效果)試驗表明，煙酸，不僅有利于改變血脂，但能減少在頸動脈和冠狀動脈中的斑塊形成(Villines et al.,2010,J Am Coll Cardiol 55:2721-6)。不幸的是，由美國國立衛(wèi)生研究院支持的大結(jié)果試驗AIM-HIGH(動脈粥樣硬化在具有低HDL/高甘油三酯的代謝綜合征中的干預)，在招募超過3000名患者后因為無效而停止(Investigators et al.,2011,N Engl J Med 365:2255-67)。HPS-THRIVE(心臟保護研究2-治療HDL以減少血管事件的發(fā)生率)試驗，研究了除辛伐他汀之外，緩釋煙酸與laropiprant(前列腺素D2受體拮抗劑，可減少皮膚潮紅的發(fā)病率)的組合在處于高心血管風險的25 673患者中的效應，已經(jīng)顯示煙酸laropiprant-組合對主要血管事件沒有顯著的好處(Group,2013,Eur Heart J 34:1279-91)。

一類新的增加HDL膽固醇的藥物是CETP抑制劑。通過降低膽固醇酯從HDL轉(zhuǎn)移到VLDL或LDL，CETP抑制劑產(chǎn)生了血漿HDL-膽固醇水平的顯著的和持續(xù)增加，增加了30至140％(參照)。與他汀相關的LDL膽固醇保持不變(Dalcetrapib)或進一步降低約40％(torcetrapib,anacetrapib,or evacetrapib)。在ILLUMINATE(血脂水平管理的研究以理解其對動脈粥樣硬化事件的影響)試驗中，將添加了Torcetrapib的80mg的阿托伐他汀施用于15 067例患者，所述添加與增加的死亡率和發(fā)病率相關聯(lián)(Barter et al.,2007,N Engl J Med 357:2109-22)，盡管相比于單獨的阿托伐他汀HDL膽固醇增加了80％，并且LDL-膽固醇降低了25％(Barter et al.,2007,N Engl J Med 357:2109-22)。另外兩個試驗中，RADIANCE 2(通過用新膽固醇-酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑成像來評級動脈粥樣硬化改變)試驗(Bots et al.,2007,Lancet 370:153-60)，其使用B-模式頸動脈超聲，以及在ILLUSTRATE(脂水平管理研究，其使用冠狀動脈超聲通過CETP的抑制和HDL的提高評估動脈粥樣硬化的減少)試驗(Nissen et al.,2007,N Engl J Med 356:1304-16)中，其使用冠脈血管內(nèi)超聲波，Torcetrapib并沒有減少頸動脈內(nèi)膜中層厚度，也沒有降低冠狀斑塊體積，盡管存在血脂譜的有利變化。這些不利的結(jié)果很可能是由于脫靶效應，如血壓增加，這可能與來自腎上腺的醛固酮的增加分泌相關(Hu et al.,2009,Endocrinology 150:2211-9；Forrest et al.,2008,British journal of pharmacology 154:1465-73)。已經(jīng)開發(fā)了其他的CETP抑制劑如anacetrapib，dalcetrapib和evacetrapib，這些看起來缺少了torcetrapib的脫靶效應。這些化合物不影響醛固酮分泌。在DEFINE(確定用Anacetrapib進行的CETP抑制的功效和耐受性)試驗中，與阿托伐他汀相比，anacetrapib使HDL膽固醇增加了約140％和使LDL膽固醇降低40％(Cannon et al.,2010,The New England journal of medicine 363:2406-15)。dal-OUTCOMES試驗的間斷分析，顯示在ACS患者中與安慰劑相比，dalcetrapib沒有益處，然而HDL膽固醇增加了約30％，和ApoA-I增加了18％，而LDL-膽固醇未改變(Schwartz et al.,2012,The New England journal of medicine 121105113014000)。缺少療效被推定為與他汀類下調(diào)ABCA1相關(Niesor et al.poster 167presented at the American College of Cardiology,62nd annual scientific sessions March 9-11,2013,San Francisco,CA,USA)。

貝特類(Fibrates)是一類降脂質(zhì)藥物，其用于治療各種形式的高脂血癥(即，血清甘油三酯升高)，所述高脂血癥也可以與高膽固醇血癥有關。貝特類似乎減少了VLDL成分并且適當?shù)卦黾恿薍DL，但是，這些藥物對于血清膽固醇的作用卻是可變的。在美國，貝特類如氯貝丁酯非諾貝特和苯扎貝特已被批準作為降血脂藥使用，但仍未獲得批準用作高膽固醇血癥藥物。例如，氯貝丁酯是一種降血脂藥，其(經(jīng)由未知的機制)通過減少VLDL成分而起降低血清甘油三酯的作用。盡管在某些患者亞群中可以降低血清膽固醇，但是其對于藥物的生物化學反應是可變的，并且不可能總是預知哪名患者將獲得有利的結(jié)果。未表現(xiàn)出預防冠心病的療效?；瘜W和藥理學相關的藥物吉非貝齊是一種脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑，其中等地降低血清甘油三酯和VLDL膽固醇，并中等增加HDL膽固醇-HDL₂和HDL₃亞成分以及ApoA-I和A-II(即，AI/AMT-HDL成分)。但是，該脂質(zhì)應答是不均勻的(heterogeneous)，特別是在不同的患者群體中。此外，盡管在無冠心病史或無現(xiàn)存冠心病癥狀的、40-55歲之間的男性患者中觀察到了冠心病的預防作用，但是還不清楚將這些結(jié)果以何種程度外推至其它的患者群體(如，婦女、老年人和較年輕的男性)。事實上，在患有確定的冠心病的患者中并未觀察到療效。嚴重的副作用與貝特類的使用有關，而所述副作用包括毒性作用，如惡性腫瘤(特別是胃腸癌)、膽囊疾病以及非冠狀死亡發(fā)生幾率的增加。

對于絕經(jīng)后婦女中的中度的高膽固醇血癥，可考慮口服雌激素替代療法。然而，HDL的增加可能伴有甘油三酯的升高。當然，雌激素治療受限于具體的患者群體(絕經(jīng)后婦女)并且與嚴重的副作用有關，而所述副作用包括誘發(fā)惡性腫瘤、膽囊疾病、血栓栓塞性疾病、肝腺瘤、血壓升高、葡萄糖耐受不良以及高鈣血癥。

其它可用于治療高脂血癥的藥物包括依澤替米貝(Merck)，其阻斷或抑制膽固醇的吸收。但是，依澤替米貝的抑制劑已顯示出某種毒性。

HDL以及與磷脂復合的、重組形式的ApoA-I可用作非極性或兩親性分子的吸收劑/清除劑，所述非極性或兩親性分子如膽固醇及衍生物(氧甾醇、氧化的甾醇、植物甾醇等)、膽固醇酯、磷脂及衍生物(氧化的磷脂)、甘油三酯、氧化產(chǎn)物和脂多糖(LPS)(參見，如，Casas et al.,1995,J.Surg.Res.Nov 59(5):544-52)。HDL還可以用作TNF-α及其它淋巴因子的清除劑。HDL還可以用作人血清對氧磷酶的載體，所述人血清對氧磷酶如PON-1、-2、-3。對氧磷酶是一種與HDL締合的酯酶，其對于保護細胞組分對抗氧化是重要的。LDL的氧化在氧化應激過程中產(chǎn)生，其似乎與動脈粥樣硬化的形成有直接關聯(lián)(Aviram,2000,Free Radic.Res.33 Suppl:S85-97)。對氧磷酶似乎在動脈粥樣硬化和心血管疾病的易受性方面起重要作用(Aviram,1999,Mol.Med.Today 5(9):381-86)。人血清對氧磷酶(PON-1)與高密度脂蛋白(HDL)結(jié)合。其活性與動脈粥樣硬化呈負相關。PON-1水解有機磷酸酯并且可以通過抑制HDL和低密度脂蛋白(LDL)的氧化而保護免受動脈粥樣硬化(Aviram,1999,Mol.Med.Today 5(9):381-86)。實驗研究表明，這種保護作用與PON-1水解氧化的脂蛋白中的特異性脂質(zhì)過氧化物的能力有關。保持或促進PON-1活性的干預可有助于延緩動脈粥樣硬化與冠心病的發(fā)作。

HDL進一步具有抗血栓藥和纖維蛋白原還原劑的作用以及作為失血性休克藥物的作用(Cockerill et al.,WO 01/13939,2001年3月1日公布)。HDL，特別是ApoA-I，其已被證明促進敗血癥產(chǎn)生的脂多糖交換為包含ApoA-I的脂質(zhì)顆粒，從而功能性地中和所述脂多糖(Wright et al.,WO9534289,1995年12月21日公布；Wright et al.,1999年7月27日發(fā)行的美國專利5,928,624；1999年8月3日發(fā)行的美國專利5,932,536)。

最近，不同的試驗已經(jīng)描述用增加HDL膽固醇的藥物，如貝特類，煙酸或CETP抑制劑在使冠心病風險降低至比用他汀類單獨治療獲得的風險(見上文)還要低中的困難。在人HDL代謝的幾個先天性缺陷，以及在具有改變的HDL代謝的基因小鼠模型中，HDL-C的變化不與在心血管風險或動脈粥樣硬化斑塊大小的變化分別相關(Besler et al.,2012,EMBO molecular medicine 4:251-68；Voight et al.,2012,Lancet 6736:1-9；Frikke-Schmidt et al.,JAMA,June 4,2008-Vol 299,No.21；Holmes et al.,Eur Heart J first published online January 27,2014doi:10.1093/eurheartj/eht571)。因此，HDL作為治療靶的致病作用和適合性是尚未確定的。這導致這樣的結(jié)論，即在未來的臨床試驗中，HDL的功能，而不是簡單的HDL膽固醇水平(作為生物標志物)可能對評估HDL在心血管疾病中的益處是關鍵的。當研究HDL的功能時，看起來HDL代謝是被高度調(diào)節(jié)的，因此我們可以假設，極端的改變，如HDL水平的強勁增長(例如用CETP抑制劑治療實現(xiàn)的)可以推動下調(diào)，這將導致對心血管疾病的中度影響。這一假設由來自兩個臨床試驗的結(jié)果進行了強調(diào)，其中使用了不同的重構(gòu)的HDL并且其中沒有觀察到劑量反應關系。此外，在兩個試驗中均描述存在最高劑量對于斑塊消退的效應比較低劑量低的趨勢(Nissen et al.,2003,JAMA 290:2292-300；Tardif et al.,2007,JAMA 297:1675-82)。進一步分析了在最近的臨床試驗中CETP抑制劑，Dalcetrapib的有益效果的缺失，并導致這樣的結(jié)論：一些他汀類可以具有對巨噬細胞上的ABCA1表達特定的下調(diào)作用，這能夠削弱HDL在ACS患者中動脈粥樣硬化斑塊消退的益處。總而言之，這些觀察結(jié)果允許推斷出，HDL水平的適當增加或HDL(前betan HDL與球形HDL)的性質(zhì)，或HDL顆粒的數(shù)目對于心血管疾病的成功治療可能是關鍵的。

來自健康受試者的HDL可在脈管系統(tǒng)，并且特別是在內(nèi)皮細胞上發(fā)揮幾種保護作用(Besler et al.,2011,The Journal of clinical investigation 121:2693-708；Yuhanna et al.,2001,Nature medicine 7:853-7；Kuvin et al.,2002,American heart journal 144:165-72)。來自健康受試者的HDL刺激NO從培養(yǎng)中的人主動脈內(nèi)皮細胞的釋放和增加eNOS表達。(Besler et al.,2011,The Journal of clinical investigation 121:2693-708；Yuhanna et al.,2001,Nature medicine 7:853-7；Kuvin et al.,2002,American heart journal 144:165-72)HDL抑制粘附分子，如血管細胞粘附分子1(VCAM1)的表達，并因此抑制了單核細胞的粘附。(Nicholls et al.,2005,Circulation 111:1543-50；Ansell et al.,2003,Circulation 108:2751-6)。如上所述，HDL也發(fā)揮抗血栓效應。在小鼠頸動脈模型中，在血管損傷之后HDL增強內(nèi)皮修復。從健康受試者獲得的HDL在體外和在體內(nèi)apoE缺陷小鼠中降低內(nèi)皮細胞凋亡(Riwanto et al.,2013,Circulation 127:891-904)。這樣的效應也在具有ABCA1突變的患者中觀察到了(Attie et al.,2001,J Lipid Res 42:1717-26)。如通過乙酰膽堿的動脈內(nèi)輸注，和分別通過肱動脈的體積描記法或高分辨率超聲和血流介導的血管擴張測量前臂血流量所觀察到的，重構(gòu)的HDL顆粒(ApoA-I/磷脂酰膽堿以1:150的摩爾比)的輸注改善了受損的內(nèi)皮功能(Spieker et al.,2002,Circulation 105:1399-402)。在隨機雙盲安慰劑對照試驗(DAL-VESSEL)中，在具有冠狀動脈心臟病(CHD)或者處于CHD的風險的患者中，CETP抑制劑(Dalcetrapib)減少CETP活性并增加HDL-C水平，而不影響NO依賴血管內(nèi)皮功能，血壓，或炎癥和氧化應激的標志物(Lüscher et al.,2012,European heart journal 33:857-65)。一個假設，不像來自健康受試者的HDL，來自具有糖尿病，CAD,ACS或慢性腎功能不全的患者的HDL在血管效應中是功能失調(diào)，因為它們不再刺激來自培養(yǎng)中的內(nèi)皮細胞的NO釋放(Besler et al.,2011,The Journal of clinical investigation 121:2693-708；Sorrentino et al.,2010,Circulation 121:110-22；Speer et al.,2013,Immunity 1-15)。

然而考慮到產(chǎn)物的低的總產(chǎn)率以及在重組表達的蛋白培養(yǎng)中出現(xiàn)的蛋白降解，ApoA-I、ApoA-I_M、ApoA-I_P和其它變體以及重組的HDL目前受到大量的治療性給藥所需的載脂蛋白以及蛋白生產(chǎn)成本的限制(參見，例如Mallory et al.,1987,J.Biol.Chem.262(9):4241-4247；Schmidt et al.,1997,Protein Expression&Purification 10:226-236)。早期臨床試驗已經(jīng)表明用于治療心血管疾病的每次輸注所給予的蛋白劑量范圍為1.5-4g。完全治療所需的輸注次數(shù)是未知的(參見，例如Eriksson et al.,1999,Circulation 100(6):594-98；Carlson,1995,Nutr.Metab.Cardiovasc.Dis.5:85-91；Nanjee et al.,2000,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.20(9):2148-55；Nanjee et al.,1999,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19(4):979-89；Nanjee et al.,1996,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16(9):1203-14)。

重組人ApoA-I已經(jīng)在異源性宿主中表達，然而成熟蛋白的產(chǎn)率不足以用于大規(guī)模治療應用，特別是當與進一步降低產(chǎn)率且產(chǎn)生不純產(chǎn)物的純化方法結(jié)合時。

Weinberg et al.,1988,J.Lipid Research 29:819-824描述通過反相高效液相色譜由人血漿純化的載脂蛋白A-I、A-II和A-IV以及它們的亞型的分離。

WO 2009/025754描述α-1-抗胰蛋白酶和ApoA-I由人血漿的蛋白分離和純化。

Hunter et al.,2009,Biotechnol.Prog.25(2):446-453描述大腸桿菌中進行重組表達的ApoA-I Milano突變體的大規(guī)模純化。

Caparon et al.,2009,Biotechnol.And Bioeng.105(2):239-249描述ApoA-I Milano由大腸桿菌宿主的表達和純化，所述大腸桿菌宿主經(jīng)遺傳性工程化以刪除兩個宿主細胞蛋白以降低這些蛋白在純化的載脂蛋白產(chǎn)物中的水平。

美國專利6,090,921描述使用陰離子交換色譜法將ApoA-I或者載脂蛋白E(ApoE)由含有ApoA-I和ApoE的人血漿成分純化。

Brewer et al.,1986,Meth.Enzymol.128:223-246描述使用色譜技術(shù)進行載脂蛋白由人血液的分離和表征。

Weisweiler et al.,1987,Clinica Chimica Acta 169:249-254描述使用快速-蛋白液相色譜法進行ApoA-I和ApoA-II由人HDL的分離。

deSilva et al.,1990,J.Biol.Chem.265(24):14292-14297描述通過免疫親和色譜法和反相高效液相色譜法進行載脂蛋白J的純化。

目前正在開發(fā)脂蛋白和脂蛋白復合物用于臨床應用，其中臨床研究使用不同的基于脂蛋白的試劑，其確立了脂蛋白療法的可行性(Tardif,2010,Journal of Clinical Lipidology 4:399–404)。一個研究評價了自體同源的去脂的HDL(Waksman et al.,2010,J Am.Coll.Cardiol.55:2727-2735)。另外的研究評價了ETC-216，其為重組ApoA-I_M和棕櫚?；?油?；?PC(POPC)的復合物(Nissen et al.,2003,JAMA 290:2292-2300)。CSL-111為由與大豆磷脂酰膽堿(SBPC)絡合的血漿純化的重建的人ApoA-I(Tardif et al.,2007,JAMA 297:1675-1682)。目前的探索藥物已經(jīng)顯示出降低動脈粥樣硬化斑塊的效能，但是該作用伴隨有次級效應，諸如轉(zhuǎn)氨酶增加以及ApoA-I抗體的形成(Nanjee et al.,1999,Arterioscler.Vasc.Throm.Biol.19:979-89；Nissen et al.,2003,JAMA290:2292-2300；Spieker et al.,2002,Circulation 105:1399-1402；Nieuwdorp et al.,2004,Diabetologia 51:1081-4；Drew et al.,2009,Circulation 119,2103-11；Shaw et al.,2008,Circ.Res.103:1084-91；Tardiff et al.,2007,JAMA 297:1675-1682；Waksman,2008,Circulation 118:S 371；Cho,美國專利7,273,849 B2,2007年9月25日出版)。例如，ERASE臨床試驗(Tardiff et al.,2007,JAMA 297:1675-1682)采用兩個劑量的CSL-111：40mg/kg和80mg/kg的ApoA-I。80mg/kg劑量組由于肝毒性(已知為嚴重的轉(zhuǎn)氨酶升高)而需要終止。甚至在40mg/kg劑量組中，若干患者經(jīng)歷了轉(zhuǎn)氨酶升高。毒性很有可能歸因于剩余膽鹽的存在，其是用于制造重構(gòu)的HDL的去垢劑(由Wright等人的US 2013/0190226中所強調(diào)的)。

因此，存在以下需要：對于更有效地降低血清膽固醇、增加HDL血清水平、預防和/或者治療血脂異常和/或者與血脂異常相關的疾病、病癥和/或者障礙，同時最小化副作用，如肝毒性其增加甘油三酯、LDL-甘油三酯或者VLDL-甘油三酯的膽固醇降低藥物的給藥日程表的需要，以及用于鑒定此種給藥日程表和監(jiān)測接受此種治療的受試者的方法的需要。

4.發(fā)明概述

在這個個體化用藥的時代，藥物基因組學與藥學和基因組學的結(jié)合促進了所謂的“伴隨診斷”的使用和審問，這是預期用于結(jié)合治療性產(chǎn)品，以更好地告知治療選擇，起始，劑量定制，或避免的問題的診斷產(chǎn)品。本公開部分地涉及發(fā)現(xiàn)響應于用HDL治療劑進行的受試者的治療(如以下第6.1節(jié)中定義)的倒U形的劑量-效應曲線，所述療法特別是HDL模擬物，去脂或脂質(zhì)差的HDLs，或施用后通過下調(diào)膽固醇流出和逆脂質(zhì)轉(zhuǎn)運的組分，如ABCA1和ABCG1轉(zhuǎn)運體和SREBP1(調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成的轉(zhuǎn)錄因子)的作用機制提高HDL水平的其它化合物。這種作用機制的發(fā)現(xiàn)允許設計用于監(jiān)測用HDL治療劑治療的伴隨診斷測定和/或鑒定HDL治療劑針對特定受試者或亞組或其他組的受試者的有效劑量。因此，本發(fā)明涉及，其中可以與接受用HDL治療劑治療的受試者共同使用的HDL標志物伴隨診斷測定。在一些實施方案中，本公開涉及用于確定接受用HDL治療劑治療的受試者是否正在接收治療有效量或最佳劑量的方法。在一些實施方案中，本公開涉及的方法用于確定接受用HDL治療劑治療的受試者是否正在接收治療有效量或最佳劑量，同時優(yōu)化了所述治療的安全性。

如本文所述的方法可以在其中所述受試者正在用HDL治療劑治療某一狀況下使用(如以下第6.1節(jié)中定義)，或用于鑒定或優(yōu)化針對HDL治療的給藥日程表以治療患此狀況的受試者。

本文還提供了預測受試者對用HDL治療劑治療的響應的可能性的方法。

在某些方面，本公開涉及治療患有用HDL治療劑治療的狀況的受試者，鑒定用于治療狀況的HDL治療劑的合適的劑量，使患此狀況的受試者中的膽固醇流通，或監(jiān)測在受試者中HDL治療劑的療效。所述方法通常包括(例如按照給藥日程表的一次或多次)對受試者施用HDL治療劑和監(jiān)測在來自個體的測試樣品中至少一種HDL標志物基因表達的變化，在一些實施方案中兩種或三種或更多種HDL標志物。任何變化可以是與受試者的自身基線，受試者之前的測量值和/或從個體的群體的一種或多種HDL標志物獲得的對照比較得到的。個體的群體可以是任何合適的群體，例如，健康的個體，患狀況的個體，遺傳上匹配的個體等。在測量后，如果HDL治療劑下調(diào)膽固醇流出途徑的組分達到了使治療功效衰減的程度，那么劑量，給藥頻率(dosing frequency)或兩者可進行調(diào)整。在一些實施方案中，確定了不改變或甚至增加在受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的一種或多種HDL標志物的表達水平的劑量。

在一些實施方案中，該方法包括以下步驟：(a)從受試者或受試者群體獲得第一測試樣品；(b)測量測試樣品中的一種或多種HDL標志物的表達水平(如以下第6.1節(jié)中所定義)；(c)施用HDL治療劑的劑量(或一系列劑量)至受試者或受試者群體；(d)獲得來自受試者或受試者群體的第二測試樣品；和(e)測量第二測試樣品中的一種或多種HDL標志物的表達水平。在一些實施方案中，第一樣品在用HDL治療劑治療之前獲得。在其他實施方案中，受試者或受試者群體用不同于步驟(c)的劑量的一個劑量的HDL治療劑治療后獲得第一樣品。

在其他實施方案中，該方法包括以下步驟：(a)施用一劑的HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)從受試者或受試者群體獲得測試樣品；和(c)測量測試樣品中的一種或多種HDL標志物的表達水平，以確定表達水平是高于還是低于截留量(cutoff amount)。任選地，針對一個或多個額外劑量的HDL治療劑重復步驟(a)至(c)，直到確定了合適的劑量。額外劑量可包括更高/更低量的HDL治療劑，更高/更低給藥頻率，或更多/更少的輸注次數(shù)。

測試樣品優(yōu)選是外周血單核細胞或循環(huán)單核細胞或巨噬細胞的樣品。它也可以是淋巴單核細胞或循環(huán)單核細胞或巨噬細胞的樣品。樣品可以獲自，例如，未經(jīng)處理的受試者或受試者群體，或施用HDL治療劑后，例如施用2，4，6，8，10，12，16，20或24小時后的受試者或受試者群體。在不同的實施方案中，在施用后2-10，2-12，4-6，4-8，4-24，4-16，6-8或6-10小時獲得樣品。受試者可以用作為單一療法的HDL治療劑治療或作為聯(lián)合治療方案中的一個部分的HDL治療劑治療，所述聯(lián)合治療例如，與一個或多個控制脂質(zhì)的藥物如阿托伐他汀，依澤替米貝，煙酸，羅舒伐他汀，辛伐他汀，阿司匹林，氟伐他汀，洛伐他汀和普伐他汀聯(lián)合。在一些實施方案中，確定合適的劑量是在健康個體中進行的，并且在其他實施方案中它是在具有狀況的個體群體中進行。在多種實施方案中，合適的劑量是，與受試者的基線量和/或群體的平均值相比，使一種或多種HDL標志物的表達水平降低20％-80％，30％-70％，40％-60％，或50％的劑量。在其他實施方案中，合適的劑量是與受試者的基線量和/或群體的平均值相比，使一種或多種HDL標志物的表達水平降低不超過50％的劑量，并且在一些實施方案中降低不超過40％，不超過30％，不超過20％，或不超過10％的劑量。在其它實施方案中，劑量是與受試者的基線量和/或群體的平均值相比，不會使一種或多種HDL標志物的表達水平降低的劑量。

在另一個實施方案中，本文提供了用于本公開的伴隨診斷測定中試劑盒。在一些實施方案中，所述試劑盒包括(a)至少一種HDL治療劑和(b)至少一種診斷試劑，其用于定量HDL標志物的表達(例如，在核酸測定法的情況下，用于檢測HDL標志物的引物和/或探針，和在蛋白質(zhì)測定法的情況下，至少一種抗HDL標志物抗體(多克隆或單克隆))。在另一個實施方案中，HDL標志物是在用于從生物樣品(例如血液或淋巴)分離細胞的細胞分選儀或FACS儀器的幫助下確定的。

另外本文提供了用HDL治療劑治療患家族性高α脂蛋白血癥，例如，ABCA1缺陷的受試者的方法。優(yōu)選地，治療分為兩個階段，最初的，更加激烈的“誘導”階段，隨后，較不強烈的“維護”階段。任選地，該治療是根據(jù)使用本文描述的方法鑒定的給藥日程表給出的。

本文還提供用HDL治療劑治療患LCAT缺失(純合子或雜合子)的受試者的方法，任選地使用使用本文描述的方法鑒定的本文描述的方法鑒定的給藥日程表。

本文還提供用HDL治療劑治療患ApoA-I缺失(純合子或雜合子)的受試者的方法，任選地使用使用本文描述的方法鑒定的本文描述的方法鑒定的給藥日程表。

本文還提供用HDL治療劑治療患低HDL水平(純合子或雜合子)的受試者的方法(男性40mg/dl以下的HDL-chol或以下，女性50mg mg/dl以下的HDL-chol)用HDL治療劑治療的受試者，任選地使用本文描述的方法鑒定的給藥日程表。。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定有效地使受試者中的膽固醇流通的HDL治療劑劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的第一劑量至受試者，(b)在施用所述第一劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應；和(c)(i)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低超過截留量，施用所述HDL治療劑的第二劑量，其中所述HDL治療劑的第二劑量低于第一劑量；或(ii)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低未超過截留量，用所述HDL治療劑的第一劑量治療受試者。

在某些實施方案中，本公開提供了用于監(jiān)測HDL治療劑在受試者中的功效的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)根據(jù)第一給藥日程表用HDL治療劑治療受試者，(b)測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一給藥日程表對所述表達水平的效應；及(c)(i)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低超過上截留量(upper cutoff amount)，根據(jù)第二給藥日程表用HDL治療劑治療受試者，其中所述第二給藥日程表包含以下的一個或多個：施用HDL治療劑的較低劑量，在一段較長的時間中將HDL治療劑輸注到受試者中，并且不太頻繁地施用HDL治療劑至受試者；(ii)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低未超過下截留量(lower cutoff amount)，根據(jù)第二給藥日程表用HDL治療劑治療受試者，其中所述第二給藥日程表包含以下的一個或多個：施用HDL治療劑的較高劑量，在一段較短的時間中將HDL治療劑輸注到受試者中，并且較頻繁地施用HDL治療劑至受試者；或(iii)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低的量在上截留量和下截留量之間，根據(jù)第一給藥日程表持續(xù)治療受試者。

截留量可以是相對于在所述施用之前受試者的自身基線，或截留量可以是相對于對照量，如來自例如，健康受試者或具有與受試者相同疾病狀況的群體或與受試者共享一個或多個疾病風險基因的群體的群體平均值。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定能有效地使膽固醇流通的劑量HDL治療劑的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的第一劑量至受試者群體，(b)在施用所述第一劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應；(c)施用所述HDL治療劑的第二劑量，其中所述HDL治療劑的第二劑量高于或低于第一劑量；(d)在施用所述第二個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應；(e)針對所述HDL治療劑的一個或多個額外劑量任選地重復步驟(c)和(d)；和(f)鑒定受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低不會超過截留量的最高劑量，從而鑒定能有效地使膽固醇流通的劑量HDL治療劑。

在一些實施方案中，在施用所述第二個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平，以評估所述第二劑量對所述表達水平的效應。如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低超過截留量，施用所述HDL治療劑的第三劑量，其中所述HDL治療劑的第三劑量低于第二劑量

在某些實施方案中，本公開提供了用于治療需要HDL治療劑的受試者的方法。在一些實施方案中，該方法包括施用至受試者以下的組合：(a)與受試者的基線量相比，使一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平的降低不超過20％或10％的劑量的脂蛋白復合物；和(b)膽固醇降低療法，任選地選自膽汁酸樹脂，煙酸，他汀類，貝特類，PCSK9抑制劑，依澤替米貝，和CETP抑制劑。

在某些實施方案中，本公開提供了用于治療需要HDL治療劑的受試者的方法。在一些實施方案中，該方法包括施用至受試者以下的組合：(a)與對照量相比，使一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平的降低不超過20％或10％的劑量的脂蛋白復合物；和(b)膽固醇降低療法，任選地選自膽汁酸樹脂，煙酸，他汀類，貝特類，PCSK9抑制劑，依澤替米貝，和CETP抑制劑。

對照量可以是群體平均值，如來自例如，健康受試者或具有與受試者相同疾病狀況的群體或與受試者共享一個或多個疾病風險基因的群體的群體平均值。受試者可以是人或受試者群體是人類受試者群體。受試者可以是非人動物，例如，小鼠，或受試者群體可以是非人動物的群體。

在本文中所描述的方法的某些實施方案中，至少一種HDL標志物是ABCA1。例如，對ABCA1 mRNA的表達水平或ABCA1蛋白表達水平進行了測量。在多種的實施方案中，ABCA1截留量為10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或80％，或選自前述截留量中的任意兩個所限定的任何量，例如20％-80％，30％-70％，40％-60％，10％-50％，10％-40％，20％-50％，等等。ABCA1表達水平可以在施用2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時后進行測量。

在本文中所描述的方法的某些實施方案中，至少一種HDL標志物是ABCG1。例如，對ABCG1 mRNA的表達水平或ABCG1蛋白表達水平進行了測量。在多種的實施方案中，ABCG1截留量為10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或80％，或選自前述截留量中的任意兩個所限定的任何量，例如20％-80％，30％-70％，40％-60％，10％-50％，10％-40％，20％-50％，等等。ABCG1表達水平可以在施用2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時后進行測量。

在本文中所描述的方法的某些實施方案中，至少一種HDL標志物是SREBP-1。例如，對SREBP-1 mRNA的表達水平或SREBP-1蛋白表達水平進行了測量。在多種的實施方案中，SREBP-1截留量為10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或80％，或選自前述截留量中的任意兩個所限定的任何量，例如20％-80％，30％-70％，40％-60％，10％-50％，10％-40％，20％-50％，等等。SREBP-1表達水平可以在施用2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時后進行測量。

在某些實施方案中，HDL治療劑是脂蛋白復合物。脂蛋白復合物可以包括載脂蛋白例如ApoA-I,ApoA-II,ApoA-IV,ApoE或它們的組合。脂蛋白復合物可以包括載脂蛋白的肽模擬物諸如如ApoA-I,ApoA-II,ApoA-IV,ApoE肽模擬物或其組合。脂蛋白復合物可以是CER-001，CSL-111，CSL-112，CER-522，或ETC-216。

在某些實施方案中，HDL治療劑是一種小分子，例如CETP抑制劑或泛酸衍生物。

在某些實施方案中，本文描述的方法進一步包括確定截留量。例如，所述截留量可以通過產(chǎn)生針對HDL治療劑的劑量反應曲線來確定。截留量可以是在劑量反應曲線的拐點的HDL標志物的表達水平的25％，40％，50％，60％，或75％。在具體的實施方案中，截留量選自前述截留量中的任何兩個限定的范圍，例如，在劑量反應曲線的拐點的HDL標志物的表達水平的30％-70％，40％-60％，25％-50％，25％-75％。

在某些實施方案中，受試者或受試者群體具有ABCA1缺陷。受試者或受試者群體可以是純合的ABCA1突變。受試者或受試者群體可以是雜合的ABCA1突變。

在其他實施方案中，受試者或受試者群體具有HDL缺陷(HDL deficiency)，低α-脂蛋白血癥或原發(fā)性家族性低α-脂蛋白血癥。

在其他實施方案中，受試者或受試者群體具有LCAT缺失或魚眼病。受試者或受試者群體可以是純合的LCAT突變。受試者或受試者群體可以是雜合的LCAT突變。

在其他實施方案中，受試者或受試者群體具有ABCG1缺失。受試者或受試者群體可以是純合的ABCG1突變。受試者或受試者群體可以是雜合的ABCG1突變。

在其他實施方案中，受試者或受試者群體具有ApoA-I缺失。受試者或受試者群體可以是純合的ApoA-I突變。受試者或受試者群體可以是雜合的ApoA-I突變。

在其他實施方案中，受試者或受試者群體具有ABCG8缺失。受試者或受試者群體可以是純合的ABCG8突變。受試者或受試者群體可以是雜合的ABCG8突變。

在其他實施方案中，受試者或受試者群體具有PLTP缺失。受試者或受試者群體可以是純合的PLTP突變。受試者或受試者群體可以是雜合的PLTP突變。

患者可以具有在前述一個或多個基因中的遺傳缺陷，即，具有混合的遺傳缺陷。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者，(b)在每個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平；和(c)鑒定不會使所述一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過0％，超過10％或超過20％的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者，(b)在每個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平；和(c)鑒定維持一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的基線表達水平或甚至增加該表達水平的劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。水平可以增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或在由上述值中的任意兩個限定的范圍中，例如，該水平可提高多達10％，多達20％，多達50％，10％-50％，20％-60％等。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者群體，(b)在每個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平；和(c)鑒定不會使所述一種或多種HDL標志物的表達水平在所述受試者中增加超過0％，超過10％或超過20％的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者群體，(b)在每個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平；和(c)鑒定維持一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的基線表達水平或甚至增加該表達水平的劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。水平可以增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或在由上述值中的任意兩個限定的范圍中，例如，該水平可提高多達10％，多達20％，多達50％，10％-50％，20％-60％等。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：鑒定不會使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最高劑量。鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法，可包括：(a)施用一個或多個劑量的HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定不會使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的給藥間隔的方法。在一些實施方案中，該方法包括：鑒定不會使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最頻繁的給藥日程表的最高劑量。鑒定適合于療法的HDL治療劑的給藥間隔的方法，可包括：(a)根據(jù)一個或多個給藥頻率施用HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定不會使所述受試者中的膽固醇流出降低超過50％至100％的最大給藥頻率，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

在某些實施方案中，一個或多個給藥頻率包括選自以下的一個或多個給藥頻率：(1)每2天以1-4小時輸注施用；(b)每3天以1-4小時輸注施用；(c)每周日以24小時輸注施用；和(d)每兩周以24小時輸注施用。

膽固醇流出可在受試者或受試者群體單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中測量。

在某些實施方案中，本公開提供了用于治療具有ABCA1缺陷的受試者的方法。在一些實施方案中，該方法包括對受試者施用治療有效量的HDL治療劑如CER-001。受試者可以是雜合或純合的ABCA1突變。

在某些實施方案中，本公開包括治療患家族原發(fā)性低α-脂蛋白血癥的受試者的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)根據(jù)誘導方案對受試者施用HDL治療劑；和，隨后(b)根據(jù)維持方案對受試者施用HDL治療劑。維持方案可意味著以較低劑量，較低頻率或兩者一起來施用HDL治療劑。受試者可以是雜合或純合的ABCA1突變。受試者可以是純合或雜合的LCAT突變。受試者可以是純合的或雜合的ApoA-I突變。受試者可以是純合或雜合的ABCG1突變。受試者也可以用脂質(zhì)控制藥物如阿托伐他汀，依澤替米貝，煙酸，羅舒伐他汀，辛伐他汀，阿司匹林，氟伐他汀，洛伐他汀，普伐他汀或它們的組合來治療。

HDL治療劑可以是CER-001和/或誘導方案可以是4周的持續(xù)時間。誘導方案可包括每周施用HDL治療劑兩次，三次或四次。其中HDL治療劑是脂蛋白復合物如CER-001，在誘導方案中施用劑量可以選自8-15mg/kg被選擇(基于蛋白質(zhì)重量)。在特別的實施方案中，誘導劑量是8mg/kg，12mg/kg或15mg/kg。維持方案可包括施用HDL治療劑至少一個月，至少兩個月，至少三個月，至少六個月，至少一年，至少18個月，至少兩年，或無限期。維持方案可包括每周施用HDL治療劑一次或兩次。其中HDL治療劑是脂蛋白復合物如CER-001，在維持方案中施用的劑量可以選自1-6mg/kg被選擇(基于蛋白質(zhì)重量)。在特別的實施方案中，維持劑量是1mg/kg，3mg/kg或6mg/kg。

在某些實施方案中，(a)誘導方案利用與受試者的基線量和/或群體平均值相比，使一種或多種HDL標志物的表達水平降低20％-80％或40％-60％的劑量；和/或(b)其中維持方案利用與受試者的基線量和/或群體平均值相比，使一種或多種HDL標志物的表達水平降低不超過20％或不超過10％的劑量。

應當指出的是，除非上下文另有明確說明，在本申請中使用的不定冠詞“一”和“一個”和定冠詞“該”，如在專利申請中常見的意味著一個或多個。此外，在本申請中使用的術(shù)語“或”，如在專利申請中是常見的，意味著分開的“或”或結(jié)合的“和。“

本公開的特征和優(yōu)點從以下實施方案的詳細描述中將變得更加明顯。

5，附圖簡述

圖1描述卡方(CHI SQUARE)研究設計；

圖2A-2C描述在施用CER-001的第一次和第六次輸注后ApoA-1，磷脂和總血漿濃度；

圖3描述MHICC和SAHMRI之間的幀(frame)分布；

圖4描述在TAV和PAV的LS平均改變-mITT群體；

圖5描述在TAV和PAV的LS平均改變-mPP群體；

圖6A-6B描述CER-001的倒U形劑量-效應曲線。

圖7描述CER-001、HDL₃或ApoA-I對J774巨噬細胞中ABCA1表達的效應；

圖8描述CER-001、HDL₃或ApoA-I對J774巨噬細胞中ABCG1表達的效應；

圖9描述CER-001、HDL₃或ApoA-I對J774巨噬細胞中SR-BI表達的效應；

圖10描述CER-001、HDL₃或ApoA-I對J774巨噬細胞中SREBP-1表達的效應；

圖11描述CER-001、HDL₃或ApoA-I對J774巨噬細胞中SREBP-2表達的效應；

圖12描述CER-001、HDL3或ApoA-I對J774巨噬細胞中LXR表達的效應；

圖13描述用CER-001、HDL₃或ApoA-I劑量(μg/mL)處理的774巨噬細胞中ABCG1的表達

圖14描述用CER-001、HDL₃或ApoA-I劑量(μg/mL)處理的J774巨噬細胞中ABCG1的表達；

圖15描述用CER-001、HDL₃或ApoA-I劑量(μg/mL)處理的J774巨噬細胞中SREBP-1的表達；

圖16描述用CER-001、HDL₃或ApoA-I劑量(μg/mL)處理的J774巨噬細胞中SR-BI的表達；

圖17描述用CER-001、HDL₃或ApoA-I處理J774巨噬細胞中隨著時間下降的ABCA1 mRNA水平；

圖18描述在存在和不存在cAMP的情況下，J774巨噬細胞中ABCA1mRNA水平；

圖19描述在存在和不存在cAMP的情況下，J774巨噬細胞中ABCG1mRNA水平；

圖20描述CER-001和HDL₃對J774巨噬細胞中ABCA1蛋白質(zhì)水平的影響；

圖21描述CER-001和HDL₃對J774巨噬細胞中ABCA1蛋白質(zhì)水平的影響；

圖22描述在增加的CER-001的濃度的存在下，cAMP對J774巨噬細胞中ABCA1 mRNA水平的調(diào)節(jié)的設置為0的作用；

圖23描述在增加濃度的CER-001的存在下，cAMP對J774巨噬細胞中ABCA1 mRNA水平的調(diào)節(jié)的設置為0的作用；

圖24描述在增加濃度的CER-001的存在下，cAMP對J774巨噬細胞中ABCG1 mRNA水平的調(diào)節(jié)；

圖25描述在增加濃度的CER-001的存在下，cAMP對J774巨噬細胞中ABCG1 mRNA水平的調(diào)節(jié)的設置為0的作用；

圖26描述在增加濃度的CER-001的存在下，cAMP對J774巨噬細胞中ABCA1 mRNA水平調(diào)節(jié)的影響；

圖27描述用CER-001、HDL₃和ApoA-I處理之后，返回到ABCA1的基線量所必需的時間；

圖28描述用CER-001、HDL₃和ApoA-I處理之后，返回到ABCG1的基線量所必需的時間；

圖29描述用CER-001、HDL₃和ApoA-I處理之后，返回到SR-BI的基線量所必需的時間；

圖30描述CER-001、HDL₃和ApoA-I對HepG2肝細胞中ABCA1水平的影響。

圖31描述CER-001、HDL₃和ApoA-I對HepG2肝細胞中SR-BI水平的影響。

圖32描述CER-001、HDL₃和ApoA-I對Hepa 1.6肝細胞中ABCA1水平的影響。

圖33描述CER-001、HDL₃和ApoA-I對Hepa 1.6肝細胞中SR-BI水平的影響。

圖34描述在通過CER-001和HDL₃下調(diào)ABCA1后添加ApoA-1的影響；

圖35描述在通過CER-001和HDL₃下調(diào)ABCG1后添加ApoA-1的影響；

圖36描述在通過CER-001和HDL₃下調(diào)SR-BI后添加ApoA-1的影響；

圖37描述HDL₂對巨噬細胞J774中ABCA1 mRNA水平的影響；

圖38描述HDL₂對巨噬細胞J774中ABCG1 mRNA水平的影響；

圖39描述HDL₂對巨噬細胞J774中SR-BI mRNA水平的影響；

圖40描述β環(huán)糊精對膽固醇流出的效應；

圖41描述在β環(huán)糊精的存在下，在J774巨噬細胞中ABCA1 mRNA水平的劑量依賴性降低；

圖42描述在β環(huán)糊精的存在下，在J774巨噬細胞中ABCG1 mRNA水平的劑量依賴性降低；

圖44描述在β環(huán)糊精的存在下，在J774巨噬細胞中SR-BI mRNA水平的劑量依賴性降低；

圖44描述β環(huán)糊精對J774巨噬細胞中的LXR mRNA水平的影響；

圖45描述β環(huán)糊精對J774巨噬細胞中的SREBP1 mRNA水平的影響；

圖46描述β環(huán)糊精對J774巨噬細胞中的SREBP2 mRNA水平的影響；

圖47描述用CER-001和HDL₃處理的小鼠的結(jié)扎的頸動脈中未酯化膽固醇含量；

圖48描述用CER-001和HDL₃處理的小鼠的結(jié)扎的頸動脈中總膽固醇含量；

圖49描述CER-001輸液后血漿總膽固醇水平；

圖50描述HDL₃輸注后的血漿總膽固醇水平；

圖51描述CER-001輸注后血漿未酯化膽固醇水平；

圖52描述HDL₃輸注后血漿未酯化膽固醇水平；

圖53描述針對CER-001和HDL₃的劑量后(post-dose)血漿總膽固醇水平；

圖54描述針對CER-001和HDL₃的劑量后(post-dose)血漿未酯化膽固醇水平；

圖55描述在給藥CER-001后血漿ApoA-I的水平；

圖56描述在給藥HDL₃后血漿ApoA-I的水平；

圖57描述在結(jié)扎的頸動脈中ABCA1表達的western印跡檢測；

圖58描述在CER-001的最后一次注射后24小時肝臟ABCA1水平；

圖59描述在CER-001的最后一次注射后24小時肝臟中的SR-BI水平；

圖60描述用CER-001和HDL₃注射的小鼠糞便中測量的膽固醇含量；

圖61描述HDL顆粒形成的概況；

圖62描述逆脂質(zhì)運輸(RLT)途徑的概述；

圖63描述HDL成熟步驟的概述；

圖64描述人類ApoA-I的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)；

圖65A1-65A3和圖65B分別描述人類ABCA1的核苷酸和多肽序列(分別是SEQ ID NO：2和3)；

圖66A1-66A2和圖66B分別描述人類ABCG1的核苷酸和多肽序列(分別是SEQ ID NO：4和5)；

圖67A1-67A2和圖67B分別描述人類SREBP1的核苷酸和多肽序列(分別是SEQ ID NO：6和7)。

圖68A-68G描述在SAMBA臨床試驗的受試者中膽固醇酯化的時間過程；

圖69A-69G描述在SAMBA臨床試驗的受試者中通過LCAT酯化裝載的膽固醇；

圖70描述在SAMBA臨床試驗一個月后在單個受試者中頸動脈血管壁的厚度變化；

圖71描述在SAMBA臨床試驗一個月后在單個受試者中主動脈血管壁的厚度變化；和

圖72描述在SAMBA受試者中1個月和6個月后平均血管壁的厚度變化。6.發(fā)明詳述

6.1.定義

如本文所用，下列術(shù)語旨在具有下列含義：

一種或多種狀況是指以下的一種，多種或全部：血脂異常(如高脂血癥，高膽固醇血癥，冠狀動脈心臟病，冠狀動脈疾病，血管和血管周圍疾病，和心血管疾病如動脈粥樣硬化)和與血脂異常有關的疾病(如冠狀動脈心臟病，冠狀動脈疾病，急性冠狀動脈綜合征，不穩(wěn)定型心絞痛，心肌梗塞，中風，短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)，內(nèi)皮功能障礙，血栓形成如動脈粥樣硬化性血管疾病，炎性疾病如血管內(nèi)皮炎癥，心血管疾病，高血壓，缺氧誘導的血管生成，內(nèi)皮細胞凋亡，黃斑變性，I型糖尿病，II型糖尿病，局部缺血，再狹窄，血管或血管周圍疾病，異常脂蛋白血癥，高水平的低密度脂蛋白膽固醇，高水平的極低密度脂蛋白膽固醇，低水平的高密度脂蛋白，高水平的脂蛋白Lp(a)膽固醇，高水平的載脂蛋白B，動脈粥樣硬化，例如動脈供血不足引起的間歇性跛行，加速的動脈粥樣硬化，移植動脈粥樣硬化，家族性高膽固醇血癥(FH)，家族性混合型高脂血癥(FCH)，脂蛋白脂肪酶缺失癥，如高甘油三酯血癥，低α-脂蛋白血癥，和高膽固醇血癥)。在一些實施方案中，脂質(zhì)異常病癥與家族原發(fā)性低α-脂蛋白血癥(FPHA)，如Tangier病，ABCA1缺陷，ApoA-I缺失，LCAT缺失或魚眼病相關。

“IUSDEC”是指“倒U形的劑量-效應曲線”。IUSDEC是治療劑的劑量和患者反應之間的非線性關系。增加給定治療的劑量看起來使效應增加至最大值(劑量反應曲線具有正相性斜率的部分)，在此之后(拐點)，效應減少(劑量反應曲線具有負相性斜率的部分)。

“HDL治療劑”是指用于治療高膽固醇血癥或高血脂癥及相關疾病狀況的治療劑。HDL治療劑的實例包括HDL模擬脂蛋白復合物(例如，CER-001，CSL-111，CSL-112，CER-522，ETC-216)和小分子(例如，他汀類類)。

“HDL標志物”是指分子標志物，其表達與響應于用HDL模擬物治療的IUSDEC相關。示例性HDL標志物是ABCA1，ABCG1，ABCG5，ABCG8和SREBP1。HDL標志物可以在mRNA或蛋白質(zhì)水平上進行測定，如按照第6.2節(jié)中所述進行測定。

6.2.伴隨診斷方法

膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(RCT)是蓄積的膽固醇從血管壁運送到肝臟排出，從而防止動脈粥樣硬化的路徑。RCT的主要成分包括受體，如高密度脂蛋白(HDL)和載脂蛋白A-I(ApoA-1)，以及酶如卵磷脂：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)，磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)，肝脂肪酶(HL)和膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)。RCT的關鍵部分是膽固醇流出，其中蓄積的膽固醇從巨噬細胞，例如在血管壁的內(nèi)膜下層，通過ATP結(jié)合膜盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)和G1(ABCG1)或通過其他機制，包括被動擴散，清道夫受體B1(SR-B1)，小窩蛋白(caveolin)和甾醇27羥化酶除去，并通過HDL和ApoA-I收集。然后在HDL中的酯化膽固醇被遞送到肝臟排出。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子1基因(SREBP1)通過調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇生物合成來影響RCT。

本公開部分地基于對用HDL治療劑治療的IUSDEC型響應的發(fā)現(xiàn)。本公開進一步部分地基于HDL治療劑IUSDEC根本的作用機制的發(fā)現(xiàn)，即響應用HDL治療劑治療下調(diào)參與膽固醇流出的蛋白質(zhì)(在本文中稱為HDL標志物)(例如，ABCA1，ABCG1)表達或調(diào)節(jié)RCT途徑(例如，SREBP1)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種蛋白質(zhì)的下調(diào)與響應于用HDL治療劑治療的IUSDEC相關。

本公開部分涉及利用這種現(xiàn)象來診斷，預測和劑量優(yōu)化HDL治療劑以利用在劑量-反應曲線拐點附近的劑量，即，其中劑量-反應關系是最大化的。

本公開部分涉及利用這種現(xiàn)象來診斷，預測和劑量優(yōu)化HDL治療劑以利用在劑量-反應曲線拐點附近的劑量，即，其中劑量-反應關系是優(yōu)化的同時不使用過量的HDL治療劑。

在其它方面，本公開涉及鑒定對介導膽固醇流出，例如，從單核細胞，巨噬細胞或單核細胞流出的HDL標志物的表達和/或功能的影響最小化的治療劑量和給藥日程表。在一些方面中，選擇不會使一種或多種HDL標志物的表達降低超過定義截留點(例如，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或80％的HDL標志物的參考量)劑量。在某些實施方案中，截留量選自前述截留量的任意兩個所限定的參考的任何范圍，例如，20％-80％，30％-70％，40％-60％，10％-50％，10％-40％，20％-50％，等等，可以為20％至80％。參考可以是受試者自身的基線或一些群體的平均值。該群體可以是年齡，性別和/或疾病的風險因子(例如，遺傳或生活方式風險因子)相匹配的群體。群體平均值可以是正常群體或與受試者患相同或相似狀況的群體。特定的HDL標志物和截留點，將取決于特定的HDL治療劑，受試者的狀況，以及受試者可以接受的其他療法。

在一些方面中，特別是在涉及組合療法時，選擇使一種或多種HDL標志物的表達的減少不超過20％的劑量，在一些實施方案中，減少不超過10％，并且在其它實施方案中根本不會降低一種或多種HDL標志物的表達。

如本文所述的HDL標志物可用于優(yōu)化第6.6節(jié)的治療方法中的任一種。在某些實施方案中，本公開提供了鑒定有效地使受試者中的膽固醇流通的一劑HDL治療劑的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的第一劑量至受試者，(b)在施用所述第一劑量后，測量一種或多種HDL標志物在來自所述受試者的測試樣品中，優(yōu)選所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應；和(c)(i)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低超過截留量，施用所述HDL治療劑的第二劑量，其中所述HDL治療劑的第二劑量低于第一劑量；或(ii)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低未超過截留量，用所述HDL治療劑的第一劑量治療受試者。

在某些實施方案中，本公開提供了用于監(jiān)測HDL治療劑在受試者中的功效的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)根據(jù)第一給藥日程表用HDL治療劑治療受試者，(b)測量在來自所述受試者的測試樣品中，優(yōu)選所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一給藥日程表對所述表達水平的效應；及(c)(i)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低超過上截留量(upper cutoff amount)，根據(jù)第二給藥日程表用HDL治療劑治療受試者，其中所述第二給藥日程表包含以下的一個或多個：施用HDL治療劑的較低劑量，在一段較長的時間中將HDL治療劑輸注到受試者中，并且不太頻繁地施用HDL治療劑至受試者；(ii)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低未超過下截留量(lower cutoff amount)，根據(jù)第二給藥日程表用HDL治療劑治療受試者，其中所述第二給藥日程表包含以下的一個或多個：施用HDL治療劑的較高劑量，在一段較短的時間中將HDL治療劑輸注到受試者中，并且較頻繁地施用HDL治療劑至受試者；或(iii)如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低的量在上截留量和下截留量之間，根據(jù)第一給藥日程表持續(xù)治療受試者。

截留量可以是相對于在所述施用之前受試者的自身基線，或截留量可以是相對于對照量，如來自例如，健康受試者或具有與受試者相同疾病狀況的群體的群體平均值。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定能有效地使膽固醇流通的HDL治療劑劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的第一劑量至受試者群體，(b)在施用所述第一劑量后，測量一種或多種HDL標志物在來自所述受試者的測試樣品中，優(yōu)選所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應；(c)施用所述HDL治療劑的第二劑量，其中所述HDL治療劑的第二劑量高于或低于第一劑量；(d)在施用所述第二個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平，以評估所述第二劑量對所述表達水平的效應；(e)針對所述HDL治療劑的一個或多個額外劑量任選地重復步驟(c)和(d)；和(f)鑒定受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低不會超過截留量的最高劑量，從而鑒定能有效地使膽固醇流通的劑量HDL治療劑。

在一些實施方案中，在施用所述第二個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述測試樣品(例如循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞)中的表達水平，以評估所述第二劑量對所述表達水平的效應。如果受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平的降低超過截留量，施用所述HDL治療劑的第三劑量，其中所述HDL治療劑的第三劑量低于第二劑量

在某些實施方案中，本公開提供了用于治療需要HDL治療劑的受試者的方法。在一些實施方案中，該方法包括施用至受試者以下的組合：(a)與受試者的基線量相比，使一種或多種HDL標志物在來自所述受試者的測試樣品(例如，所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞)中的表達水平的降低不超過20％或10％的劑量的脂蛋白復合物；和(b)膽固醇降低療法，任選地選自膽汁酸樹脂，煙酸，他汀類，貝特類，PCSK9抑制劑，依澤替米貝，和CETP抑制劑。

在某些實施方案中，本公開提供了用于治療需要HDL治療劑的受試者的方法。在一些實施方案中，該方法包括施用至受試者以下的組合：(a)與對照量相比，使一種或多種HDL標志物在來自所述受試者的測試樣品(例如，所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞)的表達水平的降低不超過20％或10％的劑量的脂蛋白復合物；和(b)膽固醇降低療法，任選地選自膽汁酸樹脂，煙酸，他汀類，貝特類，PCSK9抑制劑，依澤替米貝，和CETP抑制劑。

對照量可以是群體平均值，如來自例如，健康受試者或具有與受試者相同疾病狀況的群體的群體平均值。受試者可以是人或受試者群體是人類受試者群體。受試者可以是非人動物，例如，小鼠，或受試者群體可以是非人動物的群體。

在本文中所描述的方法的某些實施方案中，至少一種HDL標志物是ABCA1。例如，對ABCA1 mRNA的表達水平或ABCA1蛋白表達水平進行了測量。ABCA1截留量可以為10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或80％，或選自前述截留量中的任意兩個所限定的任何量，例如20％-80％，30％-70％，40％-60％，10％-50％，10％-40％，20％-50％，等等。ABCA1表達水平可以在施用2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時后進行測量。

在本文中所描述的方法的某些實施方案中，至少一種HDL標志物是ABCG1。例如，對ABCG1 mRNA的表達水平或ABCG1蛋白表達水平進行了測量。ABCG1截留量可以為10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或80％，或選自前述截留量中的任意兩個所限定的任何量，例如20％-80％，30％-70％，40％-60％，10％-50％，10％-40％，20％-50％，等等。ABCG1表達水平可以在施用2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時后進行測量。

在本文中所描述的方法的某些實施方案中，至少一種HDL標志物是SREBP-1。例如，對SREBP-1mRNA的表達水平或SREBP-1蛋白表達水平進行了測量。SREBP-1截留量可以為10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或80％，或選自前述截留量中的任意兩個所限定的任何量，例如20％-80％，30％-70％，40％-60％，10％-50％，10％-40％，20％-50％，等等。SREBP-1表達水平可以在施用2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時后進行測量。

在一些實施方案中，鑒定不改變或甚至增加一種或多種HDL標志物在受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞的表達水平的。的水平的劑量。水平可以增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或由上述值中的任意兩個限定的范圍中，例如該水平可增加多達10％，多達20％，多達50％，10％-50％，20％-60％，等等。

在某些實施方案中，HDL治療劑是脂蛋白復合物。脂蛋白復合物可以包括載脂蛋白例如ApoA-I,ApoA-II,ApoA-IV,ApoE或它們的組合。脂蛋白復合物可以包括載脂蛋白的肽模擬物諸如如ApoA-I,ApoA-II,ApoA-IV,ApoE肽模擬物或其組合。脂蛋白復合物可以是CER-001，CSL-111，CSL-112，CER-522，或ETC-216。在其他實施方案中，HDL治療劑是脫脂或脂質(zhì)差脂蛋白。

在某些實施方案中，HDL治療劑是一種小分子，例如CETP抑制劑或泛酸衍生物。

在某些實施方案中，本文描述的方法進一步包括確定截留量。例如，所述截留量可以通過產(chǎn)生針對HDL治療劑的劑量反應曲線來確定。截留量可以是在劑量反應曲線的拐點的HDL標志物的表達水平的25％，40％，50％，60％，或75％。在特定的實施方案中，截留量選自前述截留量中的任何兩個限定的范圍，例如，在劑量反應曲線的拐點的HDL標志物的表達水平的30％-70％，40％-60％，25％-50％，25％-75％等。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者，(b)在每個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平；和(c)鑒定不會使所述一種或多種HDL標志物的表達水平增加超過0％，超過10％或超過20％的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者群體，(b)在每個劑量后，測量一種或多種HDL標志物在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的表達水平；和(c)鑒定不會使所述一種或多種HDL標志物的表達水平在所述受試者中增加超過0％，超過10％或超過20％的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法。在一些實施方案中，該方法包括：鑒定不會使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最高劑量。鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法，可包括：(a)施用一個或多個劑量的HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定不會使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

在某些實施方案中，本公開提供了鑒定適合于療法的HDL治療劑的給藥間隔的方法。在一些實施方案中，該方法包括：鑒定不會使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最頻繁的給藥日程表的最高劑量。鑒定適合于療法的HDL治療劑的給藥間隔的方法，可包括：(a)根據(jù)一個或多個給藥頻率施用HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定不會使所述受試者中的膽固醇流出降低超過50％至100％的最大給藥頻率，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

6.3.HDL療法

本公開的HDL治療劑包括脂蛋白復合物，去脂或脂質(zhì)差脂蛋白，肽，融合蛋白和HDL模擬物。值得注意的是，“脂蛋白”和“載脂蛋白”在本文中可互換使用。

脂蛋白復合物包含蛋白質(zhì)部分(例如載脂蛋白部分)和脂質(zhì)部分(例如磷脂部分)。所述蛋白質(zhì)部分包含一種或者多種當存在于脂蛋白復合物中時能夠動員膽固醇的脂質(zhì)-結(jié)合蛋白，諸如載脂蛋白、肽或者載脂蛋白肽類似物或者模擬物。所述載脂蛋白和載脂蛋白肽的非限制性實例包括ApoA-I,ApoA-II,ApoA-IV,ApoA-V和ApoE，優(yōu)選它們的成熟形式。脂質(zhì)結(jié)合蛋白還可以是前述載脂蛋白的活性多形形式(active polymorphic form)，同種型，變體和突變體，以及截短形式，其中最常見的載脂蛋白是載脂蛋白A-I _Milano(ApoA-I_M)，載脂蛋白A-I_巴黎(ApoA-I_P)的截短形式，和A-I_Zaragoza(ApoA-I_Z)。含有半胱氨酸殘基的載脂蛋白突變體也是已知的，并且也可以使用(參見，例如，美國公開號2003/0181372)。載脂蛋白可以是單體或二聚體的形式，所述二聚體可以是同二聚體或異二聚體。例如，ApoA-I的同二聚體和異源二聚體(在可行的情況)(Duverger et al.,1996,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16(12):1424-29),ApoA-I_M(Franceschini et al.,1985,J.Biol.Chem.260:1632-35),ApoA-I_P(Daum et al.,1999,J.Mol.Med.77:614-22),ApoA-II(Shelness et al.,1985,J.Biol.Chem.260(14):8637-46；Shelness et al.,1984,J.Biol.Chem.259(15):9929-35),ApoA-IV(Duverger et al.,1991,Euro.J.Biochem.201(2):373-83),ApoE(McLean et al.,1983,J.Biol.Chem.258(14):8993-9000)，可以使用ApoJ和ApoH。

載脂蛋白可以包括與促進其分離的元件(比如His標記)或經(jīng)設計用于其他目的其他元件相應的殘基，只要當該載脂蛋白包括在復合物中時能夠保留某些生物活性即可。在一個具體的實施方案中，所述載脂蛋白部分基本上由ApoA-I構(gòu)成，最優(yōu)選地為單一同等型。脂蛋白復合物中的ApoA-I可具有與相應于圖64的ApoA-I脂蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸25-267的蛋白至少90％或者至少95％的序列同一性。任選地，ApoA-I進一步包含在相應于SEQ ID NO:1的全長ApoA-I氨基酸25的位置(以及成熟蛋白的位置1)上的門冬氨酸。優(yōu)選地，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的ApoA-I為經(jīng)恰當工程化的成熟蛋白(即，缺失信號和前肽序列)且為未被氧化、被脫去酰胺和/或者被截短的。

可以使用適合作為載脂蛋白用于此處描述的荷電絡合物及組合物中的、與載脂蛋白相應的肽和肽類似物以及模擬ApoA-I、ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV和Apo-E活性的激動劑。肽和肽模擬物的非限制性實例在以下文獻中公開：美國專利號6,004,925、6,037,323和6,046,166(授予Dasseux等人)；美國專利號5,840,688(授予Tso)；美國公開號2004/0266671、2004/0254120、2003/0171277和2003/0045460(Fogelman的)；以及美國公開號2003/0087819(Bielicki的)和PCT公開號WO2010/093918(Dasseux等人)，通過引用將其全部公開內(nèi)容并入本文。這些肽和肽類似物可以包括L-氨基酸或D-氨基酸或者包括L-氨基酸與D-氨基酸的混合物。所述肽和肽類似物還可以包括一種或多種非肽或酰胺鍵合，比如一種或多種公知的肽/酰胺等排物。可以使用本領域已知的任何肽合成技術(shù)來合成或制備此類“肽和/或肽模擬物”載脂蛋白，所述肽合成技術(shù)包括，如美國專利號6,004,925、6,037,323和6,046,166中描述的技術(shù)。

脂蛋白可以以脫脂的形式，或在除了蛋白質(zhì)部分還含有脂質(zhì)部分的脂蛋白復合物的形式用于HDL治療劑。所述脂質(zhì)部分通常包含一種或者多種磷脂，所述磷脂可為中性的、荷負電的、荷正電的或者它們的組合。所述磷脂上的脂肪酸鏈在長度上優(yōu)選含有12-26或者16-26個碳且可在飽和程度上為飽和至單不飽和。示例性磷脂包括小烷基鏈磷脂、蛋磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰甘油磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油諸如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、腦磷脂酰絲氨酸、腦鞘磷脂、蛋鞘磷脂、乳鞘磷脂、棕櫚酰鞘磷脂、植物鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、二棕櫚酰磷脂酰甘油鹽、磷脂酸、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、二月桂基磷脂酰膽堿、(1,3)-D-甘露糖基-(1,3)甘油二酯、氨基苯基糖苷、3-膽固醇基-6'-(糖基硫基)己基醚糖脂以及膽固醇及其衍生物。包含SM和棕櫚酰鞘磷脂的磷脂部分可任選地包含少量的任意類型的脂質(zhì)，包括但不限于溶血磷脂質(zhì)、除了棕櫚酰鞘磷脂之外的鞘磷脂、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、甘油酯、甘油三酯以及膽固醇及其衍生物。

在某些而實施方案中，所述脂質(zhì)部分含有至少一種中性磷脂以及任選地一種或者多種負電荷磷脂。在包含中性和負電荷磷脂的脂蛋白復合物中，所述中性和負電荷磷脂可含有具有相同或者不同數(shù)目的碳以及相同或者不同程度的飽和度的脂肪酸鏈。在一些情況下，所述中性和負電荷磷脂將具有相同的?；┒?，例如C16:0，或者棕櫚酰、?；湣Ｔ诰唧w的實施方案中，特別其中將卵SM用作中性脂質(zhì)的實施方案中，載脂蛋白部分：脂質(zhì)部分為的重量比為約1：2.7至約1：3(例如，1：2.7)。

在生理學pH帶有至少部分負電荷的任何磷脂可用作負電荷磷脂。非限制性實例包括荷負電的形式，例如磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸的鹽。在一個具體的實施方案中，所述負電荷磷脂為1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)]或者DPPG、磷脂酰甘油。優(yōu)選的鹽包括鉀鹽和鈉鹽。

在一些實施方案中，HDL治療劑是在美國專利號8206750或WO WO 2012/109162(及其美國的對應物，US 2012/0232005)，其各自的內(nèi)容通過引用全部并入本文。在特定的實施方案中，脂蛋白復合物的蛋白質(zhì)組分是如第6.1節(jié)所描述的，并且優(yōu)選是WO 2012/109162的6.1.1節(jié)中所描述的(和US 2012/0232005)，脂組分是如WO 2012/109162(和US 2012/0232005)的6.2節(jié)所描述的，其可任選地與WO 2012/109162(和US 2012/0232005)中描述的量組合。將這些章節(jié)的每一部分的內(nèi)容通過引用并入本文。在某些方面，脂蛋白復合物中處于至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，或至少99％均質(zhì)的復合物群體中，如WO 2012/109162(和US2012/0232005)第6.4節(jié)中描述的，所述專利的內(nèi)容在此通過引用并入本文。

在一個具體的實施方案中，脂蛋白復合物基本上由2-4 ApoA-I等同物，2分子帶電磷脂，50-80分子卵磷脂和20-50分子SM組成。

在另一個具體的實施方案中，脂蛋白復合物基本上由2-4 ApoA-I等同物，2分子帶電磷脂，50分子卵磷脂和50分子SM組成。

在另一個具體的實施方案中，脂蛋白復合物基本上由2-4 ApoA-I等同物，2分子帶電磷脂，80分子卵磷脂和20分子SM組成。

在另一個具體的實施方案中，脂蛋白復合物基本上由2-4 ApoA-I等同物，2分子帶電磷脂，70分子卵磷脂和30分子SM組成。

在另一個具體的實施方案中，脂蛋白復合物基本上由2-4 ApoA-I等同物，2分子帶電磷脂，60分子卵磷脂和40分子SM組成。

在一個具體的實施方案中，脂蛋白復合物是三元復合物，其中脂質(zhì)組分基本上由約90至99.8wt％SM和約0.2至10wt％的帶負電荷的磷脂組成，例如約0.2-1wt％，0.2-2wt％，0.2-3wt％，0.2-4wt％，0.2-5wt％，0.2-6wt％，0.2-7wt％，0.2-8wt％，0.2-9wt％，或0.2-10wt％的總帶負電荷的磷脂組成。在另一具體實施方案中，脂蛋白復合物是三元復合物，其中脂質(zhì)部分基本上由約90至99.8wt％卵磷脂和約0.2至10wt％的帶負電荷的磷脂，例如約0.2-1wt％，0.2-2wt％，0.2-3wt％，0.2-4wt％，0.2-5wt％，0.2-6wt％，0.2-7wt％，0.2-8wt％，0.2-9wt％或0.2-10wt％的總負電荷的磷脂組成。

在又一具體實施方案中，脂蛋白復合是四元復合物，其中脂質(zhì)部分基本上由約9.8-90wt％的SM，約9.8至90wt％卵磷脂和約0.2-10wt％帶負電荷的磷脂，例如，約0.2-1wt％，0.2-2wt％，0.2-3wt％，0.2-4wt％，0.2-5wt％，0.2-6wt％，0.2-7wt％，0.2-8wt％，0.2-9wt％，以0.2-10wt％的總負電荷的磷脂組成。

在另一具體實施方案中，脂蛋白復合物由33wt％proApoAI，65wt％鞘磷脂和2wt％磷脂酰甘油組成。

在另一具體實施方案中，脂蛋白復合物包含ApoA-I載脂蛋白和脂質(zhì)部分，其中，所述脂質(zhì)部分基本上由鞘磷脂和約3wt％的帶負電荷的磷脂組成，其中，所述脂質(zhì)部分與ApoA-載脂蛋白的摩爾比為約2：1至200：1，并且其中所述脂蛋白復合物是含有2-4 ApoA-I等同物的小型或大型圓盤狀顆粒。

復合物可以包括單種類型的載脂蛋白，或者包括兩種或多種不同的載脂蛋白的混合物，所述兩種或多種不同的載脂蛋白可以源自相同或不同的物種。盡管不需要，但是該荷電的脂蛋白復合物仍優(yōu)選地包括源自受治療動物物種的氨基酸序列的載脂蛋白或與其相應的載脂蛋白，以避免產(chǎn)生對治療免疫應答的誘導作用。因此，對于人類患者的治療，人類來源的脂質(zhì)結(jié)合蛋白優(yōu)選第用于本公開的復合物。載脂蛋白肽模擬物的使用還可以誘導或避免產(chǎn)生免疫應答。

在優(yōu)選的實施方案中，脂質(zhì)組分包括兩種類型的磷脂：鞘磷脂(SM)和帶負電荷的磷脂。SM是“中性”磷脂，原因在于它在生理pH具有約為零的凈電荷。因此，如本文所用，表述“SM”包括源自或獲自天然來源的鞘磷脂，以及與天然形成的SM一樣的、不受LCAT水解影響的天然形成的SM的類似物和衍生物。

事實上，SM可以源自任何來源。例如，SM可以由牛奶、蛋或腦獲得。還可以使用SM類似物或衍生物。有用的SM類似物和衍生物的非限制性實例包括但不限于棕櫚酰鞘磷脂、N-棕櫚酰-4-羥基二氫鞘氨醇-1-磷酸膽堿(一種形式的植物鞘磷脂)、棕櫚酰鞘磷脂、硬脂酰鞘磷脂、D-赤蘚糖-N-16:0-鞘磷脂及其二氫異構(gòu)體、D-赤蘚糖-N-16:0-二氫-鞘磷脂。可使用合成的SM諸如合成的棕櫚酰鞘磷脂或者N-棕櫚酰-4-羥基二氫鞘氨醇-1-磷酸膽堿(植物鞘磷脂)，以產(chǎn)生更均質(zhì)的復合物以及更少的污染物和/或者氧化產(chǎn)物(相比于動物來源的鞘脂)。

可以人工地使由天然來源分離的鞘磷脂富含一種特殊的飽和或不飽和?；?。例如，乳鞘磷脂(Avanti Phospholipid,Alabaster,Ala.)的特征為具有飽和的長?；?即，具有20個或更多個碳原子的?；?。相反，蛋鞘磷脂的特征為具有飽和的短?；?即，具有少于20個碳原子的?；?。例如，雖然只有大約20％的乳鞘磷脂包括C16:0(16個碳,飽和的)?；?，但是卻有約80％的蛋鞘磷脂包括C16:0?；湣？梢酝ㄟ^使用溶劑萃取來使乳鞘磷脂的組成富含與蛋鞘磷脂具可比性的酰基鏈組分，反之亦然。

為使SM具有特定的?；湥淇梢允前牒铣傻?。例如，首先可將乳鞘磷脂從乳品純化，然后可將一種特定的?；溔鏑16:0?；溋呀獠⑻鎿Q為另一?；?。SM也可以完全通過例如大規(guī)模合成來進行合成。參見，例如Dong et al.,美國專利5,220,043,標題為Synthesis of D-erythro-sphingomyelins,issued Jun.15,1993；Weis,1999,Chem.Phys.Lipids 102(1-2):3-12。

可以選擇性地改變構(gòu)成半合成或合成SM的酰基鏈的長度和飽和度。所述酰基鏈可以是飽和或不飽和的，并且可以含有約6至約24個碳原子。每條鏈可以含有相同數(shù)目的碳原子，或者可選地，每條鏈可以含有不同數(shù)目的碳原子。在一些實施方案中，半合成或合成的SM包含混合的酰基鏈，以使其中的一條鏈為飽和的而另一條鏈為不飽和的。在具有這樣混合的?；湹腟M中，該鏈的長度可以相同或不同。在其它實施方案中，半合成或合成SM的?；溈删鶠轱柡突虿伙柡偷?。此外，該鏈可以含有相同或不同數(shù)目的碳原子。在一些實施方案中，構(gòu)成半合成或合成SM的?；準窍嗤?。在一個具體的實施方案中，該鏈與天然形成的脂肪酸的酰基鏈一致，所述天然形成的脂肪酸的例子如肉豆蔻酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、linonenic acid或花生四烯酸。在另外的實施方案中，使用具有飽和或者不飽和官能鏈的SM。在另一個具體的實施方案中，這兩種?；溇鶠轱柡偷牟⑶揖?至24個碳原子。

在優(yōu)選的實施方案中，所述SM為棕櫚酰SM諸如合成的棕櫚酰SM，其具有C16:0?；?，或者其為蛋SM，其包含作為主要成分的棕櫚酰SM。

在一個具體的實施方案中，使用官能化的SM諸如植物鞘磷脂。

所述脂質(zhì)部分優(yōu)選包含負電荷磷脂，即在生理pH條件下具有負的凈電荷的磷脂。所述負電荷磷脂可包含單一類型的負電荷磷脂，或者兩種或者更多種不同的荷負電的磷脂的混合物。在一些實施方案中，所述荷電磷脂為荷負電的甘油磷脂。適當?shù)呢撾姾闪字木唧w實例包括但不限于1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)]、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酸。在一些實施方案中，所述負電荷磷脂包含一種或者多種磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和/或者磷脂酸。在一個具體的實施方案中，所述負電荷磷脂由1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)]或者DPPG構(gòu)成。

與SM一樣，負電荷磷脂可以由天然來源獲得或者通過化學合成制備。如上文與SM相關的討論一樣，在采用合成的負電荷磷脂的實施方案中，可以選擇性地改變?；湹奶匦浴Ｔ诒旧暾埫枋龅暮呻娭鞍讖秃衔锏囊恍嵤┓桨钢?，該負電荷磷脂上的兩種酰基鏈是相同的。在一些實施方案中，SM以及負電荷磷脂上的?；溔肯嗤?。在特定的實施方案中，所述一種或者多種負電荷磷脂和/或SM均具有C16:0或C16:1?；?。在特定的實施方案中，所述SM的脂肪酸部分主要為C16:1棕櫚酰。在一個特定的實施方案中，所述一種或者多種荷電的磷脂和/或SM的酰基鏈與棕櫚酸的酰基鏈一致。

使用的磷脂優(yōu)選為至少95％純的和/或者具有降低水平的氧化劑。由天然來源獲得的脂質(zhì)優(yōu)選具有較少的多不飽和脂肪酸部分和/或者不易于氧化的脂肪酸部分。樣品的氧化水平可使用碘量法來確定，其提供了過氧化值，表示為每千克樣品的分離的碘的毫當量數(shù)，縮寫為meq O/kg。參見例如Gray,J.I.,Measurement of Lipid Oxidation:A Review,Journal of the American Oil Chemists Society,Vol.55,p.539-545(1978)；Heaton,F.W.and Uri N.,Improved Iodometric Methods for the Determination of Lipid Peroxides,Journal of the Science of food and Agriculture,vol 9.P,781-786(1958)。優(yōu)選地，所述氧化水平或者過氧化物水平是低的，例如小于5meq O/kg、小于4meq O/kg、小于3meq O/kg或者小于2meq O/kg。

包含SM和棕櫚酰鞘磷脂的脂質(zhì)部分可任選地包含少量的額外的脂質(zhì)。實際上，可使用任何類型的脂質(zhì)，包括但不限于溶血磷脂質(zhì)、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷酯、腦苷脂、甘油酯、甘油三酯和膽固醇及其衍生物。

當包括在內(nèi)時，所述任選的脂質(zhì)通常包含小于約15wt％的脂質(zhì)部分，盡管在一些情況下可包含更任選的脂質(zhì)。在一些實施方案中，任選的脂質(zhì)為小于約10wt％、小于約5wt％或者小于約2wt％。在一些實施方案中，所述脂質(zhì)部分不包含任選的脂質(zhì)。

在一個具體的實施方案中，所述磷脂部分含有重量比(SM:負電荷磷脂)范圍為90:10至99:1、更優(yōu)選范圍為95:5至98:2的蛋SM、棕櫚酰SM或者植物鞘磷脂以及DPPG。在一個實施方案中，所述重量比為97:3。

脂蛋白復合物也可用作載體來遞送疏水性、親脂性或者非極性活性劑以用于各種治療或者診斷應用。對于所述應用，所述脂質(zhì)部分可進一步包含一種或者多種疏水性、親脂性或者非極性活性劑，包括但不限于脂肪酸、藥物、核酸、維生素和/或者營養(yǎng)素。適當?shù)氖杷?、親脂性或者非極性活性劑并不限于治療類別，且可為例如鎮(zhèn)痛藥、抗炎劑、驅(qū)蟲藥、抗心律不齊藥、抗菌劑、抗病毒劑、抗凝血劑、抗抑郁藥、抗糖尿病藥、抗癲癇劑、抗真菌劑、抗痛風藥、抗高血壓劑、抗瘧藥、抗偏頭痛藥、抗毒蕈堿劑、抗腫瘤藥、勃起機能障礙改善劑、免疫抑制劑、抗原蟲劑、抗甲狀腺劑、抗焦慮劑、鎮(zhèn)靜藥、安眠藥、神經(jīng)鎮(zhèn)靜藥、β-阻滯劑、心臟收縮藥(cardiac inotropic agents)、皮質(zhì)類固醇(corticosteroids)、利尿劑、抗帕金森綜合征劑、胃腸藥、組胺受體拮抗劑、角質(zhì)層分離劑、脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑、抗心絞痛藥、cox-2抑制劑、白三烯抑制劑、大環(huán)內(nèi)酯類、肌肉松弛藥(muscle relaxants)、營養(yǎng)劑、核酸(例如小干擾RNA)、阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥、蛋白酶抑制劑、性激素類、興奮藥、肌肉松弛藥、抗骨質(zhì)疏松藥(anti-osteoporosis agents)、減肥藥、認知增強藥、抗尿失禁藥、營養(yǎng)油、抗良性前列腺肥大藥、必需脂肪酸、非必需脂肪酸以及它們的混合物。

脂蛋白復合物中脂質(zhì)部分與蛋白部分的摩爾比可以改變，并且除了其它因素之外，該摩爾比取決于構(gòu)成所述蛋白部分的載脂蛋白的特性、構(gòu)成所述脂質(zhì)部分的荷電磷脂的特性和數(shù)量以及荷電脂蛋白復合物的期望尺寸。由于認為載脂蛋白(諸如ApoA-I)的生物活性受構(gòu)成載脂蛋白的兩親性螺旋介導，因此可方便地使用ApoA-I蛋白質(zhì)當量來表示脂質(zhì):載脂蛋白摩爾比的載脂蛋白部分。一般公認ApoA-I含有6-10個兩親性螺旋，并且其取決于用來計算螺旋的方法?？梢訟poA-I當量來表示其它的載脂蛋白，根據(jù)它們含有的兩親性螺旋數(shù)目。例如，可將通常以二硫橋鍵二聚體存在的ApoA-I_M表示為2當量的ApoA-I，原因是每分子ApoA-I_M含有的兩親性螺旋是每分子ApoA-I的兩倍。相反，可將含有一個兩親性螺旋的肽載脂蛋白表示為1/10-1/6當量的ApoA-I，原因是其每分子含有的兩親性螺旋是每分子ApoA-I的1/10-1/6。一般而言，脂蛋白復合物(此處定義為“R_i”)中脂質(zhì):ApoA-I當量的摩爾比范圍為約105:1至110:1。在一些實施方案中，R_i約為108:1。對于磷脂，使用約為650-800的MW可以獲得重量比。

在一些實施方案中，脂質(zhì):ApoA-I等價物的摩爾比(“RSM”)的范圍為約80:1至約110:1，例如約80:1至約100:1。在一個具體的實例中，脂蛋白復合物的RSM可為約82:1。

在優(yōu)選的實施方案中，所述脂蛋白復合物為荷負電的脂蛋白復合物，其包含蛋白部分和脂質(zhì)部分，所述蛋白部分優(yōu)選為成熟的全長ApoA-I，且所述脂質(zhì)部分包含中性磷脂、鞘磷脂(SM)和負電荷磷脂。

在一個具體的實施方案中，所述脂質(zhì)組分含有重量比范圍為90:10至99:1、更優(yōu)選范圍為95:5至98:2例如97:3(SM:負電荷磷脂)的蛋SM、棕櫚酰SM或者植物SM以及DPPG。

在一些具體的實施方案中，ApoA-I蛋白部分與脂質(zhì)部分的比的范圍通常為約1:2.7至約1:3，其中1:2.7是優(yōu)選的。這相應于ApoA-I蛋白與磷脂的摩爾比為約1:90至1:140。在一些實施方案中，所述蛋白與脂質(zhì)的摩爾比為約1:90至約1:120、約1:100至約1:140或者約1:95至約1:125。

在特定的實施方案中，復合物是CER-001,CSL-111,CSL-112,CER-522或ETC-216。

CER-001包含ApoA-I，鞘磷脂(SM)和DPPG，其中脂蛋白重量：總磷脂重量比為1：2.7，SM：DPPG重量比是97:3。優(yōu)選地，SM是蛋SM，盡管可以取代為合成SM或植物SM。在一些實施方案中，復合物是按WO 2012/109162的實施例4中描述的方法制備。

CSL-111是從血漿純化的與大豆磷脂酰膽堿(SBPC)絡合的重組人載脂蛋白ApoA-I(Tardif et al.,2007,JAMA 297:1675-1682)。

CSL-112是從血漿中純化和重組，以形成HDL適于靜脈輸注的ApoA-I的制劑(Diditchenko et al.,2013,DOI 10.1161/ATVBAHA.113.301981)。

ETC-216(也稱為MDCO-216)是HDL的脂質(zhì)缺失形式，含有重組ApoA-I_Milano-參見Nicholls et al.,2011,Expert Opin Biol Ther.11(3):387-94.doi:10.1517/14712598.2011.557061。

在另一個實施方案中，復合物是CER-522，其包含三種磷脂的組合和22個氨基酸的肽的脂蛋白復合物，CT80522:

CT80522

CER-522的磷脂成分由卵鞘磷脂，1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC)和1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[磷酸外消旋-(1-甘油)](Dipalmitoylphosphatidyl-甘油，DPPG)組成，重量比為48.5：48.5：3。在CER-522復合物中肽與總磷脂的比例為1：2.5(w/w)。

HDL治療劑的其它實例包括，但不限于在以下美國專利中描述的脂蛋白復合物，脫脂載脂蛋白，肽，融合蛋白和HDL模擬物：美國專利號8,617,615；8,206,750；8,378,068；7,994,120；7,566,695；7,312,190；7,307,058；7,273,848；7,250,407；7,211,565；7,189,689；7,189,411；7,157,425；6,900,177；6,844,327；6,753,313；6,734,169；6,716,816；6,630,450；6,602,854；6,573,239；6,455,088；6,376,464；6,329,341；6,287,590；6,265,377；6,046,166；6,037,323；6,004,925；6,743,778；8,383,592；8,101,565；8,044,021；7,985,728；7,985,727；8,568,766；8,557,767；8,404,635；8,148,328；8,048,851；7,994,132；7,820,784；7,807,640；7,723,303；7,638,494；7,531,514；7,199,102；7,166,578；7,148,197；7,144,862；6,933,279；6,930,085；8,541,236；8,148,323；8,071,746；7,572,771；7,223,726；8,163,699；8,415,293；7,691,965；7,601,802；7,439,323；7,217,785；8,158,601；8,653,245；8,557,962；7,491,693；7,749,315；5,059,528；RE38,556；6,258,596；5,866,551；6,953,840；8,119,590；7,193,056,6,767,994；6,617,134；6,559,284；6,454,950；6,306,433；6,107,467；5,990,081；5,876,968；5,721,114；8,343,932；7,786,352；8,536,117；8,143,224；7,781,219；7,776,563；7,390,504；7,378,396；6,897,039；7,273,849；8,637,460；8,268,787；8,048,851；8,048,015；8,030,281；7,402,246；7,393,826；7,375,191；7,361,739；7,364,658；7,361,739；7,364,658；7,361,739；7,297,262；7,297,261；7,195,710；7,166,223；7,033,500；6,897,039；8,252,739；7,847,079；7,592,010；7,550,432；7,521,424；7,507,414；7,507,413；7,482,013；7,238,667；7,094,577；7,081,354；7,056,701；7,045,318；7,041,478；6,994,857；6,989,365；6,987,006；6,972,322；6,946,134；6,926,898；6,909,014；6,905,688和美國專利公開號20040266662。將所有這些專利都通過引用以其整體并入本文。

本公開的HDL治療劑包括其施用導致增加的HDL水平的小分子。示例性的小分子包括CETP抑制劑，例如托徹普(torcetrapib)，anacetrapib，evacetrapib，DEZ-001(以前的TA-8995)和dalcetrapib，和在以下美國專利中公開的那些小分子：美國專利號8,053,440；5,783,600；5,756,544；5,750,569；5,648,387；8,642,653；8,623,915；8,497,301；8,309,604；8,153,690；8,084,498；8,067,466；7,838,554；7,812,199；7,709,515；7,705,177；7,576,130；7,335,799；7,335,689；7,304,093；7,192,940；7,119,221；6,909,014；6,831,105；6,790,953；6,713,507；6,703,422；6,699,910；6,673,780；6,646,170；6,506,799；6,459,003；和6,410,802。將所有這些專利都通過引用以其整體并入本文。

本公開的小分子HDL治療劑還包括CER-002和CER-209：

CER-002

CER-209

HDL治療劑可以配制為藥物組合物。本公開所涵蓋的藥物組合物包括作為活性成分的HDL治療劑，該HDL治療劑包含在藥用的、適用于體內(nèi)施用和遞送的載體中。

可注射的組合物包括活性成分在水性或油性媒介物中的無菌混懸液、溶液或乳劑。該組合物還可包含多種配方成分，如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。在一些實施方案中，其中該HDL治療劑是HDL模擬物，該模擬物被配制成包含在磷酸鹽緩沖鹽水(10mM磷酸鈉，80mg/mL蔗糖，pH 8.2)中的可注射的組合物。用于注射的組合物可以單位劑量形式存在，如，在安瓿中或在多劑量的容器中，并且可包括添加的防腐劑。對于輸注，組合物可在輸液袋中進行供應，該輸液袋由與HDL治療劑相容的材料制成，如乙烯乙酸乙烯酯或本領域已知的任何其它相容的材料。

作為脂蛋白復合物或去脂脂蛋白的HDL治療劑的適當?shù)膭┬褪前罱K濃度為約1mg/mL至約50mg/mL的脂蛋白，優(yōu)選約5mg/mL至約15mg/mL的脂蛋白的HDL治療劑。在一個具體的實施方案中，所述劑型包含最終濃度為約8mg/mL至約10mg/mL的載脂蛋白A-I、優(yōu)選約8mg/mL的HDL治療劑。

6.4.HDL標志物

本公開部分涉及HDL標志物的利用，所述HDL標志物通過增加HDL治療劑給藥下調(diào)(無論通過增加的頻率，增加劑量，或兩者)。HDL標志物直接或間接地參與了蓄積的膽固醇或膽固醇酯從單核細胞，巨噬細胞和單核細胞的去除，并且包括ATP結(jié)合膜盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)和G1(ABCG1)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子1基因(SREBP1)，其在脂肪酸和膽固醇的生物合成，以及在脂質(zhì)代謝中起重要作用。在多種實施方案中，本公開的方法測定單一的HDL標志物。在其他實施方案中，本公開的方法測定多個(例如，兩個或三個)HDL標志物?？梢栽诒竟_的方法進行檢測的示例性的HDL標志物的組合包括ABCA1+ABCG1；ABCA1+SREBP1；ABCG1+SREBP1；和ABCA1+ABCG1+SREBP1，所述組合是單獨或與其它標志物組合。測定HDL標志物的方法在本領域中是已知的并在下面舉例說明。

6.4.1.ABCA1

在多種實施方案中，本公開的方法需要測定ABCAI的表達水平和表達水平的改變(例如，響應于用HDL治療劑治療)。ABCA1 mRNA序列的表達水平，可以測定為分配的登錄號AB055982.1的表達水平，和ABCA1蛋白的表達水平可以測定為分配的登錄號AAF86276的表達水平。這些序列分別顯示于圖65A1-65A3和65B中。

已經(jīng)開發(fā)了幾個RT-PCR和抗體檢測系統(tǒng)，其可用于根據(jù)本發(fā)明的方法的ABCA1表達的測定，例如，如通過et al.,2005,Cardiovascular Research 66:141-149；et al.,2007,BMC Mol Biol.8:5；Genvigir et al.,2010,Pharmacogenomics 11(9):1235-46；Wang et al.,2007,Biochem Biophys Res Commun.353(3):650-4；Holven et al.,2013,PLOS ONE 8(11):e78241；and Rubic&Lorenz,2006,Cardiovascular Research 69:527-35描述的。

6.4.2 ABCG1

在多種實施方案中，本公開的方法需要測定ABCGI的表達水平和表達水平的改變(例如，響應于用HDL治療劑治療)。ABCGI mRNA序列的表達水平，可以測定為分配的登錄號NM_207629.1的表達水平，和ABCG1蛋白的表達水平可以測定為分配的登錄號P45844的表達水平。這些序列分別顯示于圖66A1-66A2和66B中。

已經(jīng)開發(fā)了幾個RT-PCR和抗體檢測系統(tǒng)，其可用于根據(jù)本發(fā)明的方法的ABCA1表達的測定，例如，如通過et al.,2007,BMC Mol Biol.8:5；Genvigir et al.,2010,Pharmacogenomics 11(9):1235-46；Wang et al.,2007,Biochem Biophys Res Commun.353(3):650-4；Holven et al.,2013,PLOS ONE 8(11):e78241；和Rubic&Lorenz,2006,Cardiovascular Research 69:527-35描述的。

6.4.3 SREBP1

在多種實施方案中，本公開的方法需要測定SREBP1的表達水平和表達水平的改變(例如，響應于用HDL治療劑治療)?？梢詼y定表達水平的SREBP1mRNA序列分配登錄號BC063281.1，并且可以測定表達水平的SREBP1蛋白可以分配登錄號P36956。這些序列分別顯示于圖67A1-67A2和67B中。

6.5.單核細胞

單核細胞在骨髓中產(chǎn)生，在血流中被釋放，并且還可以在其他生物體液如腦脊液，或淋巴中釋放，并且在離開循環(huán)后產(chǎn)生不同類型的組織巨噬細胞或樹突狀細胞。單核細胞，其后代和在骨髓中的即時前體(immediate precursor)也被命名為“單核吞噬細胞系統(tǒng)”(MPS)。它們來源于骨髓中的產(chǎn)生單核細胞和粒細胞的粒細胞/巨噬細胞集落形成單位(CFU-GM)前體。

新形成的單核細胞離開骨髓并遷移到外周血中。循環(huán)單核細胞能夠粘附到毛細血管的內(nèi)皮細胞，并能遷移到多種組織(van Furth et al.,1992,Production and Migration of Monocytes and Kinetics of Macrophages.In:van Furth R ed.Mononuclear Phagocytes.Dordrecht,The Netherlands:Kluwer Academic Publishers)，在這里它們可以分化成巨噬細胞或樹突狀細胞。單核細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞是在動脈粥樣硬化的引發(fā)和進展中的關鍵細胞。在正常情況下與流動的血液接觸的內(nèi)皮單層細胞抵抗單核細胞的牢固粘附。然而，在暴露于促炎因子后，在內(nèi)皮細胞中多種白細胞粘附分子的表達增加，這能使單核細胞粘附到內(nèi)皮細胞膜上(Libby,2002,Nature 420:868-874)。一旦已經(jīng)遷移，單核細胞成為組織-定居的巨噬細胞，在暴露于經(jīng)修飾的脂蛋白后依次發(fā)展成脂質(zhì)裝載的泡沫細胞(Osterud and Bjorklid,2003,Physiol.Rev.83:1069-1112)。

本公開的診斷和劑量優(yōu)化方法通常需要在用HDL治療劑治療之前，期間和/或之后測定單核細胞或巨噬細胞中HDL標志物的表達以鑒定在患者水平，群體水平，在動物模型或在體外細胞培養(yǎng)中的最佳給藥。

分離外周血單核細胞的方法是本領域的常規(guī)方法。這樣的方法包括密度梯度離心(其中細胞的比重差被用于分離)，成分輸血，單核細胞對塑料表面儀器，如聚苯乙烯燒瓶的附著，利用分子標志物的細胞分選方法。

單核細胞可以通過密度梯度離心法進行分離。

單核細胞可以通過它們粘附到塑料(聚苯乙烯)基質(zhì)被分離，因為單核細胞具有比例如外周血發(fā)現(xiàn)的其他細胞，如淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞粘附到塑料的更大的傾向。污染細胞可以通過在基質(zhì)的劇烈洗滌而除去。

單核細胞也可以使用淘析來分離，在該方法中細胞懸浮液在具有斜率的室中離心的，同時緩沖液以與離心相反的方向流動，以形成特定的細胞層。

單核細胞和巨噬細胞，優(yōu)選通過使用細胞分選法分離(例如，熒光激活細胞分選(FACS)，磁激活細胞分選(MACS)或流式細胞術(shù))利用細胞表面標志物如CD14和CD16分離。示例性的細胞分選方法和標志物公開在Mittar et al.,August 2011 BD Biosciences的出版物中，標題為“Flow Cytometry and High-Content Imaging to Identify Markers of Monocyte-Macrophase Differentiation。

6.6.治療方法

本公開提供了用于治療或預防病癥的方法。在一些實施方案中，該方法包括將有效量的HDL治療劑施用到需要其的受試者。受試者優(yōu)選是哺乳動物，最優(yōu)選人。治療方法可以利用的劑量(量和/或給藥日程表和/或輸注時間)是通過本文所述的方法鑒定和/或伴隨如本文所述的利用HDL標志物的伴隨診斷測定來監(jiān)測治療功效。

ABCA1缺陷導致在等位基因病癥家族性低α-脂蛋白血癥(FHA)或更嚴重的病癥Tangier病(TD)，其特征在于HDL-C膽固醇水平在血漿中大大降低，受損的膽固醇流出，并趨向于蓄積細胞內(nèi)膽固醇酯。本公開提供了用于治療這些病癥的方法。

HDL治療劑和本文所述的組合物可用于幾乎每一種目的HDL模擬物，所述HDL模擬物已被證明可以用于，例如治療或預防ABCA1相關疾病或缺失，治療或預防ABCG1缺失有關的疾病，和治療或預防HDL缺失癥，載脂蛋白A-I缺失或LCAT缺失。HDL治療劑可用于治療或預防疾病，如黃斑變性，中風，動脈粥樣硬化，急性冠脈綜合征，內(nèi)皮功能障礙，加速的動脈粥樣硬化，移植的動脈粥樣硬化，缺血和短暫性腦缺血發(fā)作。

本公開的HDL治療劑和組合物特別用于治療或者預防心血管疾病、障礙和/或者相關病癥。治療或者預防受試者中的心血管疾病、障礙和/或者相關病癥的方法通常包括向所述受試者給予低(<15mg/kg)劑量或者量的本申請所述的HDL治療劑或者藥物組合物，其根據(jù)有效治療或者預防具體適應癥的治療方案。

以足以或者有效提供治療益處的量給予HDL治療劑。在治療心血管疾病、障礙和/或者相關病癥的情境下，可推斷出治療益處，條件是出現(xiàn)以下的一種或者多種：相比于基線而言膽固醇流通的增加、動脈粥樣硬化斑塊體積的降低、增加了百分比斑塊體積(通過IVUS獲得的測量結(jié)果)(Nicholls et al.,2010,J Am Coll Cardiol 55:2399–407)，通過超聲成像技術(shù)(內(nèi)膜中層厚度)或MRI(Duivenvoorden et al.,2009,Circ Cardiovasc Imaging.2:235-242.)測量的血管壁厚度的降低，相比于基線水平而言游離膽固醇的高密度脂蛋白(HDL)部分的增加，而沒有平均血漿甘油三酯濃度的增加或者肝轉(zhuǎn)氨酶(或者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)水平的正常范圍之上的增加。盡管希望完全治愈，但是完全治愈不是存在治療益處所必需。

在一些實施方案中，HDL治療劑以每次注射約1mg/kg ApoA-I等價物至約15mg/kg ApoA-I等價物的劑量給予。在一些實施方案中，所述脂蛋白復合物以約1mg/kg，2mg/kg或3mg/kg ApoA-I等價物的劑量給予。在一些實施方案中，所述脂蛋白復合物以約6mg/kg ApoA-I等價物的劑量給予。在一些實施方案中，所述脂蛋白復合物以約8mg/kg，12mg/kg或15mg/kg ApoA-I等價物的劑量給予。

在一些實施方案中，治療或預防本文所述的病癥的方法包括監(jiān)測HDL治療劑的治療功效的步驟，例如，根據(jù)本文描述的用于監(jiān)測HDL治療劑的功效的方法來監(jiān)測。HDL治療劑的劑量和/或給藥日程表的功效可以通過在兩個或多個時間點比較一種或多種HDL標志物的表達水平來監(jiān)測，例如在施用HDL治療劑的劑量之前和在施用HDL治療劑的劑量之后。在一些實施方案中，所述表達水平在施用HDL治療劑的劑量后2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時進行測量。在另一個實施方案中，一種或多種HDL標志物的表達水平是在根據(jù)給藥日程表，例如其中HDL治療劑是每2天施用，每3天，每周日(every week day)，或每兩周施用的給藥日程表的施用HDL治療劑之前和之后測量的。

表達水平可以是蛋白質(zhì)表達水平或mRNA表達水平。在一個實施方案中，所述表達水平是使用抗體檢測系統(tǒng)，例如，如在第6.4節(jié)中描述的測定的蛋白質(zhì)表達水平。在另一個實施方案中，表達水平是使用RT-PCR測定的mRNA表達水平。在一個實施方案中，測量了一種或多種HDL標志物在根據(jù)6.5節(jié)中描述的任意方法分離的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞的表達水平。HDL治療劑的劑量和/或給藥日程表可以根據(jù)表達水平是否降低超過了6.2節(jié)中描述的一種或多種HDL標志物的截留量而被保持或修改。

待治療的受試者為患有心血管疾病、障礙和/或者相關病癥的個體?？墒褂帽旧暾埶龅腍DL治療劑和組合物治療或者預防的所述心血管疾病、障礙和/或者相關病癥的非限制性實例包括外周血管性疾病、再狹窄、動脈粥樣硬化以及動脈粥樣硬化的眾多臨床表現(xiàn)諸如中風、缺血性中風、短暫性缺血發(fā)作、心肌梗塞、急性冠脈綜合征、心絞痛、間歇性跛行、嚴重肢體缺血、心瓣狹窄和房脈瓣硬化。受試者可為具有急性冠脈綜合征諸如心肌梗塞(具有或者不具有ST升高)或者不穩(wěn)定心絞痛的先前發(fā)病的個體。所治療的受試者可為任意動物例如哺乳動物，具體為人類。

在一個實施方案中，該方法包括治療或預防具有器官移植，如心臟移植(例如，移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy)(CAV))，腎移植，或肝移植(Garcia-Garcia et al.,2010,European Heart Journal 3:2456–2469 at 2465,under“Cardiac Allograph Disease”)的受試者中心血管疾病，加速的動脈粥樣硬化的方法。在一些實施方案中，該方法包括將本文中所描述的HDL治療劑或組合物施用于受試者。

在某些方面，所述方法涵蓋治療或者預防心血管疾病的方法。在一些實施方案中，該方法包括向受試者施用某個量的本申請所述的HDL治療劑或者組合物，以便(a)在施用后不改變患者的基線ApoA-I和/或(b)在施用約2小時后，獲得比施用前基線(最初的)濃度高出約5mg/dL至100mg/dL的游離或復合的載脂蛋白血清濃度，和/或者在施用后約24小時后，獲得比施用前基線(最初的)濃度高出約5mg/dL至20mg/dL的游離或復合的載脂蛋白血清濃度。

在另一個方面，該方法包括治療或預防心血管疾病的方法。在一些實施方案中，該方法包括向受試者施用本申請所述的、有效量的HDL治療劑或者組合物，以便在施用后至少一天內(nèi)，獲得比施用前最初的HDL-膽固醇成分高至少約10％的HDL-膽固醇成分的循環(huán)血漿濃度。

在另一個方面，該方法包括治療或預防心血管疾病的方法。在一些實施方案中，該方法包括向受試者施用本申請所述的、有效量的HDL治療劑或者組合物，以便在施用后的5分鐘到1天之間，獲得30至300mg/dL的HDL-膽固醇成分的循環(huán)血漿濃度。

在另一個方面中，該方法包括治療或預防心血管疾病的方法。在一些實施方案中，該方法包括向受試者施用本申請所述的、有效量的脂蛋白復合物(例如荷電的復合物)或者組合物，以便在施用后的5分鐘到1天之間，獲得30至300mg/dL的膽固醇酯的循環(huán)血漿濃度。

在另一個方面中，該方法包括治療或預防心血管疾病的方法。在一些實施方案中，該方法包括向受試者施用本申請所述的、有效量的HDL治療劑或者組合物，以便在施用后至少一天內(nèi)，獲得比施用前的基線(最初的)濃度高至少約10％的增加的糞便膽固醇分泌。

本申請所述的HDL治療劑或者組合物可以單獨使用或與用于治療或預防前述病癥的其它藥物進行聯(lián)合治療。這樣的治療包括但不限于所包括藥物的同時或依序施用。例如，在血脂異常、高膽固醇血癥諸如家族性高膽固醇血癥(純合或者雜合)或動脈粥樣硬化的治療中，HDL治療劑可以與目前使用的任何一種或多種降低膽固醇的療法一起施用；如膽汁酸樹脂、煙酸、他汀類、膽固醇吸收抑制劑和/或貝特類。由于在膽固醇的合成和轉(zhuǎn)運中，每種藥物作用于不同的靶點，因而使得這樣的聯(lián)合方案可以產(chǎn)生特別有益的療效，即，膽汁酸樹脂影響膽固醇的再循環(huán)、乳糜微粒和LDL群；煙酸主要影響VLDL和LDL群；他汀類抑制膽固醇的合成，減少LDL群(并且也許增加LDL受體的表達)；而本申請所述的HDL治療劑影響RCT，增加HDL并促進膽固醇外流。

在另一個實施方案中，本申請所述的HDL治療劑或者組合物可以結(jié)合貝特類使用以治療或預防冠心病、冠狀動脈疾病、心血管疾病、再狹窄、血管或外周血管疾病、動脈粥樣硬化(包括治療和預防動脈粥樣硬化)。

本申請所述的HDL治療劑或者組合物可以以增加小HDL成分的劑量施用，所述小HDL成分例如前-β、前-γ和前-β狀HDL成分、αHDL成分、HDL3和/或HDL2成分。在一些實施方案中，該劑量可有效地實現(xiàn)如經(jīng)由顯像技術(shù)所測量的動脈粥樣硬化斑塊的減少，所述顯像技術(shù)如磁共振成像(MRI)或血管內(nèi)超聲(IVUS)。IVUS追蹤的參數(shù)包括但不限于粥樣斑體積由基線改變的百分比以及粥樣斑總體積的改變。MRI追蹤的參數(shù)包括但不限于IVUS的那些參數(shù)以及斑塊的脂質(zhì)組成和鈣化。

可以在最后的輸注結(jié)束時，或在最后的輸注后數(shù)周內(nèi)，或在開始治療后的3個月、6個月或1年內(nèi)使用患者作為自身對照來測量斑塊的消退(時間0比時間t)。

通過腸胃外的施用途徑可實現(xiàn)最佳的施用，其包括靜脈內(nèi)注射(IV)、肌內(nèi)注射(IM)、皮內(nèi)注射、皮下注射(SC)以及腹膜內(nèi)注射(IP)。在某些實施方案中，經(jīng)由注樣器、吸入器或?qū)Ч苓M行施用。在一些實施方案中，HDL治療劑以獲得與通過腸胃外施用獲得的循環(huán)血清濃度相等的循環(huán)血清濃度的量，通過注射、皮下植入泵或貯庫制品進行施用。例如，該HDL治療劑還可吸收在支架或其它的裝置中。

可以通過多種不同的治療方案來實現(xiàn)施用。例如，可以在一天內(nèi)定期地施用幾次靜脈內(nèi)注射，其中累積的注射總體積不能達到每日毒性劑量。所述方法包括以2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或者12天的間隔施用HDL治療劑。在一些實施方案中，HDL治療劑以每周一次，每周2次，每周三次或更多的間隔施用。

所述方法可進一步包括以如上所述的任何間隔施用HDL治療劑4、5、6、7、8、9、10、11、12次或更多次。在患家族原發(fā)性低α-脂蛋白血癥的受試者中，HDL治療劑可以持續(xù)幾個月，幾年或無限期地施用。

例如，在一個實施方案中，施用HDL治療劑六次，在每次施用之間的間隔為1周。在一些實施方案中，施用可如下完成：施用一系列注射，然后停止注射達6個月至1年，然后再開始另外一系列的注射。然后可在每年或者每3-5年施用維持的系列注射?？蓺v時一天(灌注以保持復合物的特定血漿水平)、若干天(例如歷時8天的時間內(nèi)四次注射)或者若干周(例如歷時4周的時間內(nèi)四次注射)完成所述系列注射，然后在六個月至一年后重新開始。對于慢性病癥，可在發(fā)展基礎上進行施用。任選地，所述方法可在誘導期后實施，當更頻繁地施用HDL治療劑時。

在另一個實施方案中，用HDL治療劑治療可以根據(jù)誘導給藥日程表，隨后是維持方案(其中劑量和/或給藥頻率降低)來啟始。例如，誘導方案可是必需每周施用HDL治療劑兩次，三次或四次。其中HDL治療劑是脂蛋白復合物如CER-001，誘導劑量可以基于蛋白質(zhì)是在4-15mg/kg之間的范圍內(nèi)(例如，4，5，6，7，8，9，10，12或15mg/kg)。維持方案可以是必需施用HDL治療劑每周一次，兩次或每周三次。其中HDL治療劑是脂蛋白復合物如CER-001，維持劑量可以基于蛋白質(zhì)是在0.5-8mg/kg之間的范圍內(nèi)(例如，0.5％，1，2，3，4，5，6，7或8mg/kg)。誘導給藥日程表特別適合于患家族性低α-脂蛋白血癥的受試者。說明性的給藥日程表在實施例4中描述。

在又一備選方案中，可以施用漸增的劑量，開始時以每次施用1-8mg/kg之間的劑量施用約1至5次，隨后每次施用時重復4-15mg/kg之間的劑量。根據(jù)患者的需求，其可以通過持續(xù)時間超過1小時的緩慢輸注進行施用，通過1小時或更少時間的快速輸注進行施用，或者通過一次快速推注施用。該劑量可施用每周一次，兩次，三次或更多次。

可以使用細胞培養(yǎng)中的標準藥物規(guī)程或者使用確定LD50(群體50％的致死劑量)和ED50(群體50％的治療有效劑量)的實驗動物來確定多種HDL治療劑的毒性和治療效力。毒性與治療作用之間的劑量比是治療指標并且其可以表示為LD50/ED50比值。優(yōu)選表現(xiàn)出更高治療指數(shù)的HDL治療劑。可跟蹤的參數(shù)的非限制性實例包括肝功能轉(zhuǎn)氨酶(不超過2×正常的基線水平)。其表明過多的膽固醇被運至肝并且不能同化如此大的量。由于膽固醇從紅細胞的動員可使紅細胞變脆或者影響紅細胞的形狀，因而還可監(jiān)測對紅細胞的作用。ABCA1，ABCG1或本文所描述的HDL標志物的下調(diào)也可以進行監(jiān)測。

患者可以在采取醫(yī)療措施之前接受數(shù)天至數(shù)周的治療(如，預防性治療)、或在采取醫(yī)療措施之中或之后接受數(shù)天至數(shù)周的治療。所述施用可以與另一種有創(chuàng)療法相伴或同時進行，所述有創(chuàng)療法如血管成形術(shù)、頸動脈消融術(shù)、rotoblader或器官移植(如，心臟、腎、肝等)。

在某些實施方案中，將HDL治療劑施用于膽固醇合成受他汀類或膽固醇合成抑制劑(例如，但不限于PCSK9抑制劑)控制的患者。在其它實施方案中，將HDL治療劑施用于接受結(jié)合樹脂(例如，半合成樹脂如消膽胺)或纖維(如植物纖維)治療的患者，以捕獲膽汁鹽和膽固醇，從而增加膽汁酸的分泌并降低血膽固醇濃度。

7.實施例1：CER-001劑量反應分析

7.1卡方臨床試驗

CER-001是具有負電荷的工程化改造的重組人載脂蛋白A-I高密度脂蛋白(HDL)，當由靜脈內(nèi)注射時模擬天然HDL的生物學性質(zhì)。CER-001，在WO2012/109162(將其全部并入本文作為參考)的實施例3和4中描述為“式H”，是由重組人載脂蛋白A-I和磷脂組成，所述磷脂含有鞘磷脂(SPH)和二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)。蛋白質(zhì)對磷脂的比例是1：2.7，并含有97％的Sph和3％DPPG。

如WO2012/109162實施例8中所述的，在健康志愿者中以0.25，0.75，2，5，10，30和45mg/kg的單次IV劑量的CER-001的I期研究表明復合物是耐受良好的，并且隨著劑量增加，膽固醇流通也增加，在大于15mg/kg的水平，觀察到甘油三酯的瞬時增加。

基于I期研究，已啟動標題為“HDL輸注是否可以顯著地加快動脈粥樣硬化的消退？”(“卡方”)的II期臨床研究。登記了呈現(xiàn)急性胸痛或其他相當?shù)男慕g痛癥狀(指示ST段抬高心肌梗死的診斷)，非ST段抬高心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛的504個受試者。要符合資格，受試者必須具有冠狀動脈疾病的血管造影證據(jù)，如通過血管造影目測的在三大天然冠狀動脈中的任一種的至少有一個病灶的管腔直徑具有>20％的減少所定義的，或經(jīng)皮冠狀動脈介入(“PCI”)的在先史。PCI的靶血管不是用于研究IVUS的靶冠狀動脈，并且具有先前的PCI的任何血管不能用作靶冠狀動脈。

在圖1中顯示了研究設計。主要端點是通過三維IVUS(血管內(nèi)超聲)評估的30mm段的靶冠狀動脈中的總斑塊體積的名義變化。關鍵的次要端點是靶30mm段中斑塊體積的變化％和粥樣斑體積的變化％，靶30mm段中總血管體積的變化，和最少并且最多患病5mm段中斑塊，管腔和總血管體積從基線的變化。發(fā)病率和死亡率為探索端點(exploratory endpoint)。

7.2結(jié)果

在IV CER-001施用后，載脂蛋白A-I以劑量依賴的方式(輸注1)并以與從I期的預測相一致的幅度增加。在輸注6保留了該效應，指示在隨著時間沒有效應的衰減。參見圖2A。

磷脂以劑量依賴的方式(輸注1)并以與從I期的預測相一致的幅度增加。在輸注6保留了該效應，指示隨著時間沒有效應的衰減。參見圖2B。磷脂和ApoA-I的劑量反應曲線的斜率比為2.8，這與在CER-001中磷脂與蛋白質(zhì)的比例相一致。

血漿總膽固醇以劑量依賴的方式(輸注1)并以與從I期的預測相一致的幅度增加。在輸注6保留了該效應，指示隨著時間沒有效應的衰減。參見圖2C。這些數(shù)據(jù)表明，3mg/kg CER-001的效力與15mg/kg ETC-216的效力相當。

CER-001在3,6，和12mg/kg的劑量整體耐受性良好，在實驗室參數(shù)時沒有明顯的劑量相關毒性。

7.2.1.IVUS-第一種方法

在基線處的平均總粥樣斑體積是155.24±67.99mm³。總粥樣斑體積的變化的經(jīng)調(diào)整的平均值對于安慰劑，CER-001 3mg/kg，CER-001 6mg/kg和CER-001 12mg/kg組，分別為-2.71，-3.13，-1.50和-3.05mm³(p＝0.81，用于前指定12mg/kg主要分析比安慰劑)。與安慰劑相比，CER-001 6mg/kg(名義p＝0.45)和3mg/kg(名義p＝0.77)組沒有差異。所有研究組的百分比粥樣斑體積變化是相似的(安慰劑0.02,-0.02,0.01和0.19％，CER-001 3mg/kg(p＝0.86),CER-001 6mg/kg(p＝0.95)和CER-001 12mg/kg(p＝0.53)組(名義p值比安慰劑)。

與下面要討論的“隨著步行(walk-along)”相反，單獨選擇幀對(frame pair)以用于最佳可讀性?；跓o回聲(鈣)和側(cè)枝選擇幀。選擇30mm段的最多31幀，排除了拉回大于30mm長的好處。當可獲得>31幀時，沒有使用預先定義的標準來選擇包括在分析組中的31幀。

約60％的成對圖像集聚集在31幀中，并且約16％的成對的圖像集聚集在16幀中。

“聚集”在16幀圖像集中是提示，以小于1mm(即低至0.3mm)的時間間隔選擇幀以使用于分析的圖像集符合規(guī)格。

“聚集”在31幀圖像集是提示<1mm的間隔也可能已經(jīng)用于使圖像對的數(shù)目最大化至31。

分析的更多細節(jié)在Tardif et al.,2014,Eur.Heart Journal,first published online April 29,2014 doi:10.1093/eurheartj/ehu171)中描述，通過引用將其整體并入本文。

根據(jù)這種方法，在126名患者/治療組中，卡方不足以顯示對心血管事件的顯著性(需要約5000名患者/組)。

7.2.2.IVUS分析-第二種方法

通過南澳大利亞健康與醫(yī)學研究院(South Australian Health&Medical Research Institute)(SAHMRI)進行IVUS數(shù)據(jù)的事后分析(post-hoc analysis)。

在這種情況下，基線和隨訪之間有相似的幀計數(shù)。所選幀的數(shù)目呈正態(tài)分布(圖3)。

分析表明相比于先前的HDL模擬物，PAV和TAV相對于基線的統(tǒng)計學顯著和可比級數(shù)的減少(圖4)。盡管這項研究并沒有達到mITT群體中主要端點，在改良后的Per Protocol(mPP)人群中，在TAV和PAV二者中3mg/kg劑量實現(xiàn)對安慰劑的名義統(tǒng)計學顯著性(圖5)。

如可在圖6A-6B中看到的，SAHMRI分析的結(jié)果與CER-001在人類中的倒U形的劑量-效應曲線是一致的。

如在表1中所顯示的，在基線PAV等于或大于30的患者中，劑量最低的3mg/kg在總動脈粥樣硬化體積(TAV)的變化和所有患者(mITT)的PAV的變化中獲得相對于安慰劑的統(tǒng)計學顯著性。

在具有PAV≥30的患者亞群中的劑量反應在基線遵循著總?cè)后w相同的模式，但在3mg/kg的劑量處在TAV和PAV有甚至更顯著的變化。

8.實施例2：在用CER-001或HDL₃治療后在逆脂質(zhì)轉(zhuǎn)運中牽涉的基因的調(diào)控

8.1.介紹

研究A-P的目標是確定在用CER-001，HDL₃和ApoA-I治療小鼠巨噬細胞(J774)之后，逆脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(RLT)中牽涉的基因的調(diào)控。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(RCT)是由外周細胞釋放累積膽固醇至細胞外受體，如高密度脂蛋白(HDL)，其然后介導膽固醇遞送到肝臟進行排出，從而防止動脈粥樣硬化的通路。研究膽固醇流出的一種方法是用[³H]-膽固醇氧化的LDL標記巨噬細胞，并測量在受體分子的存在下，來自這些細胞的膽固醇釋放。ABCA1，ABCG1和SR-BI是膽固醇流出中牽涉的膜蛋白。

8.1.材料

用于這些研究的材料包括CER-001(帶電荷的脂蛋白復合物，具有1：2.7的蛋白質(zhì)對總脂質(zhì)的比例，97％卵鞘磷脂/3％DPPG)和13.5mg/mL濃度的ApoA-1)，純化的人HDL₃和純化的ApoA-I。材料儲存于約-20℃。

HDL₃脂蛋白部分根據(jù)第8.3.1節(jié)中描述的方法從人血漿中制備。簡言之，首先用KBr梯度(d<1.055)和連續(xù)超速離心(24小時3次100,000xg)取出VLDL，IDL和LDL部分。保存LDL部分以后續(xù)用于膽固醇流出實驗。從KBr梯度(d＝1.19)–100,000xg持續(xù)40h分離HDL₃部分。在用于實驗之前對磷酸緩沖鹽水(PBS)充分透析脂蛋白部分。

8.3方案

8.3.1血漿脂蛋白的分離

接受血漿。測量新鮮血漿體積(不冷凍)。以最終濃度：EDTA：0.1％(w/v)，NaN₃：0.01％(w/v)添加添加劑。在20000rpm，4℃離心血漿20分鐘。除去細胞碎片和可能的乳糜微粒，得到澄清的血漿。

脂蛋白分離。脂蛋白通過在KBr溶液中連續(xù)浮選超速離心獲得(VLDL,d＝1.006g/mL；LDL,1.006<d<1.063g/mL)。HDL₂首先在d＝1.125g/mL分離(110,000xg，40h)，之后HDL₃在d＝1.19g/mL分離(110,000xg，40h)。使用前，對磷酸緩沖鹽水充分透析脂蛋白。鹽溶液的體積是血清體積-7％，對應于水合蛋白質(zhì)的體積。

8.3.2RNA提取

步驟1-均漿化：在1mL TRI中均漿化組織樣品(50mg)或培養(yǎng)的細胞(6孔板中的1個孔)。在室溫下，在1.5mL的無RNA酶的管中溫育勻漿5分鐘。對于組織樣品，在4℃下以12,000×g離心10分鐘，且將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。注意：對于培養(yǎng)的細胞樣品，沒有必要。

步驟2-RNA提?。簩?00μl溴氯丙烷(BCP)添加至1ml勻漿物中并良好地混合(渦旋15秒)。在室溫下溫育5分鐘。在4℃以12,000xg離心10分鐘。將400μl含水的上層相轉(zhuǎn)移到新的1.5mL的無RNA酶的試管中。

步驟3-最終RNA純化：加入200μl 100％乙醇并立即混合(渦旋5秒)。通過以12,000×g離心30秒使樣品通過過濾筒。用500μl洗滌液(12,000xg，30秒)清洗過濾器兩次。離心30秒以上，以去除殘留的洗滌液。將過濾筒轉(zhuǎn)移至新的收集管。加50-100μl洗脫緩沖液至過濾柱，在室溫溫育2分鐘，并在12,000×g下離心30秒，以從過濾器洗脫RNA。將回收的RNA儲存在-80℃下。

步驟4–測定RNA濃度：RNA溶液的濃度是通過在NanoDrop分光光度計上測量1.5μl樣品在260nm處的吸光度進行測定的。為了評估RNA的質(zhì)量，可以如第8.3.3節(jié)所描述的用Agilent 2100生物分析儀進行分析。

8.3.3用Agilent生物分析儀進行RNA質(zhì)量檢測

允許所有的試劑在使用前在室溫下平衡30分鐘。而將染料濃縮物拿到室溫中時使其避光。

步驟1-準備凝膠：將550μl AgilentRNA 6000 Nano凝膠基質(zhì)放置到自旋過濾器中。在1500×g離心10分鐘。將65μl過濾的凝膠等分到包括在試劑盒中的0.5mL無RNA酶的微量離心管中。在一個月內(nèi)使用過濾凝膠。

步驟2-準備凝膠染料混合物：旋渦RNA 6000 Nano染料濃縮物10秒并旋下。添加1μl RNA 6000 Nano染料濃縮物到65μl過濾凝膠的等分試樣中。蓋住管帽，渦旋并目視檢查凝膠和染料的適當混合。旋管，在室溫下以13,000xg旋轉(zhuǎn)管10分鐘。在一天之內(nèi)使用準備好的凝膠。每次使用前始終以13,000×g重新旋轉(zhuǎn)凝膠染料混合物10分鐘。

步驟3-裝載凝膠染料混合物：裝載凝膠染料混合物之前，確保芯片涂刷站(chip priming station)的底板在適當位置(C)，并且可調(diào)節(jié)的夾被設置到頂部位置。在芯片涂刷站上換上新的RNA6000 Nano芯片。在圍繞的G孔底部吸取9μl凝膠染料混合物。計時器設置為30秒，確保柱塞定位在1ml處，然后關閉該芯片涂刷站。當涂刷站正確地關閉時，門閂的鎖將點擊。按下注射器的柱塞直到它被夾子固定住。正好等待30秒，然后用夾子釋放機構(gòu)釋放柱塞。等待5秒鐘，然后慢慢將柱塞回拉至1ml的位置。緩慢打開芯片涂刷站。在兩個G孔的每一個中吸取9μl凝膠染料混合物。

步驟4-裝載AgilentRNA 6000 Nano標志物：吸取5μl RNA 6000 Nano標志物至標記有Ladder標記的孔和12樣品孔中的每個中。

步驟5-裝載Ladder和樣品：使用前，解凍等分的Ladder和RNA樣品，并保持它們在冰上。為了最小化二級結(jié)構(gòu)，在樣品裝載在芯片上之前使其熱變性(70℃，2分鐘)。吸取1μl準備好的Ladder至標有Ladder標記的孔。吸取1μl每一樣品到至12個樣品孔的每一個中。吸取1μl RNA 600 Nano標志物至每個未使用的樣品孔中。將芯片水平放置在IKA旋渦混合器的適配器中，以2400rpm渦旋1分鐘。5分鐘內(nèi)在Agilent2100生物分析儀內(nèi)運行芯片。

步驟6-啟動芯片分析：在儀器背景中，從測定菜單選擇合適的檢測(例如：測定真核生物RNA)，并選擇COM端口1。接受當前的文件前綴或修改它。數(shù)據(jù)將被自動保存到使用這個前綴的名稱的文件中。此時，文件存儲位置和將要分析的樣品數(shù)目可以是定制的。單擊該窗口右上角的開始按鈕以啟動芯片的運行。輸入樣品信息，如樣品名稱和注釋，選擇以藍色高亮顯示的數(shù)據(jù)文件的鏈接或者進入分析文件(Assay context)并選擇芯片摘要選項卡(Chip Summary tab)。完成樣品名稱表。芯片運行結(jié)束后，立即從容器取下芯片。

8.3.4反轉(zhuǎn)錄

在準備反應管前，使用高容量的RNA至cDNA試劑盒((Applied Biosystems cat.No.4387406)準備RT反應混合物。為了在冰上制備RT反應混合物(每反應20μl)：(1)允許試劑盒組分在冰上解凍和(2)計算所需成分的體積以準備如表2中顯示的所需數(shù)目的反應：

將20μl RT反應混合物分配至管中。密封管，并在230×g下離心它們1分鐘。為進行RT反應，熱循環(huán)儀的程序設置如下：37℃→60分鐘；95℃→5分鐘；12℃→∞。

8.3.5基因表達定量分析(實時PCR)

步驟1-準備cDNA樣品：使用RibopureRNA分離試劑盒(Applied Biosystems AM 1924)提取總RNA，并通過NanoDrop分光光度計測定1.5μl樣品中的RNA濃度(參見8.3.2節(jié))。使用高容量RNA至cDNA試劑盒(Applied Biosystems PN 4387406)進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)(見第8.3.4節(jié))。如果不立即進行PCR，在-20℃存儲cDNA樣品。

步驟2-準備PCR反應混合物：對于所有樣品，使用相同量的cDNA(20μl RT反應，對于0.5或1μg RNA使用4μl cDNA)。對于每一個樣品(以一式三份運行)，將以下作為樣品放到無核酸酶的1.5mL離心管(對于2個樣品，添加更多體積來計算PCR反應混合物的最終體積)：2X基因表達主要混合物：10μl；20X基因表達測定：1μl；無核酸酶的H₂O：5μl。蓋住帽筒并倒轉(zhuǎn)幾次，以混合反應組分。短暫離心管。

步驟3-裝載板：將4μlcDNA放入到96孔反應板的各孔中，對于兩種沉積物(預見一個孔中用4μl H₂O作為每個基因的空白對照)，通過改變板的方向每孔轉(zhuǎn)移16μl PCR反應混合物。用合適的覆蓋物密封板。短暫離心板(230×g，1分鐘)。將板裝入StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)。

步驟4-運行板：創(chuàng)建用于運行的實驗/板文件。運行板。程序：(a)95℃→10分鐘；(b)95℃→15秒；(c)60℃→1分鐘；(b)和(c)運行40個循環(huán)。

8.3.6放射性膽固醇流出研究

第1天-細胞培養(yǎng)：從ATCC獲得的J774巨噬細胞(N°TIB-67)在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Invitrogen)中，在37℃，5％CO₂下培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基補充有10％FBS(胎牛血清，Invitrogen)，100單位/ml青霉素G(Invitrogen)和100單位/ml鏈霉素(Invitrogen)。以40,000個細胞/孔將細胞接種到24-孔板(Falcon)中，并在2ml DMEM 10％FBS中生長32小時。LDL氧化：在Slide-A-Iyzer^TM Mini Dialysis Units 7000MWCO(Pierce)中，使1mL LDL對4L PBS透析(兩次，每次12小時)。

第2天-LDL氧化：[1]在透析后，使用白蛋白(#23209，ThermoScientific)作為標準用Coomassie蛋白質(zhì)測定法(#856209，ThermoScientific)定量蛋白質(zhì)-LDL。在600nm處用Glomax多檢測系統(tǒng)(Promega)讀取吸光度。用CuSO₄(5μΜ最終濃度)(C8027，Sigma Aldrich)在37℃下氧化對PBS-透析的LDL(2mg/mL)4小時。該反應通過加入EDTA(100μΜ最終濃度)(#20302.236，Prolablo)終止。使氧化的LDL對2x1L PBS透析0.5小時。透析后，蛋白質(zhì)-LDL用與[1]相同的方法進行定量。細胞培養(yǎng)：氧化的LDL(50μl,12.5μg)與在DMEM 2.5％FBS中的[³H]膽固醇的(1μCi,Perkin Elmer)混合15分鐘。將經(jīng)放射性標記的LDL添加到450μl DMEM 2.5％FBS中的J744細胞中24小時。

第3天-細胞培養(yǎng)：除去放射性培養(yǎng)基，用1ml DMEM(無FBS)洗滌細胞三次，并在有或沒有激動劑LXR(1μΜ)的情況下培養(yǎng)過夜。

第4天-膽固醇流出試驗：流出通過在無FBS的250μl DMEM中加入不同受體誘導6小時(或1至24小時之間的不同時間)。放射性通過以下測量：加入培養(yǎng)基(0.25mL)到Super Mix(0.75ml)(1200-439Perkin-Elmer)，在24孔柔性微孔板(1450-402Perkin-Elmer)混合，并用Trilux(計數(shù)時間2分鐘)測量放射性。細胞內(nèi)[³H]膽固醇通過0.2mL己烷-異丙醇(3:2)(溫育0.5小時)萃取，并通過液體閃爍計數(shù)來測量。

8.3.7膜/胞質(zhì)溶膠分離

膜/胞質(zhì)溶膠分離，不需要超速離心：在200μl裂解緩沖液中重懸細胞沉淀(6孔板中的2-孔)，或在1ml裂解緩沖液中重懸組織樣品(50-100mg)。用勻漿組織樣品或使用DigitalBRANSON以30％的振幅超聲2×10s來勻漿細胞沉淀。在4℃以800×g離心5分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，并在4℃以13,000xg離心30分鐘。保存上清液(胞質(zhì)溶膠部分)。沉淀重懸在100-200μl裂解液(補充有1.2％的Triton X100)。15分鐘內(nèi)劇烈攪拌。以14,000xg離心5分鐘，保存上清液(溶解的膜蛋白部分)。

用超速離心進行的膜/胞質(zhì)溶膠分離：在1ml裂解緩沖液中重懸細胞沉淀(6孔板中的2-孔)或組織樣品(50-100mg)。用勻漿組織樣品或使用DigitalBRANSON以30％的振幅超聲2×10s來勻漿細胞沉淀。在4℃以800×g離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至管中用于超速離心，在8℃下以100,000xg(38,500rpm)(轉(zhuǎn)子Ti70)離心1小時，保存上清液(胞質(zhì)溶膠部分)。沉淀重懸在100-200μl裂解緩沖液中(表3)(補充有1.2％的Triton X100)。15分鐘內(nèi)劇烈攪拌下。以14,000xg離心5分鐘，保存上清液(溶解的膜蛋白部分)。

8.4基因調(diào)控研究A-P的結(jié)果

8.4.1研究A：通過CER-001，HDL₃和ApoA-I調(diào)控J774 ABCA1基因-劑量反應(25，250和1000μg/mL)

在這項研究中，在膽固醇流出的條件下，針對不同濃度的CER-001,HDL₃和ApoA-I，檢查了小鼠巨噬細胞(J774)的ABCA1基因表達。J774接種在6×孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載，而無需使用³H-膽固醇。將CER-001，HDL₃(來自冷凍原液)和ApoA-I(25，250和1000μg/mL)加入巨噬細胞6小時，根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA(每種條件一個孔)。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案用Taqman探針Mm00442646.m1測定ABCA1基因表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)

6小時溫育后，在實驗中所用的劑量的ApoA-I沒有改變ABCA1表達。所有的劑量的CER-001降低了ABCA1 mRNA；25μg/mL劑量的HDL₃不影響ABCA1 mRNA的濃度(圖7)。

8.4.2研究B：通過CER-001，HDL₃和ApoA-I調(diào)控J774 ABCG1基因-劑量反應(25，250和1000μg/mL)

在這項研究中，在膽固醇流出的條件下，針對不同濃度的CER-001,HDL₃和ApoA-I，檢查了小鼠巨噬細胞(J774)的ABCG1基因表達。J774接種在6孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載，而無需使用³H-膽固醇。將CER-001，HDL₃(來自冷凍原液)和ApoA-I(25，250和1000μg/mL)加入巨噬細胞6小時，根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA(每種條件一個孔)。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案用Taqman探針Mm00437390.m1測定ABCG1基因表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)

在實驗中所用的劑量的ApoA-I沒有改變ABCG1表達。所有的劑量的CER-001降低了ABCG1 mRNA；25μg/mL劑量的HDL₃不影響ABCG1 mRNA的濃度(圖8)。

8.4.3研究C：通過CER-001，HDL₃和ApoA-I調(diào)控J774SR-BI基因-劑量反應(25，250和1000μg/mL)

在這項研究中，在膽固醇流出的條件下，針對不同濃度的CER-001,HDL₃和ApoA-I，檢查了小鼠巨噬細胞(J774)的SR-BI基因表達。J774接種在6孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載，而無需使用³H-膽固醇。將CER-001，HDL₃(來自冷凍原液)和ApoA-I(25，250和濃度為1000μg/mL)加入巨噬細胞6小時，根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA(每種條件一個孔)。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案用Taqman探針Mm00450234.m1測定SR-BI基因表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)

在所有的劑量進行的不同的處理沒有觀察到SR-BI基因表達的顯著變化(圖9)。

8.4.4研究D：通過CER-001，HDL₃和ApoA-I調(diào)控J774其他基因-劑量反應(25，250和1000μg/mL)

表達ABCA1，ABCG1和SR-BI的那些基因的mRNA調(diào)節(jié)是與核蛋白質(zhì)，如LXR，SREBP1和SREBP2相關的。本研究在膽固醇流出的條件下，針對不同濃度的CER-001,HDL₃和ApoA-I，檢查了小鼠巨噬細胞(J774)LXR，SREBP1和SREBP2的mRNA水平。J774接種在6孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載，而無需使用³H-膽固醇。將CER-001，HDL₃和ApoA-I(25，250和濃度為1000μg/mL)加入巨噬細胞6小時，根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA(每種條件一個孔)。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案用Taqman探針(分別是Mm01138344.m1,Mm01306292.m1,Mm00443451.m1)測定SREBP-1,SREBP-2和LXR的基因表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)。

對于用ApoA-I的不同處理，沒有觀察到SREBP-1,SREBP-2和LXR的基因表達的顯著變化。不同劑量的CER-001和HDL₃僅影響SREBP-1的mRNA水平(圖10)，而SREBP-2和LXR未改變(分別為圖11和圖12)。

8.4.5研究E：用于調(diào)控J774小鼠巨噬細胞中ABCA1，ABCG1和SR-BI表達的CER-001和HDL₃EC₅₀的測定

本研究檢查用于調(diào)控ABCA1，ABCG1和SR-BI基因表達所需要的ApoA-I,CER-001或HDL₃ApoA-I的最低有效濃度。J774接種在6孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載。將CER-001，HDL₃和ApoA-I(0.25，2.5，7.5，25和250μg/mL)加入巨噬細胞6小時，根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案測定SR-BI基因(Taqman探針Mm00450234.m1)，ABCG1(Taqman探針Mm00437390.m1)，SREBP1(Taqman探針MM01 138344.mL)和ABCA1(Taqman探針Mm00442646.m1)。使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針:Mm00446968.m1)。

ApoA-I沒有改變所測試基因的mRNA水平(圖13)。CER-001使ABCA1水平減少一半的劑量約7.5μg/mL，并HDL₃是25μg/mL(圖13)。對于ABCG1，劑量超過75μg/mL的CER-001和HDL3對于使mRNA水平減少一半是必要的(圖14)。對于SREBP1，在濃度高于2.5μg/mL的CER-001和高于25μg/mL的HDL3下，我們觀察減少和平穩(wěn)狀態(tài)(圖15)。SR-BI水平未受到不同處理的影響(圖16)。

8.4.6研究F：CER-001和HDL₃調(diào)控J774小鼠巨噬細胞中ABCA1mRNA的動力學

本研究檢查降低J774小鼠巨噬細胞中ABCA1 mRNA水平的動力學。J774接種在6孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載。將CER-001，HDL3和ApoA-I(25和250μg/mL)在不同的時間點加入巨噬細胞，根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案測定ABCA1(Taqman探針Mm00442646.m1)的表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)。

CER-001(25或250μg/mL)能夠在4小時減少一半的ABCA1 mRNA水平。HDL₃(250μg/mL)(已解凍/冷凍幾次)的行為類似于CER-001，除了在25μg/mL的HDL₃處未觀察到下調(diào)。如之前報道的，濃度為25μg/mL或250μg/mL的ApoA-I沒有降低ABCA1的mRNA水平。用ApoA-I處理(圖17)在2小時和4小時觀察到ABCA1 mRNA的增加。

8.4.7.研究G：在CER-001，HDL₃和ApoA-I的存在下，Camp對調(diào)控ABCA1和ABCG1 mRNA水平的效應

本研究檢查了用cAMP處理后，CER-001，HDL3或ApoA-I對J774巨噬細胞中ABCA1和ABCG1 mRNA水平的效應。J774接種在6孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載。第二天，培養(yǎng)基被替換為DMEM+/-cAMP(300μΜ)。在存在/不存在cAMP下，過夜培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)基，并替換為混合有CER-001，HDL₃或ApoA-I(250μg/mL)的DMEM達6小時，并且根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案測定ABCG1(Taqman探針Mm00437390.m1)和ABCA1(Taqman探針Mm00442646.m1)的表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)。

在cAMP的存在下，觀察到了增加的ABCA1 mRNA水平(圖18)。在CER-001或HDL3(250μg/mL)的存在下，ABCA1和ABCG1的mRNA水平降低，而沒有改變ApoA-I。在cAMP的存在下，當細胞與CER-001或HDL₃溫育時，ABCA1和ABCG1的濃度恢復到RQ＝1，但沒有達到ABCA1刺激(RQ＝5-6)(圖18和圖19)。在ApoA-I和cAMP的存在下，與單獨的ApoA-I相比ABCA1的mRNA水平(RQ≈3)增加，但未達到針對DMEM+cAMP的相同的水平(RQ≈6)。

8.4.8.研究H：在CER-001和HDL3的存在下，調(diào)控J774巨噬細胞中ABCA1蛋白質(zhì)水平的效應

本研究檢查了CER-001和HDL₃對J774巨噬細胞中ABCA1蛋白質(zhì)水平的效應。J774巨噬細胞接種在6孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載。第二天，培養(yǎng)基被替換為DMEM。過夜平衡后，去除培養(yǎng)基，并替換為混合有CER-001和HDL₃(250μg/mL)的DMEM達6小時。并且根據(jù)第8.3.7節(jié)的方法裂解細胞和分離膜。胞漿和膜蛋白在SDS-PAGE 10％上分離，并針對ABCA1(ab7360-稀釋度1/1000)進行探測。使用軟件對蛋白質(zhì)水平進行定量。

觀察到用CER-001和HDL₃處理的巨噬細胞ABCA1蛋白水平顯著減少(圖20和圖21)。ApoA-I未影響ABCA1的水平，并且添加cAMP大大增加了此水平。添加250μg/mL CER-001和HDL₃到巨噬細胞J774中持續(xù)6小時，導致ABCA1的mRNA和蛋白質(zhì)水平減少。

8.4.9研究I：在增加濃度的CER-001的存在下，cAMP對調(diào)節(jié)ABCA1和ABCG1 mRNA水平的效應

本研究檢查了用cAMP處理，增加濃度的CER-001對ABCA1和ABCG1 mRNA水平的效應。J774接種在6孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載。第二天，培養(yǎng)基被替換為DMEM+/-cAMP(300μΜ)。在存在/不存在cAMP下，過夜培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)基，并替換為混合有不同濃度的CER-001(0,0.1,0.5,1,2,4,6,8,10,15和30μg/mL)的DMEM，達6小時，并且根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案測定ABCG1(Taqman探針Mm00437390.m1)和ABCA1(Taqman探針Mm00442646.m1)的表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)。

在cAMP的存在下，觀察到ABCA1和ABCG1 mRNA水平的增加(圖22，圖23，圖24，圖25，和圖26)。在4-6μg/m劑量的劑量觀察到ABCA1和ABCG1 mRNA水平的降低，最大約15μg/mL。cAMP激活并沒有改變用于降低ABCA1的水平的CER-001的足夠劑量，因為在存在或不存在cAMP的情況下，輪廓相似(圖26)。

8.4.10研究J：用CER-001和HDL₃處理后恢復到ABCA1和ABCG1 mRNA的正常量

本研究檢查用CER-001和HDL₃處理后恢復到ABCA1和ABCG1 mRNA的正常量所需要的時間。J774在DMEM 10％FCS中接種于6孔板(600,000細胞/孔)。第二天，培養(yǎng)基被替換為無血清的DMEM，并用CER-001，HDL₃或ApoA-I(250μg/mL)處理24小時。除去培養(yǎng)基并用DMEM洗滌巨噬細胞。在去除CER-001，HDL3或ApoA-I后不同時間點(0，1，2，4，8和24小時)，用RiboPure^TM試劑盒按照制造商的方案提取細胞RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案測定ABCG1(Taqman探針Mm00437390.m1),ABCA1(Taqman探針Mm00442646.m1)和SR-BI(Taqman探針Mm00450234.m1)的表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)。

CER-001和HDL₃處理后觀察到ABCA1和ABCG1 mRNA水平下降。ApoA-I并不影響那些mRNA水平，并且CER-001和HDL₃不會改變SR-BI的mRNA水平(圖27，圖28，和圖29)。在CER-001處理后，ABCA1的mRNA水平在超過8小時中恢復到基線，并且對于ABCG1，恢復更快，因為在8小時內(nèi)到達基線。在HDL₃處理后，ABCA1的mRNA水平在約8小時恢復到基線，并且對于BCG1，2-4小時是必需的。在CER-001和HDL3處理之間觀察到的差異可能是由于在CER-001的存在下mRNA處于較低的水平。ApoA-I的除去引起在不同時間點(對于ABCA1為1小時，對于ABCG1為4小時)ABCA1和ABCG1 mRNA水平的增加。CT代表對照，即未添加CER-001，HDL₃或ApoA-I的J774巨噬細胞的生長。

8.4.11研究K：通過CER-001和HDL3調(diào)控ABCA1和SR-BI mRNA的巨噬細胞特異性-對肝細胞(小鼠和人類)的效應

本研究檢查了(25μg/mL)的CER-001和HDL3對小鼠和人肝細胞ABCA1和SR-BI的mRNA水平的影響。在DMEM 10％FCS的HepG2細胞(人肝細胞)和Hepa1-6(小鼠肝細胞)接種到6孔板(300,000細胞/孔)。三天后，將CER-001，HDL₃和ApoA-I(在DMEM中0.25，25和250μg/mL)添加到肝細胞中6小時，用RiboPure^TM試劑盒按照制造商的方案提取細胞RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案測定ABCA1(Taqman探針Hs01059118.m1和Mm00442646.m1，分別用于HepG2和Hepa1-6)和SR-BI(Taqman探針Hs00969821.ml和Mm00450234.m1，分別用于HepG2和Hepa1-6)的表達。所使用的參考基因是針對Hepa1-6的HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)和針對HepG2細胞的GAPDH(Taqman探針：Hs03929097.g1)。

用CER-001，HDL₃和ApoA-I處理后(圖30和圖31)，在人肝細胞中沒有觀察到ABCA1和SR-BI mRNA水平的顯著下降。用250μg CER-001和HDL₃處理后，在小鼠肝細胞中觀察到ABCA1 mRNA水平的兩倍的降低(圖32和圖33)。用ApoA-I以250μg/mL處理在小鼠肝細胞中ABCA1 mRNA水平下降25％。

8.4.12研究L：在通過CER-001和HDL3下調(diào)ABCA1后添加ApoA-I的結(jié)果

本研究檢查在通過CER-001和HDL₃下調(diào)ABCA1后添加ApoA-I對基因表達的影響。在DMEM 2.5％FCS中的J774接種于6孔板(300,000細胞/孔)。平衡(DMEM)后，CER-001，HDL₃和ApoA-I是在250μg/mL添加過夜。第二天，培養(yǎng)基替換為補充或未補充ApoA-I(25或250μg/mL)的新鮮的DMEM以起始ApoA-I膽固醇流出，持續(xù)2小時。該實驗在不同時間點停止：1)添加ApoA-I前停止J774，2)J774+DMEM(被動流出，2小時)，3)J774+ApoA-I(25μg/mL)，持續(xù)2小時和4)J774+ApoA-I(250μg/mL)，持續(xù)2小時。用RiboPure^TM試劑盒按照制造商的方案提取細胞RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案測定ABCA1(Taqman探針Mm00442646.m1),ABCG1(Taqman探針Mm00437390.m1),和SR-BI(Taqman探針Mm00450234.m1)的表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)。

加入250μg/mL的ApoA-I在2小時后增加了ABCA1 mRNA水平(DMEM條件–第4組條(圖34)。這種增加是短暫的，因為在6小時內(nèi)水平回到基線(見實驗F)。添加CER-001或HDL3強烈地降低了ABCA1 mRNA水平(黑條)。去除脂蛋白后兩個小時，ABCA1 mRNA水平也相應增加到以前的結(jié)果(見實驗I)，并且這種增加通過添加250μg/mL的ApoA-I而加強。用250μg/mL ApoA-I預培養(yǎng)巨噬細胞并未改變ABCA1 mRNA水平。在用250μg/mL ApoA-I預溫育在那些條件下也觀察到了用DMEM+250μg ApoA-I記錄的刺激。觀察到在不同的條件下ABCG1 mRNA調(diào)節(jié)的類似的概貌(圖35)。SR-BI mRNA在HDL₃的存在下增加，但在其他條件下未增加(圖36)。對于測試的不同條件，添加ApoA-I并未改變SR-BI mRNA水平。

8.4.13研究M：通過HDL₂調(diào)節(jié)巨噬細胞J774中ABCA1，ABCG1和SR-BI的mRNA細胞水平

本研究檢查HDL₂對小鼠巨噬細胞中ABCA1，ABCG1和SR-BI mRNA水平的影響。HDL₂是與HDL₃相比更大且更成熟的脂蛋白，并且HDL₂與ABCG1，以及HDL₃與ABCA1相互作用。J774接種在6×孔板(300,000細胞/孔)并用氧化性-LDL裝載。在巨噬細胞上加入HDL₂(2.5至1000μg/mL)6小時，根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案測定ABCA1(Taqman探針Mm00442646.m1),ABCG1(Taqman探針Mm00437390.m1)和SR-BI(Taqman探針Mm00450234.m1)的基因表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)。在實驗中使用的HDL₂剛剛針對PBS溶液透析。

觀察到75μg/mL以上的HDL₂處理導致小鼠巨噬細胞中ABCA1和ABCG1 mRNA水平的顯著下降(圖37和圖38)。HDL₂濃度高于75μg/mL時，SR-BI的mRNA水平開始增加(圖39)。

8.4.14研究N：通過環(huán)糊精調(diào)控J774巨噬細胞中ABCA1，ABCG1和SR-BI mRNA的細胞水平-測定環(huán)糊精的存在下的膽固醇流出

本研究采用β環(huán)糊精來檢查細胞內(nèi)膽固醇濃度是否可以負責用CER-001和HDL3觀察到的J774小鼠巨噬細胞中ABCA1和ABCG1的下調(diào)。β環(huán)糊精是環(huán)狀寡糖，溶于水，具有對固醇極高的特異性并能夠從細胞流出膽固醇。在DMEM 2.5％FCS中，J774接種在24孔板(60,000細胞/孔)并裝載³H-膽固醇LDL。24小時平衡(DMEM)后，添加β環(huán)糊精(0.03，0.1，0.3，1，3，10和30mM)，持續(xù)6小時。使用第8.3.6節(jié)的方案檢測流出的百分比，并被確定為：培養(yǎng)基DPM/(培養(yǎng)基DPM+細胞DPM)*100。30mM的劑量不會在最終圖上表示，因為劑量是細胞毒性的，殺死細胞群體的一半。

觀察到膽固醇流出與β環(huán)糊精之間的劑量依賴性增加(圖40)。

8.4.15研究O：通過環(huán)糊精調(diào)控J774巨噬細胞中ABCA1，ABCG1和SR-BI mRNA的細胞水平-測定基因表達

本研究采用β環(huán)糊精來檢查細胞內(nèi)膽固醇濃度是否負責用CER-001和HDL₃觀察到的J774小鼠巨噬細胞中ABCA1和ABCG1的下調(diào)。J774接種在6孔板(300,000細胞/孔)。將β環(huán)糊精(0.03,0.1,0.3,1,3,10和30mM)加入巨噬細胞6小時，根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案測定ABCA1(Taqman探針Mm00442646.m1),ABCG1(Taqman探針Mm00437390.m1)和SR-BI(Taqman探針Mm00450234.m1)的基因表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)

在β環(huán)糊精的存在下，觀察到J774中ABCA1和ABCG1 mRNA水平的劑量依賴性減少(圖41和圖42)。與此相反，SR-BI顯示隨β環(huán)糊精(圖44)的劑量依賴性增加。

8.4.16研究P：通過環(huán)糊精調(diào)控J774巨噬細胞中SREBP1,SREBP2和LXR mRNA的細胞水平-測定基因表達

本研究中使用β環(huán)糊精檢查β環(huán)糊精對J774巨噬細胞中LXR，SREBP1和SREBP2 mRNA表達的影響。J774接種在6孔板(300,000細胞/孔)。將β環(huán)糊精(0.03,0.1,0.3,1,3,10和30mM)加入巨噬細胞6小時，根據(jù)制造商的方案使用RiboPure^TM試劑盒提取RNA。使用在8.3.2節(jié)(RNA提取)；8.3.4(逆轉(zhuǎn)錄)和8.3.5(qPCR)中描述的方案測定基因表達。根據(jù)制造商的方案用Taqman探針(分別為Mm01138344.m1,Mm01306292.m1,Mm00443451.m1)測定LXR，SREBP1和SREBP2的基因表達。所使用的參考基因是HPRT1(Taqman探針：Mm00446968.m1)

沒有觀察到LXR mRNA隨β環(huán)糊精濃度增加的顯著變化(圖44)。在β環(huán)糊精的最低劑量下SREBP-2mRNA增加，并達到平臺(圖46)。觀察到SREBP-1mRNA的劑量依賴性降低(圖45)，這類似于用CER-001和HDL₃處理觀察到的。

9實施例3：測量用CER-001處理的Apo^-/-小鼠流動終止模型(Flow Cessation Model)中的斑塊消退

9.1介紹

研究A-F的目標是測量不同CER-001濃度對來自用高脂飲食喂養(yǎng)的apoE^-/-小鼠的結(jié)扎左側(cè)頸動脈的斑塊進展的效力。

9.2材料與方法

9.2.1概述

用于這些研究的材料包括CER-001(1109HDL03-2X240913批次，通過膜Vivaflow 30KDa盒濃縮)和純化的人HDL₃。在實驗前，CER-001和HDL3制劑等分為至少8等分/脂蛋白濃度(每組注射使用1等分試樣)。在注射之前，制劑的一個等分試樣通過在約37℃水浴中溫育5分鐘并輕輕晃動解凍。該制劑不能震蕩或劇烈攪拌，以避免起泡。如果溶液混濁，或者如果觀察到可見顆粒物，將溶液在約37℃水浴中溫育額外的半小時。

制備磷酸緩沖蔗糖稀釋劑(10mM磷酸鹽，4％的蔗糖和2％甘露醇，pH值＝7.4)溶液，等分并儲存在約-20℃。安慰劑溶液用于制備不同濃度的CER-001和HDL₃。

9.2.2動物

在這些研究中所用的動物是C57Bl/6-B6.129P2-Apoetm1Unc/J品系小鼠。該品系來源于Jackson實驗室，并且由Charles River分配。此物種和品系是用于膽固醇代謝研究的充分表征了的模型。納入標準包括重量：21克(8周齡)，23克(9周齡)和25克數(shù)(3個月齡)；年齡：在開始飲食前8、9和12周，性別和數(shù)目：雄性，n＝125(每組12只小鼠)。

動物飼養(yǎng)在Prolog Biotech的動物房中，按最大12只動物/籠的組。Prolog Biotech具有從法國獸醫(yī)主管部門獲得的協(xié)議編號A-31-254-01。在每個籠子中，為了動物的福利添加2個圓頂。動物在研究開始前5天進行馴化(從09/18到09/23)。動物接觸到水和高膽固醇飲食(0.2％膽固醇，39.9％的脂肪，14.4％的蛋白質(zhì)，45.7％的糖)。類似地管理所有的動物并根據(jù)Prolog Biotech的動物房的通常實踐適當考慮它們的福利。這項研究計劃已經(jīng)被Prologue Biotech Ethical Committee(N℃EF-2011-CER-09)接受。

動物室條件如下：溫度：21±1℃，相對濕度50±10％，和亮/暗循環(huán)：12小時/12小時(07H/19H)。每個月編輯動物室條件的報告。每周稱重每只動物。動物通過在實驗開始時插入耳環(huán)來鑒定。

9.2.3處理

將動物分成10組，每組12只動物，并如表4所示進行處理。

將制劑注入到用異氟烷麻醉的小鼠的眶后靜脈(50μL/每只小鼠)，每2天一次，注射8次。施用的劑量是基于在每個籠子中小鼠體重的平均值。所述化合物在每天上午10點注射。對于血液取樣，以所指示的劑量對禁食過夜的小鼠采樣：(1)通過框后抽取在前劑量時(上午9點)：第一次注射/手術(shù)日前24小時；(2)通過框后抽取在前劑量(上午9點)：最后一次注射后24小時；和(3)在第5次注射后在t＝0(9AM)和指定的時間點通過尾部抽血。血液樣品在采集后立即保持在約+4℃，以避免血液樣品的改變。血樣離心(在+4℃800×g下離心10分鐘)，并且保存血漿以用于未來分析。

9.2.4手術(shù)

對于器官采集，在最后一次注射后24小時，腹膜內(nèi)注射氯胺酮(100mg/kg)和賽拉嗪(10mg/kg)的混合物麻醉小鼠，并且動物在2或3分鐘后入睡。血液通過毛細作用(眶后靜脈，大約200μl血液)抽取并轉(zhuǎn)移到含有EDTA的管中。然后，進行腹胸切口。通過右心室進行第一次清洗，必要時通過左心室，然后對心臟灌注PBS。液體應當通過胸主動脈流動。

取出左和右頸動脈，肝，脾，和連接到心臟的主動脈并儲存在-80℃。肝臟被收集在四個不同的等分試樣中。剩下的生物標本在器官采集后丟棄。對于糞便收集，在每個組進行最后一次注射的當天，對籠更換新的稻草，并持續(xù)24小時(處死當天)收集糞便。

9.2.5測定血漿總膽固醇

實驗程序：在每個管中添加膽固醇標準品(2g/L)：0/0.625/1.25/1.875/2.5/3.75/5μl。在12,000xg離心血漿樣品1分鐘。根據(jù)物種，如表5所示添加樣品至每個管中。添加0.5mL重構(gòu)的緩沖液至每個管(標準品和樣品)，渦旋并在37℃下溫育5分鐘。從每個管轉(zhuǎn)移150μl至96孔板中的2個不同的孔。在500nm讀取吸光度。

9.2.6測定在血漿中的非酯化膽固醇

實驗程序：在每個管中添加膽固醇標準品(2g/L)：0/0.625/1.25/1.875/2.5/3.75/5μl。在12,000xg離心血漿樣品1分鐘。根據(jù)物種，如表6所示添加樣品至每個管中。添加0.5mL重構(gòu)的緩沖液至每個管(標準品和樣品)，渦旋并在37℃下溫育5分鐘。從每個管轉(zhuǎn)移150μl至96孔板中的2個不同的孔。在500nm讀取吸光度。

9.2.7通過RP C18HPLC測定膽固醇

設備：HPLC(Waters Binary HPLC pump 1525,Waters UV/Visible detector 2489,Waters Sample manager 2767,Masslynx軟件(4.1)，柱：RP C18 Zorbax 4.6mm×25厘米，粒度10μm(或相當?shù)?，乙腈HPLC級，無水乙醇，水(milliQ)，標準膽固醇為無水乙醇中的0.1g/l。

層析參數(shù)：洗脫液A：86％乙腈，10％乙醇，4％水；洗脫液B：86％乙腈，14％乙醇。在使用前在超聲波器水浴中超聲處理洗脫液5分鐘。流速：1.5mL/min；壓力：1400PSI；檢測：UV 214nm；運行時間：20分鐘；注射：25至100μL；在表7顯示梯度程序：

樣品：樣品是根據(jù)第9.2.8節(jié)的方法制備。添加50μl的乙醇提取物到微瓶中，注入40μl到HPLC。在214nm確定峰面積并計算在提取物中的濃度：[膽固醇樣品(μg/μl)＝峰面積/斜率/注射體積

9.2.8從肝臟提取膽固醇

步驟1：稱量約50mg肝，將組織引入到玻璃管中。在3ml MeOH中均漿組織。

EDTA 5mM(2：1)。添加3mL氯仿和3mL H₂O并渦旋五分鐘。1,500xg離心10min，并收集下相。將溶液等體積(2×1.3mL)分配在2個玻璃管(小)中。

步驟2：如下處理溶液：

未酯化的膽固醇：干燥溶液。添加400μl EtOH以用于樣品的增溶。

總膽固醇：干燥溶液。添加1ml 0.5M甲醇KOH溶液。在60℃溫育至少1小時。通過添加1mL氯仿和1ml H₂O到樣品中，渦旋，在1,500xg離心10分鐘并收集下層相來執(zhí)行Bligh和Dyer脂質(zhì)提取。干燥有機相。添加400μlEtOH以用于樣品的增溶。

9.2.9從頸動脈或主動脈提取膽固醇

步驟1：取出手術(shù)帶(只針對頸動脈)并將組織引入到玻璃管中。加1.8mL CHCl₃/MeOH(2:1)(對于頸動脈)或3mL(對于主動脈)。在4℃混合過夜。

步驟2：去除，干燥，稱重頸動脈或主動脈。將有機溶液(CHCl₃/MeOH)等體積分配在2個玻璃管(小)中。如下處理溶液：

未酯化的膽固醇：干燥溶液。添加200μl EtOH以用于樣品的增溶。

總膽固醇：干燥溶液。添加1ml 0.1M乙醇KOH溶液。在60℃溫育至少1小時。通過添加1mL氯仿和1ml H₂O到樣品中，渦旋，在1,500xg離心10分鐘并收集下層相來執(zhí)行Bligh和Dyer脂質(zhì)提取。干燥有機相。添加200μl EtOH以用于樣品的增溶。

9.3體內(nèi)斑塊進展研究A-F的結(jié)果

9.3.1研究A：測定在結(jié)扎的左頸動脈中的動脈粥樣硬化斑塊

本研究檢查CER-001施用對來自用高脂肪飲食喂養(yǎng)的apoE^-/-小鼠的經(jīng)結(jié)扎的頸動脈斑塊進展的影響。對于每組小鼠，在脂質(zhì)提取和HPLC分析后測試了頸動脈的膽固醇含量。結(jié)扎的頸動脈收集于處死的當天，并保存在-80℃。脂質(zhì)用有機溶液萃取，通過HPLC測定膽固醇濃度。

經(jīng)結(jié)扎的頸動脈是根據(jù)第9.2.9節(jié)的方法提取脂質(zhì)的。從頸動脈(鮮重)中除去手術(shù)帶，并將組織引入到玻璃管中。對這添加1.8mL CHCl₃/MeOH(2:1)并在4℃混合過夜。然后取出頸動脈，干燥并稱重，將有機溶液(CHCl₃/MeOH)等體積分到兩個玻璃管中。對于未酯化的膽固醇(UC)，添加100μLβ谷甾醇(內(nèi)標)并將溶液干燥。對這添加200μL EtOH，以用于樣品的增溶，并通過HPLC分析樣品UC。對于總膽固醇(TC)，添加100μLβ谷甾醇(內(nèi)標)并將溶液干燥。對這添加1mL 0.1M甲醇KOH溶液，并在60℃下溫育該溶液至少30分鐘。進行Bligh和Dyer方法以用于膽固醇萃取，其中添加1mL氯仿，隨后是1mL H₂O，并通過渦旋混合。當進行相分離時，收集下層相并干燥。對這添加200μL EtOH以用于樣品的增溶并用HPLC分析TC。膽固醇濃度通過HPLC根據(jù)第9.2.7的方法測定。簡言之，注射50μl至C18Zorbax:SB-C18 4,6X250mm(Agilent ref 880975-902)柱。流速為以60％的洗脫液A(ACN/ETOH/H₂O 85/10/5)和40％的洗脫液B(ACN/ETOH 86/14)1.5mL/min。運行時間為55分鐘，膽固醇的保留時間為22.85分鐘，和β谷甾醇的保留時間為32.2分。系統(tǒng)：設定在214nm處的二元泵Waters 1525-UV檢測器-軟件：Massslynx 4.1。

在用CER-001或HDL₃處理的小鼠中觀察到了結(jié)扎頸動脈中的膽固醇含量的相似概貌(圖47和圖48)。對于2，5和10mg/kg濃度，觀察到未酯化膽固醇降低25％，并觀察到經(jīng)結(jié)扎的頸動脈中總膽固醇含量降低50％。用20和50mg/kg劑量的CER-001或HDL₃處理，斑塊進展的抑制是約10％。

9.3.2研究B：測定CER-001輸注后血漿膽固醇流通

這項研究檢查了CER-001施用對用高脂肪飲食喂養(yǎng)的apoE^-/-小鼠的脂蛋白概貌的影響。在第5次輸注后的不同時間點收集和分析血液。還比較了劑量前血漿(第一次注射之前)和劑量后血漿(最后一次注射后24小時)。分析血漿的總膽固醇，未酯化的膽固醇和人ApoA-I含量。

根據(jù)章節(jié)9.2.5和9.2.6的方法分別測定總的和未酯化的膽固醇濃度。在從總膽固醇中減去未酯化的膽固醇后測定膽固醇酯濃度。在第5次施用(注射前1小時；注射后1小時，2小時，4小時和24小時)后，測定每組12只小鼠的膽固醇流通。動物禁食過夜。

在輸注CER-001或HDL₃后，未觀察到總血漿膽固醇流通的顯著變化(圖49和圖50)。在CER-001和HDL₃輸注后未觀察到未酯化膽固醇流通的顯著變化(圖51和圖52)。在輸注后2和4小時，50mg/kg的CER-001似乎增加血漿未酯化的膽固醇濃度。

CER-001和HDL₃的劑量后概貌是相似的，除了與HDL₃處理的小鼠相比，在經(jīng)CER-001處理的動物中總的和未酯化的膽固醇濃度高兩倍(圖53和圖54)。與安慰劑相比，10mg/kg以上劑量的CER-001在8次注射后增加小鼠血漿中的膽固醇濃度。HDL₃輸注沒有將膽固醇濃度增加得高于安慰劑。

9.3.3研究C：血漿人ApoA-I的測定

本研究通過測定輸注CER-001后血漿中人ApoA-I的濃度來檢查CER-001輸注的動力學。根據(jù)制造商的說明書，通過ELISA(Assay Pro EA5201-1)測定血漿中的ApoA-I濃度。在ApoA-I測定之前，取決于注射到小鼠中的CER-001和HDL₃濃度，將血漿稀釋1/100,1/50或1/10。

使用CER-001觀察到人ApoA-I血漿濃度的劑量依賴性增加。所有測試濃度均恢復了血漿中ApoA-I的預期劑量(圖55)。對于HDL3，觀察到人ApoA-I血漿濃度的劑量依賴性增加(圖56)。然而，人血漿ApoA-I比預期劑量是小3倍濃縮的。

9.3.4研究D：Western印跡測定ABCA1在結(jié)扎的頸動脈中的表達

本研究檢查ABCA1的表達是否可以與膽固醇含量的差異相關，因為在小鼠結(jié)扎的頸動脈中觀察到膽固醇含量的降低(5mg/kg CER-001)和無影響(50mg/kg CER-001)。先前用氯仿：甲醇提取的經(jīng)結(jié)扎的頸動脈溶解在NAOH 0.1N(100μL/頸動脈)中。將溶液短暫超聲處理并在15,000×g離心10分鐘。用Bradford測定法測定蛋白質(zhì)濃度，并將40μg樣品上樣到SDS-PAGE上。使用軟件定量ABCA1表達(ab7360-稀釋度1/1000)。

對于50mg/kg劑量的CER-001和HDL₃，觀察到頸動脈ABCA1含量的減少(圖57)。5mg/kg劑量的CER-001和HDL3不影響ABCA1表達。針對50mg/kg CER-001和HDL₃劑量，經(jīng)結(jié)扎頸動脈中的ABCA1表達下調(diào)。那些巨噬細胞的膽固醇排出可能已經(jīng)受損，這可以解釋在50mg/kg濃度下對斑塊膽固醇含量沒有影響的原因。

9.3.5研究E：在小鼠肝臟中SR-BI和ABCA1的測定

本研究檢查了最后一次注射CER-001后24小時在肝臟中的SR-BI和ABCA1蛋白含量。通過短暫超聲處理在PBS(500μL)中裂解肝臟塊(50mg)。將樣品離心(800×g，10分鐘)，棄去沉淀。將上清液在4℃以16,000xg離心30分鐘，沉淀用PBS 1％Triton X100(200μL)溶解。將10μg溶解的沉淀物裝載在SDS PAGE 10％上，并使用軟件定量ABCA1表達(ab7360-稀釋1/1000)或SR-BI表達(ab24603-稀釋1/1000)。

與ABCA1頸動脈含量相反，隨著CER-001濃度的增加，在小鼠肝臟中觀察到ABCA1蛋白水平的增加(圖58)。這種差異可以解釋為：i)細胞群是不同的；在頸動脈中，細胞群由巨噬細胞和內(nèi)皮細胞組成；在肝臟中，細胞群大多數(shù)是肝細胞，ii)CER-001的形式及其功能在兩種情況下是不同的；對于頸動脈，在膽固醇中的CER-001是裝載不足的，并且其功能是從細胞中排出膽固醇；對于肝臟，CER-001是膽固醇裝載的，并且其功能將被肝臟消除。因為ABCA1表達受膽固醇含量的嚴格調(diào)控，我們假設在膽固醇不良環(huán)境(例如高膽固醇流出)中，ABCA1表達降低，并且在富含膽固醇的環(huán)境(膽固醇攝取)中，ABCA1表達增加。對于SR-BI，隨著CER-001濃度的增加，沒有觀察到蛋白質(zhì)水平的顯著變化(圖59)。

9.3.6研究F：小鼠糞便中膽固醇含量的測定

本研究分析了針對不同濃度的CER-001和HDL₃，小鼠糞便中的膽固醇含量。糞便通過脂質(zhì)提取并通過HPLC分析其膽固醇含量。糞便(200mg)溶解在甲醇：水(50:50)溶液中，并與混合1分鐘。將溶液冷凍并凍干過夜。第二天，加入4mL氯仿/甲醇(2:1)，將溶液在4℃下混合24小時。對這加入水(1.33mL)，然后將溶液混合并在3700×g離心3分鐘。保存有機相并干燥。將沉淀溶解在無水乙醇(2mL)中，并在筒AC 0.2μm上過濾。根據(jù)第9.2.7節(jié)的方法分析樣品中的膽固醇濃度。

對于用CER-001和HDL₃注射的小鼠，觀察到糞便中膽固醇含量的劑量依賴性增加(圖60)。在10mg/kg的濃度觀察到最大膽固醇排出。

10.實施例4：CER-001在患有低α-脂蛋白血癥的患者中的臨床試驗

10.1背景

Cerenis在由于遺傳缺陷(包括Tangier病患者和兩個ABCA1雜合子)導致的低-α-脂蛋白血癥患者中完成了一些早期臨床試驗工作。

在“誘導期”期間，由于RLT途徑中的終身缺乏而在全身血管壁中捕獲的膽固醇的負荷應當隨每一個重復的劑量逐漸減少，并且在其中LDL水平被充分控制的患者中動脈粥樣硬化斑塊應該退化。治療將以減少的給藥間隔(“維持期”)長期地持續(xù)，以維持適當?shù)哪懝檀挤€(wěn)態(tài)-即，通過內(nèi)源性LDL-C進行的向組織的遞送和通過輸注的CER-001前-β-樣HDL顆粒進行的除去之間的平衡。CER-001治療可以是終生的，因為憑借遺傳因果關系，HDL產(chǎn)生和RLT中的先天缺陷是永久性的。

下表8顯示了試驗(稱為SAMBA試驗)中所包括的患者的概貌。

患者最初在強烈的“誘導期”進行治療，在4周內(nèi)以8mg/kg的劑量接受9劑的CER-001。在該誘導期后，用脂蛋白概貌和MRI掃描重新評估研究的受試者。隨后，研究的受試者繼續(xù)在“維持期”基序每兩周一次治療持續(xù)6個月的總治療。此時，重復脂蛋白譜和MRI掃描。

10.2結(jié)果

在圖68A-68G和圖69A-69G中按逐個受試者顯示了CER-001對通過LCAT導致的膽固醇流通和膽固醇酯化的影響。

缺乏ApoA-I基因(純合子，ApoA-I-/-)的受試者1在8mg/Kg的一劑CER-001后顯示膽固醇流通，LCAT激活和糞便膽固醇消除。

沒有ABCA1基因(純合子ABCA1-/-)且患有Tangier病的受試者7在8mg/Kg的一劑CER-001后顯示膽固醇流通和LCAT活化。在該患者中未測試糞便膽固醇消除。

圖70和圖71分別顯示了在治療一個月后逐個患者的平均頸動脈和主動脈血管壁厚度。頸動脈的平均血管壁厚度在誘導治療一個月后下降了-6.4％，并且主動脈的平均血管壁厚度在誘導治療一個月后下降了平均-4.6％。純合的ApoA-I缺乏患者經(jīng)歷頸動脈平均血管壁厚度的-17％消退。圖72顯示6個月后的平均血管壁厚度。通過3Tesla MRI測定平均血管壁厚度。

該試驗證明了在這些受試者中機制(即，CER-001執(zhí)行RLT途徑的所有步驟)的證據(jù)以及積極治療效果的證據(jù)，特別是在一個月強化治療后頸動脈內(nèi)膜–中膜壁厚度減少，其在具有影響最重大的缺陷(純合ABCA1缺陷)的受試者中，與他汀類未治療的高膽固醇血受試者中治療兩年后看到的降低相當。重要的是，觀察到的減少在標準護理(加強的個體化脂質(zhì)管理)之上看到。重要的是，在另外5個月的維持治療后，觀察到持續(xù)的和累積的益處，這支持具有家族性低α-脂蛋白血癥的患者終生需要長期ApoA-I替代療法的治療原理。在ABCA1缺陷中，在不存在ABCA1或不存在ABCA1功能的情況下，膽固醇仍然流出到CER-001，這可能是因為存在通過其他受體(如但不限于ABCG1)的排出途徑的冗余。

具體實施方式

在以下編號段落中闡述的實施方案中描述了本公開的各個方面。

1.鑒定有效地使受試者中的膽固醇流通的HDL治療劑劑量的方法，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的第一劑量至受試者，(b)在施用所述第一劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應；并且(c)(i)如果將受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過截留量，則施用所述HDL治療劑的第二劑量，其中所述HDL治療劑的第二劑量低于第一劑量；或(ii)如果沒有將受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過截留量，則用所述HDL治療劑的第一劑量治療受試者。

2.用于在受試者中監(jiān)測HDL治療劑的功效的方法，該方法包括：(a)根據(jù)第一給藥日程表用HDL治療劑治療受試者，(b)測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一給藥日程表對所述表達水平的效應；及(c)(i)如果將受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過上截留量(upper cutoff amount)，則根據(jù)第二給藥日程表用HDL治療劑治療受試者，其中所述第二給藥日程表包含以下的一個或多個：施用HDL治療劑的較低劑量，在一段較長的時間中將HDL治療劑輸注到受試者中，并且不太頻繁地施用HDL治療劑至受試者；(ii)如果沒有將受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過下截留量(lower cutoff amount)，則根據(jù)第二給藥日程表用HDL治療劑治療受試者，其中所述第二給藥日程表包含以下的一個或多個：施用HDL治療劑的較高劑量，在一段較短的時間中將HDL治療劑輸注到受試者中，并且較頻繁地施用HDL治療劑至受試者；或(iii)如果將受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低在上截留量和下截留量之間的量，則根據(jù)第一給藥日程表持續(xù)治療受試者。

3.實施方案1或?qū)嵤┓桨?的方法，其中所述截留量是相對于在所述施用之前受試者的自身基線。

4.實施方案1或?qū)嵤┓桨?的方法，其中所述截留量是相對于對照量。

5.實施方案4的方法，其中所述對照量是群體平均值。

6.實施方案5的方法，其中所述群體平均值來自健康受試者。

7.實施方案5的方法，其中所述群體平均值來自與受試者具有相同疾病狀況的群體。

8.鑒定有效地使膽固醇流通的劑量HDL治療劑的方法，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的第一劑量至受試者群體，(b)在施用所述第一劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應；(c)施用所述HDL治療劑的第二劑量，其中所述HDL治療劑的第二劑量高于或低于第一劑量；(d)在施用所述第二劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一劑量和/或第二劑量對所述表達水平的效應；(e)任選地，用所述HDL治療劑的一個或多個額外劑量重復步驟(c)和(d)；和(f)鑒定沒有將一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過截留量的最高劑量，從而鑒定有效地使膽固醇流通的HDL治療劑劑量。

9.實施方案8的方法，其中所述步驟(d)包括在施用所述第二個劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應。

10.實施方案1-9中任一項的方法，進一步包括在施用所述第二劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第二劑量對所述表達水平的效應。

11.實施方案10的方法，其中如果將受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過截留量，則施用所述HDL治療劑的第三劑量，其中所述HDL治療劑的第三劑量低于第二劑量。

12.用于治療需要HDL治療劑的受試者的方法，該方法包括對受試者施用以下的組合：(a)下述劑量的任選作為脂蛋白復合物的HDL治療劑，與所述受試者的基線量相比，所述劑量沒有將在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達降低超過20％或10％；和(b)膽固醇降低療法，任選地選自膽汁酸樹脂，煙酸(niacin)，他汀類(statin)，貝特類(fibrate)，PCSK9抑制劑，依澤替米貝(ezetimibe)，和CETP抑制劑。

13.實施方案12的方法，其中所述HDL治療劑是脂蛋白復合物。

14.用于治療需要HDL治療劑的受試者的方法，該方法包括對受試者施用以下的組合：(a)下述劑量的任選作為脂蛋白復合物的HDL治療劑，與對照量相比，所述劑量沒有將在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達降低超過20％或10％；和(b)膽固醇降低療法，任選地選自膽汁酸樹脂，煙酸，他汀類，貝特類，PCSK9抑制劑，依澤替米貝，和CETP抑制劑。

15.實施方案14的方法，其中所述HDL治療劑是脂蛋白復合物。

16.實施方案14或15的方法，其中所述對照量是群體平均值。

17.實施方案16的方法，其中所述群體平均值來自健康受試者。

18.實施方案16的方法，其中所述群體平均值來自與受試者具有相同疾病狀況的群體。

19.實施方案1至18中任一項的方法，其中所述受試者是人或受試者群體是人類受試者群體。

20.實施方案1至18中任一項的方法，其中所述受試者是非人動物，或所述受試者群體是非人動物群體。

21.實施方案20的方法，其中所述非人動物是小鼠。

22.實施方案1至21中任一項的方法，其中所述至少一種HDL標志物是ABCA1。

23.實施方案22的方法，其中測量ABCA1 mRNA的表達水平。

24.實施方案22的方法，其中測量ABCA1蛋白的表達水平。

25.實施方案22至24中任一項的方法，其中所述ABCA1截留量為20％-80％。

26.實施方案25的方法，其中所述ABCA1截留量為30％-70％。

27.實施方案26的方法，其中所述ABCA1截留量為40％-60％。

28.實施方案27的方法，其中所述ABCA1截留量為50％。

29.實施方案22至28中任一項的方法，其中在施用所述第一劑量或所述第二劑量后2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時測量ABCA1表達水平。

30.實施方案1至29中任一項的方法，其中所述至少一種HDL標志物是ABCG1。

31.實施方案30的方法，其中測量ABCG1 mRNA表達水平。

32.實施方案30的方法，其中測量ABCG1蛋白表達水平。

33.實施方案30至32中任一項的方法，其中所述ABCG1截留量為20％-80％。

34.實施方案33的方法，其中所述ABCG1截留量為30％-70％。

35.根據(jù)實施方案34所述的方法，其中所述ABCG1截留量為40％-60％。

36.實施方案35的方法，其中所述ABCA1截留量為50％。

37.實施方案30至36中任一項的方法，其中在施用后2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時測量ABCG1表達水平。

38.實施方案1至37中任一項的方法，其中所述至少一種HDL標志物是SREBP-1。

39.實施方案38的方法，其中測量SREBP-1mRNA表達水平。

40.實施方案38的方法，其中測量SREBP-1蛋白表達水平。

41.實施方案38至40中任一項的方法，其中所述SREBP-1截留量為20％-80％。

42.實施方案41的方法，其中所述SREBP-1截留量為30％-70％。

43.實施方案42的方法，其中所述SREBP-1截留量為40％-60％。

44.實施方案43的方法，其中所述SREBP-1截留量為50％。

45.實施方案38至44中任一項的方法，其中測量施用后2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時的SREBP-1表達水平。

46.實施方案1至45中任一項的方法，其中所述HDL治療劑是脂蛋白復合物。

47.實施方案46的方法，其中所述脂蛋白復合物包含載脂蛋白。

48.實施方案47的方法，其中所述載脂蛋白是ApoA-I，ApoA-II，ApoA-IV，ApoE或其組合。

49.實施方案46的方法，其中所述脂蛋白復合物包含載脂蛋白肽模擬物。

50.實施方案49的方法，其中所述肽模擬物是ApoA-I，ApoA-II，ApoA-IV或ApoE肽模擬物或其組合。

51.實施方案46的方法，其中所述脂蛋白復合物是CER-001，CSL-111，CSL-112或ETC-216。

52.實施方案1至45中任一項的方法，其中所述HDL治療劑是小分子。

53.實施方案52的方法，其中所述小分子是CETP抑制劑。

54.實施方案52的方法，其中所述小分子是泛酸衍生物。

55.實施方案1至46中任一項的方法，其還包括確定截留量。

56.實施方案55的方法，其中通過產(chǎn)生針對HDL治療劑的劑量反應曲線來確定所述截留量。

57.實施方案56的方法，其中所述截留量為導致劑量反應曲線中的拐點的劑量的25％-75％。

58.實施方案57的方法，其中所述截留量為導致劑量反應曲線中的拐點的劑量的40％-60％。

59.實施方案1至58中任一項的方法，其中所述受試者或受試者群體具有ABCA1缺陷。

60.實施方案59的方法，其中所述受試者或受試者群體對于ABCA1突變是純合的。

61.實施方案59的方法，其中所述受試者或受試者群體對于ABCA1突變是雜合的。

62.鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者，(b)在每個劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平；和(c)鑒定沒有使所述一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過0％，超過10％或超過20％的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

63.鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者群體，(b)在每個劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平；和(c)鑒定沒有使所述一種或多種HDL標志物的表達水平在所述受試者中增加超過0％，超過10％或超過20％的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

64.鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法，該方法包括：鑒定沒有使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最高劑量。

65.實施方案64的方法，其包括：(a)施用一個或多個劑量的HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定不會使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

66.鑒定適合于療法的HDL治療劑的給藥間隔的方法，該方法包括：鑒定不會使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最頻繁的給藥日程表的最高劑量。

67.實施方案66的方法，其包括：(a)根據(jù)一個或多個給藥頻率施用HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定沒有使所述受試者中的膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的最大給藥頻率，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

68.實施方案67的方法，其中一個或多個給藥頻率包括選自以下的一個或多個給藥頻率：(a)每2天以1-4小時輸注施用；(b)每3天以1-4小時輸注施用；(c)每周日以24小時輸注施用；和(d)每兩周以24小時輸注施用。

69.實施方案65至68中任一項的方法，其中在來自所述受試者或受試者群體的單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中測量所述膽固醇流出。

70.治療具有ABCA1缺陷的受試者的方法，該方法包括對受試者施用治療有效量的HDL治療劑。

71.實施方案70的方法，其中所述HDL治療劑是CER-001。

72.實施方案70或71的方法，其中所述受試者對于ABCA1突變是雜合的。

73.實施方案70或71的方法，其中所述受試者對于ABCA1突變是純合的。

74.治療患家族原發(fā)性低α-脂蛋白血癥的受試者的方法，該方法包括：(a)根據(jù)誘導方案對受試者施用HDL治療劑；和隨后(b)根據(jù)維持方案對受試者施用HDL治療劑。

75.實施方案74的方法，其中所述維持方案需要以較低劑量，較低頻率或兩者施用所述HDL治療劑。

76.實施方案74或?qū)嵤┓桨?5的方法，其中所述受試者對于ABCA1突變是雜合的。

77.實施方案74或?qū)嵤┓桨?5的方法，其中所述受試者對于ABCA1突變是純合的。

78.實施方案74至77中任一項的方法，其中所述受試者對于LCAT突變是純合的或雜合的。

79.根據(jù)實施方案74至78中任一項所述的方法，其中所述受試者對于ApoA-I突變是純合的或雜合的。

80.實施方案74至79中任一項的方法，其中所述受試者對于ABCG1突變是純合的或雜合的。

81.實施方案74至80中任一項的方法，其中也用脂質(zhì)控制藥物治療所述受試者。

82.實施方案81的方法，其中所述脂質(zhì)控制藥物是阿托伐他汀，依澤替米貝，煙酸，羅舒伐他汀，辛伐他汀，阿司匹林，氟伐他汀，洛伐他汀，普伐他汀或它們的組合。

83.實施方案74至82中任一項的方法，其中所述HDL治療劑是CER-001。

84.實施方案83的方法，其中所述誘導方案的持續(xù)時間是4周。

85.實施方案83或?qū)嵤┓桨?4的方法，其中所述誘導方案包括每周施用CER-001三次。

86.實施方案83至85中任一項的方法，其中在誘導方案中施用的劑量為8-15mg/kg(基于蛋白質(zhì)重量)。

87.實施方案86的方法，其中在誘導方案中施用的劑量是8mg/kg，12mg/kg或15mg/kg。

88.實施方案83至87中任一項的方法，其中所述維持方案包括施用HDL治療劑至少一個月，至少兩個月，至少三個月，至少六個月，至少一年，至少18個月，至少兩年，或無限期。

89.實施方案83至88中任一項的方法，其中所述維持方案包括每周施用CER-001兩次。

90.實施方案83至89中任一項的方法，其中在維持方案中施用的劑量為1-6mg/kg(基于蛋白質(zhì)重量)。

91.實施方案90的方法，其中在維持方案中施用的劑量是1mg/kg，3mg/kg或6mg/kg。

92.實施方案74至91中任一項的方法，其中，(a)誘導方案利用與受試者的基線量和/或群體平均值相比，使一種或多種HDL標志物的表達水平降低20％-80％或40％-60％的劑量；和/或(b)其中維持方案利用與受試者的基線量和/或群體平均值相比沒有使一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過20％或超過10％的劑量。

93.實施方案92的方法，其中維持方案利用沒有降低一種或多種HDL標志物的表達水平的劑量。

94.HDL治療劑，其在用于鑒定有效使受試者中的膽固醇流通的所述HDL治療劑的劑量的方法中的用途，該方法包括：

(a)施用所述HDL治療劑的第一劑量至受試者，

(b)在施用所述第一劑量后，測量所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中的一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應；并且

(c)(i)如果將所述受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過截留量，則施用所述HDL治療劑的第二劑量，其中所述HDL治療劑的所述第二劑量低于所述第一劑量；或

(ii)如果沒有將所述受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過所述截留量，則用所述HDL治療劑的所述第一劑量治療所述受試者。

95.HDL治療劑，其在用于在受試者中監(jiān)測所述HDL治療劑的功效的方法中的用途，該方法包括：

(a)根據(jù)第一給藥日程表用所述HDL治療劑治療受試者，

(b)測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一給藥日程表對所述表達水平的效應；并且

(c)(i)如果將所述受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過上截留量(upper cutoff amount)，則根據(jù)第二給藥日程表用所述HDL治療劑治療所述受試者，其中所述第二給藥日程表包含以下的一個或多個：施用所述HDL治療劑的較低劑量，在一段較長的時間中將所述HDL治療劑輸注到所述受試者中，并且不太頻繁施用所述HDL治療劑至所述受試者；

(ii)如果沒有將所述受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過下截留量(lower cutoff amount)，則根據(jù)第二給藥日程表用所述HDL治療劑治療所述受試者，其中所述第二給藥日程表包含以下的一個或多個：施用所述HDL治療劑的較高劑量，在一段較短的時間中將所述HDL治療劑輸注入所述受試者中，并且較頻繁地施用所述HDL治療劑至所述受試者；或

(iii)如果將所述受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低介于上截留量和下截留量之間的量，則根據(jù)所述第一給藥日程表持續(xù)治療所述受試者。

96.用于實施方案94或?qū)嵤┓桨?5的用途的HDL治療劑，其中所述截留量是相對于在所述施用之前所述受試者的自身基線。

97.用于實施方案94或?qū)嵤┓桨?5的用途的HDL治療劑，其中所述截留量是相對于對照量。

98.用于實施方案97的用途的HDL治療劑，其中所述對照量是群體平均值。

99.用于實施方案98的用途的HDL治療劑，其中所述群體平均值來自健康受試者。

100.用于實施方案98的用途的HDL治療劑，其中所述群體平均值來自與所述受試者具有相同疾病狀況的群體。

101.HDL治療劑，其在用于鑒定有效使膽固醇流通的HDL治療劑劑量的方法中的用途，該方法包括：

(a)施用HDL治療劑的第一劑量至受試者群體，

(b)在施用所述第一劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應；

(c)施用所述HDL治療劑的第二劑量，其中所述HDL治療劑的所述第二劑量高于或低于所述第一劑量；

(d)在施用所述第二劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一劑量和/或第二劑量對所述表達水平的效應；

(e)任選地，用所述HDL治療劑的一個或多個額外劑量重復步驟(c)和(d)；并且

(f)鑒定沒有將一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過截留量的最高劑量，從而鑒定有效地使膽固醇流通的所述HDL治療劑的劑量。

102.實施方案101的方法，其中所述步驟(d)包括在施用所述第二劑量后測量所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第一劑量對所述表達水平的效應。

103.用于實施方案94至101中任一項的用途的HDL治療劑，所述方法還包括在施用所述第二劑量后測量所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平，以評估所述第二劑量對所述表達水平的效應。

104.用于實施方案102的用途的HDL治療劑，其中如果將所述受試者的一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過截留量，則施用所述HDL治療劑的第三劑量，其中所述HDL治療劑的所述第三劑量低于所述第二劑量。

105.HDL治療劑，其任選是脂蛋白復合物，用于在用于治療需要HDL治療劑的受試者的方法中使用，該方法包括對所述受試者施用以下的組合：

(a)下述劑量的所述HDL治療劑，與所述受試者的基線量或?qū)φ樟肯啾?，所述劑量沒有將在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達降低超過20％或10％；和

(b)膽固醇降低療法，任選地選自膽汁酸樹脂，煙酸(niacin)，他汀類(statin)，貝特類(fibrate)，PCSK9抑制劑，依澤替米貝(ezetimibe)，和CETP抑制劑。

106.用于實施方案105的用途的HDL治療劑，其是脂蛋白復合物。

107.用于實施方案105或106的用途的HDL治療劑，其中比較量是所述受試者的基線量。

108.用于實施方案105或106的用途的HDL治療劑，其中比較量是對照量，并且是群體平均值。

109.用于實施方案108的用途的HDL治療劑，其中所述群體平均值來自健康受試者。

110.用于實施方案108的用途的HDL治療劑，其中所述群體平均值來自與所述受試者具有相同疾病狀況的群體。

111.用于實施方案94至110中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述受試者是人或所述受試者群體是人受試者群體。

112.用于實施方案94至110中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述受試者是非人動物，或所述受試者群體是非人動物群體。

113.用于實施方案112的用途的HDL治療劑，其中所述非人動物是小鼠。

114.用于實施方案94至113中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述至少一種HDL標志物是ABCA1。

115.用于實施方案114的用途的HDL治療劑，其中測量ABCA1 mRNA的表達水平。

116.用于實施方案114的用途的HDL治療劑，其中測量ABCA1蛋白的表達水平。

117.用于實施方案114至116中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述ABCA1截留量為20％-80％。

118.用于實施方案117的用途的HDL治療劑，其中所述ABCA1截留量為30％-70％。

119.用于實施方案118的用途的HDL治療劑，其中所述ABCA1截留量為40％-60％。

120.用于實施方案119的用途的HDL治療劑，其中所述ABCA1截留量為50％。

121.用于實施方案114至120中任一項的用途的HDL治療劑，其中在施用所述第一劑量或所述第二劑量后2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時測量ABCA1表達水平。

122.用于實施方案94至121中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述至少一種HDL標志物是ABCG1。

123.用于實施方案122的用途的HDL治療劑，其中測量ABCG1 mRNA表達水平。

124.用于實施方案122的用途的HDL治療劑，其中測量ABCG1蛋白表達水平。

125.用于實施方案122至124中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述ABCG1截留量為20％-80％。

126.用于實施方案125的用途的HDL治療劑，其中所述ABCG1截留量為30％-70％。

127.用于實施方案126的用途的HDL治療劑，其中所述ABCG1截留量為40％-60％。

128.用于實施方案127的用途的HDL治療劑，其中所述ABCA1截留量為50％。

129.用于實施方案122至128中任一項的用途的HDL治療劑，其中在施用后2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時測量ABCG1表達水平。

130.用于實施方案94至129中任一項的用途的HDL治療劑，其中至少一種HDL標志物是SREBP-1。

131.用于實施方案130的用途的HDL治療劑，其中測量SREBP-1mRNA表達水平。

132.用于實施方案130的用途的HDL治療劑，其中測量SREBP-1蛋白表達水平。

133.用于實施方案130至132中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述SREBP-1截留量為20％-80％。

134.用于實施方案133的用途的HDL治療劑，其中所述SREBP-1截留量為30％-70％。

135.用于實施方案134的用途的HDL治療劑，其中所述SREBP-1截留量為40％-60％。

136.用于實施方案135的用途的HDL治療劑，其中所述SREBP-1截留量為50％。

137.用于實施方案130至136中任一項的用途的HDL治療劑，其中在施用后2-12小時，4-10小時，2-8小時，2-6小時，4-6小時或4-8小時測量SREBP-1表達水平。

138.用于實施方案94至137中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述HDL治療劑是脂蛋白復合物。

139.用于實施方案138的用途的HDL治療劑，其中所述脂蛋白復合物包含載脂蛋白。

140.用于實施方案139的用途的HDL治療劑，其中所述載脂蛋白是ApoA-I，ApoA-II，ApoA-IV，ApoE或其組合。

141.用于實施方案138的用途的HDL治療劑，其中所述脂蛋白復合物包含載脂蛋白肽模擬物。

142.用于實施方案141的用途的HDL治療劑，其中所述肽模擬物是ApoA-I，ApoA-II，ApoA-IV或ApoE肽模擬物或其組合。

143.用于實施方案138的用途的HDL治療劑，其中所述脂蛋白復合物是CER-001，CSL-111，CSL-112或ETC-216。

144.用于實施方案94至137中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述HDL治療劑是小分子。

145.用于實施方案144的用途的HDL治療劑，其中所述小分子是CETP抑制劑。

146.用于實施方案144的用途的HDL治療劑，其中所述小分子是泛酸衍生物。

147.用于實施方案94至138中任一項的用途的HDL治療劑，其還包括確定截留量。

148.用于實施方案147的用途的HDL治療劑，其中通過產(chǎn)生針對HDL治療劑的劑量反應曲線來確定所述截留量。

149.用于實施方案148的用途的HDL治療劑，其中所述截留量為導致所述劑量反應曲線中的拐點的劑量的25％-75％。

150.用于實施方案149的用途的HDL治療劑，其中所述截留量為導致所述劑量反應曲線中的拐點的劑量的40％-60％。

151.用于實施方案94至150中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述受試者或受試者群體具有ABCA1缺陷。

152.用于實施方案151的用途的HDL治療劑，其中所述受試者或受試者群體對于ABCA1突變是純合的。

153.用于實施方案151的用途的HDL治療劑，其中所述受試者或受試者群體對于ABCA1突變是雜合的。

154.HDL治療劑，其用于在鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法中的用途，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者，(b)在每個劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平；和(c)鑒定不使所述一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過0％，超過10％或超過20％的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

155.HDL治療劑，其用于在鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法中的用途，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者群體，(b)在每個劑量后，測量在所述受試者的循環(huán)單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中一種或多種HDL標志物的表達水平；和(c)鑒定不使所述一種或多種HDL標志物的表達水平在所述受試者中增加超過0％，超過10％或超過20％的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

156.HDL治療劑，其用于在鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法中的用途，該方法包括：鑒定不使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最高劑量。

157.用于實施方案156的用途的HDL治療劑，其包括：(a)根據(jù)一個或多個給藥頻率施用HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定在所述受試者中不使膽固醇流出降低超過50％至100％的最大給藥頻率，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

158.HDL治療劑，其用于在鑒定適合于療法的HDL治療劑的給藥間隔的方法中的用途，該方法包括：鑒定不使細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的HDL治療劑的最頻繁的給藥日程表的最高劑量。

159.用于實施方案158的用途的HDL治療劑，其包括：(a)根據(jù)一個或多個給藥頻率施用HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定在所述受試者中不使細胞膽固醇流出降低超過50％至100％的最大給藥頻率，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

160.HDL治療劑，其用于在鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量的方法中的用途，該方法包括：(a)施用HDL治療劑的一個或多個劑量至受試者群體，(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定不使所述受試者中細胞膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的最大劑量，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

161.HDL治療劑，其用于在鑒定適合于療法的HDL治療劑的給藥間隔的方法中的用途，該方法包括通過以下步驟鑒定HDL治療劑的最頻繁的給藥日程表的最高劑量：(a)根據(jù)一個或多個給藥頻率施用HDL治療劑至受試者或受試者群體；(b)測量來自所述受試者或受試者群體的細胞中的膽固醇流出；和(c)鑒定不使所述受試者中的膽固醇流出降低超過0％，超過10％或超過20％的最大給藥頻率，從而鑒定適合于療法的HDL治療劑的劑量。

162.用于實施方案161的用途的HDL治療劑，其中一個或多個給藥頻率包括選自以下的一個或多個給藥頻率：

(a)每2天以1-4小時輸注施用；

(b)每3天以1-4小時輸注施用；

(c)每周日(every week days)以24小時輸注施用；和

(d)每兩周以24小時輸注施用。

163.用于實施方案156至162中任一項的用途的HDL治療劑，其中在來自所述受試者或受試者群體的單核細胞，巨噬細胞或單核細胞中測量所述膽固醇流出。

164.HDL治療劑，其用于在治療具有ABCA1缺陷的受試者的方法中的用途，該方法包括對所述受試者施用治療有效量的HDL治療劑。

165.用于實施方案164的用途的HDL治療劑，其中所述HDL治療劑是CER-001。

166.用于實施方案164或165的用途的HDL治療劑，其中所述受試者對于ABCA1突變是雜合的。

167.用于實施方案164或165的用途的HDL治療劑，其中所述受試者對于ABCA1突變是純合的。

168.HDL治療劑，其用于在治療患家族原發(fā)性低α-脂蛋白血癥(familial primary hypoalphalipoproteinemia)的受試者的方法，該方法包括：

(a)根據(jù)誘導方案對所述受試者施用所述HDL治療劑；和，隨后

(b)根據(jù)維持方案對所述受試者施用所述HDL治療劑。

169.用于實施方案168的用途的HDL治療劑，其中所述維持方案需要以較低劑量，較低頻率或兩者施用所述HDL治療劑。

170.用于實施方案168或?qū)嵤┓桨?69的用途的HDL治療劑，其中所述受試者對于ABCA1突變是雜合的。

171.用于實施方案168或?qū)嵤┓桨?69的用途的HDL治療劑，其中所述受試者對于ABCA1突變是純合的。

172.用于實施方案168-171中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述受試者對于LCAT突變是純合的或雜合的。

173.用于實施方案168-172中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述受試者對于ApoA-I突變是純合的或雜合的。

174.用于實施方案168-173中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述受試者對于ABCG1突變是純合的或雜合的。

175.用于實施方案168-174中任一項的用途的HDL治療劑，其中也用脂質(zhì)控制藥物治療所述受試者。

176.用于實施方案175的用途的HDL治療劑，其中所述脂質(zhì)控制藥物是阿托伐他汀(atorvastatin)，依澤替米貝，煙酸，羅舒伐他汀(rosuvastatin)，辛伐他汀(simvatatin)，阿司匹林，氟伐他汀(fluvastatin)，洛伐他汀(lovastatin)，普伐他汀(paravastatin)或它們的組合。

177.用于實施方案168-176中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述HDL治療劑是CER-001。

178.用于實施方案177的用途的HDL治療劑，其中所述誘導方案的持續(xù)時間是4周。

179.用于實施方案177或?qū)嵤┓桨?78的用途的HDL治療劑，其中所述誘導方案包括一周施用CER-001三次。

180.用于實施方案177-179中任一項的用途的HDL治療劑，其中在所述誘導方案中施用的劑量為8-15mg/kg(基于蛋白質(zhì)重量)。

181.用于實施方案180的用途的HDL治療劑，其中在所述誘導方案中施用的所述劑量是8mg/kg，12mg/kg或15mg/kg。

182.用于實施方案177-181中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述維持方案包括施用HDL治療劑達至少一個月，至少兩個月，至少三個月，至少六個月，至少一年，至少18個月，至少兩年，或無限期。

183.用于實施方案177-182中任一項的用途的HDL治療劑，其中所述維持方案包括一周施用CER-001兩次。

184.用于實施方案177-183中任一項的用途的HDL治療劑，其中在所述維持方案中施用的所述劑量為1-6mg/kg(基于蛋白質(zhì)重量)。

185.用于實施方案184的用途的HDL治療劑，其中在所述維持方案中施用的劑量是1mg/kg，3mg/kg或6mg/kg。

186.用于實施方案168-185中任一項的用途的HDL治療劑，其中，

(a)所述誘導方案利用與所述受試者的基線量和/或群體平均值相比，使一種或多種HDL標志物的表達水平降低20％-80％或40％-60％的劑量；和/或

(b)所述維持方案利用與受試者的基線量和/或群體平均值相比，不使一種或多種HDL標志物的表達水平降低超過20％或超過10％的劑量。

187.用于實施方案186的用途的HDL治療劑，其中所述維持方案利用不降低一種或多種HDL標志物的表達水平的劑量。

雖然已經(jīng)解釋和描述了各種具體實施例，但是應當理解，在不脫離本公開的精神和范圍的情況下可以進行各種改變。

通過引用并入

在本申請中引用的所有出版物，專利，專利申請和其他文件通過引用整體并入本文以用于所有目的，并入的程度如同單獨指示將每個單獨的出版物，專利，專利申請或其他文獻通過引用并入以用于所有目的。

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序列表

<110> 塞勒尼斯醫(yī)療控股公司

<120> HDL治療標志物

<130> CRN-016WO

<140>

<141>

<150> 61/988,095

<151> 2014-05-02

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> 人類

<400> 1

Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser

1 5 10 15

Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp

20 25 30

Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp

35 40 45

Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys

50 55 60

Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr

65 70 75 80

Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp

85 90 95

Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys

100 105 110

Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe

115 120 125

Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu

130 135 140

Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu

145 150 155 160

Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala

165 170 175

Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp

180 185 190

Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn

195 200 205

Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu

210 215 220

Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln

225 230 235 240

Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala

245 250 255

Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln

260 265

<210> 2

<211> 6786

<212> DNA

<213> 人類

<400> 2

atggcttgtt ggcctcagct gaggttgctg ctgtggaaga acctcacttt cagaagaaga 60

caaacatgtc agctgctgct ggaagtggcc tggcctctat ttatcttcct gatcctgatc 120

tctgttcggc tgagctaccc accctatgaa caacatgaat gccattttcc aaataaagcc 180

atgccctctg caggaacact tccttgggtt caggggatta tctgtaatgc caacaacccc 240

tgtttccgtt acccgactcc tggggaggct cccggagttg ttggaaactt taacaaatcc 300

attgtggctc gcctgttctc agatgctcgg aggcttcttt tatacagcca gaaagacacc 360

agcatgaagg acatgcgcaa agttctgaga acattacagc agatcaagaa atccagctca 420

aacttgaagc ttcaagattt cctggtggac aatgaaacct tctctgggtt cctgtatcac 480

aacctctctc tcccaaagtc tactgtggac aagatgctga gggctgatgt cattctccac 540

aaggtatttt tgcaaggcta ccagttacat ttgacaagtc tgtgcaatgg atcaaaatca 600

gaagagatga ttcaacttgg tgaccaagaa gtttctgagc tttgtggcct accaagggag 660

aaactggctg cagcagagcg agtacttcgt tccaacatgg acatcctgaa gccaatcctg 720

agaacactaa actctacatc tcccttcccg agcaaggagc tggctgaagc cacaaaaaca 780

ttgctgcata gtcttgggac tctggcccag gagctgttca gcatgagaag ctggagtgac 840

atgcgacagg aggtgatgtt tctgaccaat gtgaacagct ccagctcctc cacccaaatc 900

taccaggctg tgtctcgtat tgtctgcggg catcccgagg gaggggggct gaagatcaag 960

tctctcaact ggtatgagga caacaactac aaagccctct ttggaggcaa tggcactgag 1020

gaagatgctg aaaccttcta tgacaactct acaactcctt actgcaatga tttgatgaag 1080

aatttggagt ctagtcctct ttcccgcatt atctggaaag ctctgaagcc gctgctcgtt 1140

gggaagatcc tgtatacacc tgacactcca gccacaaggc aggtcatggc tgaggtgaac 1200

aagaccttcc aggaactggc tgtgttccat gatctggaag gcatgtggga ggaactcagc 1260

cccaagatct ggaccttcat ggagaacagc caagaaatgg accttgtccg gatgctgttg 1320

gacagcaggg acaatgacca cttttgggaa cagcagttgg atggcttaga ttggacagcc 1380

caagacatcg tggcgttttt ggccaagcac ccagaggatg tccagtccag taatggttct 1440

gtgtacacct ggagagaagc tttcaacgag actaaccagg caatccggac catatctcgc 1500

ttcatggagt gtgtcaacct gaacaagcta gaacccatag caacagaagt ctggctcatc 1560

aacaagtcca tggagctgct ggatgagagg aagttctggg ctggtattgt gttcactgga 1620

attactccag gcagcattga gctgccccat catgtcaagt acaagatccg aatggacatt 1680

gacaatgtgg agaggacaaa taaaatcaag gatgggtact gggaccctgg tcctcgagct 1740

gacccctttg aggacatgcg gtacgtctgg gggggcttcg cctacttgca ggatgtggtg 1800

gagcaggcaa tcatcagggt gctgacgggc accgagaaga aaactggtgt ctatatgcaa 1860

cagatgccct atccctgtta cgttgatgac atctttctgc gggtgatgag ccggtcaatg 1920

cccctcttca tgacgctggc ctggatttac tcagtggctg tgatcatcaa gggcatcgtg 1980

tatgagaagg aggcacggct gaaagagacc atgcggatca tgggcctgga caacagcatc 2040

ctctggttta gctggttcat tagtagcctc attcctcttc ttgtgagcgc tggcctgcta 2100

gtggtcatcc tgaagttagg aaacctgctg ccctacagtg atcccagcgt ggtgtttgtc 2160

ttcctgtccg tgtttgctgt ggtgacaatc ctgcagtgct tcctgattag cacactcttc 2220

tccagagcca acctggcagc agcctgtggg ggcatcatct acttcacgct gtacctgccc 2280

tacgtcctgt gtgtggcatg gcaggactac gtgggcttca cactcaagat cttcgctagc 2340

ctgctgtctc ctgtggcttt tgggtttggc tgtgagtact ttgccctttt tgaggagcag 2400

ggcattggag tgcagtggga caacctgttt gagagtcctg tggaggaaga tggcttcaat 2460

ctcaccactt cggtctccat gatgctgttt gacaccttcc tctatggggt gatgacctgg 2520

tacattgagg ctgtctttcc aggccagtac ggaattccca ggccctggta ttttccttgc 2580

accaagtcct actggtttgg cgaggaaagt gatgagaaga gccaccctgg ttccaaccag 2640

aagagaatat cagaaatctg catggaggag gaacccaccc acttgaagct gggcgtgtcc 2700

attcagaacc tggtaaaagt ctaccgagat gggatgaagg tggctgtcga tggcctggca 2760

ctgaattttt atgagggcca gatcacctcc ttcctgggcc acaatggagc ggggaagacg 2820

accaccatgt caatcctgac cgggttgttc cccccgacct cgggcaccgc ctacatcctg 2880

ggaaaagaca ttcgctctga gatgagcacc atccggcaga acctgggggt ctgtccccag 2940

cataacgtgc tgtttgacat gctgactgtc gaagaacaca tctggttcta tgcccgcttg 3000

aaagggctct ctgagaagca cgtgaaggcg gagatggagc agatggccct ggatgttggt 3060

ttgccatcaa gcaagctgaa aagcaaaaca agccagctgt caggtggaat gcagagaaag 3120

ctatctgtgg ccttggcctt tgtcggggga tctaaggttg tcattctgga tgaacccaca 3180

gctggtgtgg acccttactc ccgcagggga atatgggagc tgctgctgaa ataccgacaa 3240

ggccgcacca ttattctctc tacacaccac atggatgaag cggacgtcct gggggacagg 3300

attgccatca tctcccatgg gaagctgtgc tgtgtgggct cctccctgtt tctgaagaac 3360

cagctgggaa caggctacta cctgaccttg gtcaagaaag atgtggaatc ctccctcagt 3420

tcctgcagaa acagtagtag cactgtgtca tacctgaaaa aggaggacag tgtttctcag 3480

agcagttctg atgctggcct gggcagcgac catgagagtg acacgctgac catcgatgtc 3540

tctgctatct ccaacctcat caggaagcat gtgtctgaag cccggctggt ggaagacata 3600

gggcatgagc tgacctatgt gctgccatat gaagctgcta aggagggagc ctttgtggaa 3660

ctctttcatg agattgatga ccggctctca gacctgggca tttctagtta tggcatctca 3720

gagacgaccc tggaagaaat attcctcaag gtggccgaag agagtggggt ggatgctgag 3780

acctcagatg gtaccttgcc agcaagacga aacaggcggg ccttcgggga caagcagagc 3840

tgtcttcgcc cgttcactga agatgatgct gctgatccaa atgattctga catagaccca 3900

gaatccagag agacagactt gctcagtggg atggatggca aagggtccta ccaggtgaaa 3960

ggctggaaac ttacacagca acagtttgtg gcccttttgt ggaagagact gctaattgcc 4020

agacggagtc ggaaaggatt ttttgctcag attgtcttgc cagctgtgtt tgtctgcatt 4080

gcccttgtgt tcagcctgat cgtgccaccc tttggcaagt accccagcct ggaacttcag 4140

ccctggatgt acaacgaaca gtacacattt gtcagcaatg atgctcctga ggacacggga 4200

accctggaac tcttaaacgc cctcaccaaa gaccctggct tcgggacccg ctgtatggaa 4260

ggaaacccaa tcccagacac gccctgccag gcaggggagg aagagtggac cactgcccca 4320

gttccccaga ccatcatgga cctcttccag aatgggaact ggacaatgca gaacccttca 4380

cctgcatgcc agtgtagcag cgacaaaatc aagaagatgc tgcctgtgtg tcccccaggg 4440

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ttaaagaaca agatctgggt gaatgagttt aggtatggcg gcttttccct gggtgtcagt 4620

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atgacaggac tggacaccaa aaataatgtc aaggtgtggt tcaataacaa gggctggcat 4800

gcaatcagct ctttcctgaa tgtcatcaac aatgccattc tccgggccaa cctgcaaaag 4860

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gatatcctga agtccgtgtt cttgatcttc ccacattttt gcctgggacg agggctcatc 5460

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atccatgaag tacatcagaa catgggctac tgccctcagt ttgatgccat cacagagctg 6000

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<221> MOD_RES

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<223> 任意氨基酸

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<221> MOD_RES

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<223> 任意氨基酸

<220>

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<223> 任意氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

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<223> 任意氨基酸

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Met Ala Cys Trp Pro Gln Leu Arg Leu Leu Leu Trp Lys Asn Leu Thr

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Leu Phe Ile Phe Leu Ile Leu Ile Ser Val Arg Leu Ser Tyr Pro Pro

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Tyr Glu Gln His Glu Cys His Phe Pro Asn Lys Ala Met Pro Ser Ala

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Gly Thr Leu Pro Trp Val Gln Gly Ile Ile Cys Asn Ala Asn Asn Pro

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Cys Phe Arg Tyr Pro Thr Pro Gly Glu Ala Pro Gly Val Val Gly Asn

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Phe Asn Lys Ser Ile Val Ala Arg Leu Phe Ser Asp Ala Arg Arg Leu

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Leu Leu Tyr Ser Gln Lys Asp Thr Ser Met Lys Asp Met Arg Lys Val

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Leu Arg Thr Leu Gln Gln Ile Lys Lys Ser Ser Ser Asn Leu Lys Leu

130 135 140

Gln Asp Phe Leu Val Asp Asn Glu Thr Phe Ser Gly Phe Leu Tyr His

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Asn Leu Ser Leu Pro Lys Ser Thr Val Asp Lys Met Leu Arg Ala Asp

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Ser Leu Cys Asn Gly Ser Lys Ser Glu Glu Met Ile Gln Leu Gly Asp

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Ser Leu Asn Trp Tyr Glu Asp Asn Asn Tyr Lys Ala Leu Phe Gly Gly

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Asn Gly Thr Glu Glu Asp Ala Glu Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Thr Thr

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Pro Tyr Cys Asn Asp Leu Met Lys Asn Leu Glu Ser Ser Pro Leu Ser

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Val Tyr Thr Trp Arg Glu Ala Phe Asn Glu Thr Asn Gln Ala Ile Arg

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Tyr Val Ser Ser Thr Asn Leu Pro Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu

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Lys Ser Val Phe Leu Ile Phe Pro His Phe Cys Leu Gly Arg Gly

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Leu Ile Asp Met Val Lys Asn Gln Ala Met Ala Asp Ala Leu Glu

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Asn Asp Ile Leu Glu Ile Lys Glu Leu Thr Lys Ile Tyr Arg Arg

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Lys Arg Lys Pro Ala Val Asp Arg Ile Cys Val Gly Ile Pro Pro

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<213> 人類

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aaccgagtca cccagctggt ctcatacata gacagcactt gtgaaggatt gaatgcaggt 2760

tccaggtgga gggaagacgt ggacaccatc tccactgagc catgcagaca tttttaaaag 2820

ctatacaaaa aattgtgaga agacattggc caactctttc aaagtctttc tttttccacg 2880

tgcttcttat tttaagcgaa atatattgtt tgtttcttcc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940

aaaaaa 2946

<210> 5

<211> 678

<212> PRT

<213> 人類

<400> 5

Met Ala Cys Leu Met Ala Ala Phe Ser Val Gly Thr Ala Met Asn Ala

1 5 10 15

Ser Ser Tyr Ser Ala Glu Met Thr Glu Pro Lys Ser Val Cys Val Ser

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Val Asp Glu Val Val Ser Ser Asn Met Glu Ala Thr Glu Thr Asp Leu

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Leu Asn Gly His Leu Lys Lys Val Asp Asn Asn Leu Thr Glu Ala Gln

50 55 60

Arg Phe Ser Ser Leu Pro Arg Arg Ala Ala Val Asn Ile Glu Phe Arg

65 70 75 80

Asp Leu Ser Tyr Ser Val Pro Glu Gly Pro Trp Trp Arg Lys Lys Gly

85 90 95

Tyr Lys Thr Leu Leu Lys Gly Ile Ser Gly Lys Phe Asn Ser Gly Glu

100 105 110

Leu Val Ala Ile Met Gly Pro Ser Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Met

115 120 125

Asn Ile Leu Ala Gly Tyr Arg Glu Thr Gly Met Lys Gly Ala Val Leu

130 135 140

Ile Asn Gly Leu Pro Arg Asp Leu Arg Cys Phe Arg Lys Val Ser Cys

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Tyr Ile Met Gln Asp Asp Met Leu Leu Pro His Leu Thr Val Gln Glu

165 170 175

Ala Met Met Val Ser Ala His Leu Lys Leu Gln Glu Lys Asp Glu Gly

180 185 190

Arg Arg Glu Met Val Lys Glu Ile Leu Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ser

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Cys Ala Asn Thr Arg Thr Gly Ser Leu Ser Gly Gly Gln Arg Lys Arg

210 215 220

Leu Ala Ile Ala Leu Glu Leu Val Asn Asn Pro Pro Val Met Phe Phe

225 230 235 240

Asp Glu Pro Thr Ser Gly Leu Asp Ser Ala Ser Cys Phe Gln Val Val

245 250 255

Ser Leu Met Lys Gly Leu Ala Gln Gly Gly Arg Ser Ile Ile Cys Thr

260 265 270

Ile His Gln Pro Ser Ala Lys Leu Phe Glu Leu Phe Asp Gln Leu Tyr

275 280 285

Val Leu Ser Gln Gly Gln Cys Val Tyr Arg Gly Lys Val Cys Asn Leu

290 295 300

Val Pro Tyr Leu Arg Asp Leu Gly Leu Asn Cys Pro Thr Tyr His Asn

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Pro Ala Asp Phe Val Met Glu Val Ala Ser Gly Glu Tyr Gly Asp Gln

325 330 335

Asn Ser Arg Leu Val Arg Ala Val Arg Glu Gly Met Cys Asp Ser Asp

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His Lys Arg Asp Leu Gly Gly Asp Ala Glu Val Asn Pro Phe Leu Trp

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His Arg Pro Ser Glu Glu Val Lys Gln Thr Lys Arg Leu Lys Gly Leu

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Arg Lys Asp Ser Ser Ser Met Glu Gly Cys His Ser Phe Ser Ala Ser

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Met Arg Asp Ser Val Leu Thr His Leu Arg Ile Thr Ser His Ile Gly

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Ile Gly Leu Leu Ile Gly Leu Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Glu Ala

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Lys Lys Val Leu Ser Asn Ser Gly Phe Leu Phe Phe Ser Met Leu Phe

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Leu Met Phe Ala Ala Leu Met Pro Thr Val Leu Thr Phe Pro Leu Glu

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Ala Tyr Tyr Leu Ala Lys Thr Met Ala Asp Val Pro Phe Gln Ile Met

500 505 510

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Ser Asp Ala Val Arg Phe Val Leu Phe Ala Ala Leu Gly Thr Met Thr

530 535 540

Ser Leu Val Ala Gln Ser Leu Gly Leu Leu Ile Gly Ala Ala Ser Thr

545 550 555 560

Ser Leu Gln Val Ala Thr Phe Val Gly Pro Val Thr Ala Ile Pro Val

565 570 575

Leu Leu Phe Ser Gly Phe Phe Val Ser Phe Asp Thr Ile Pro Thr Tyr

580 585 590

Leu Gln Trp Met Ser Tyr Ile Ser Tyr Val Arg Tyr Gly Phe Glu Gly

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Val Ile Leu Ser Ile Tyr Gly Leu Asp Arg Glu Asp Leu His Cys Asp

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Ile Asp Glu Thr Cys His Phe Gln Lys Ser Glu Ala Ile Leu Arg Glu

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Leu Asp Val Glu Asn Ala Lys Leu Tyr Leu Asp Phe Ile Val Leu Gly

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Ile Phe Phe Ile Ser Leu Arg Leu Ile Ala Tyr Phe Val Leu Arg Tyr

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<212> DNA

<213> 人類

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cgtacgaggc ggcgggcccg gcgggcctcc cggaggaggc ggctgcgcca tggacgagcc 180

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gctgctgacc gacatcgaag gtgaagtcgg cgcggggagg ggtagggcca acggcctgga 300

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gcttatcaac aaccaagaca gtgacttccc tggcctattt gacccaccct atgctgggag 420

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acctcctgcc acattgagct cctctcttga agccttcctg agcgggccgc aggcagcgcc 540

ctcacccctg tcccctcccc agcctgcacc cactccattg aagatgtacc cgtccatgcc 600

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accgcagttc agctccaccc ctgtgttagg ctaccccagc cctccgggag gcttctctac 780

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cactgtgcag acagggcctt tgccgaccct ggtgagtggc ggaaccatct tggcaacagt 1140

cccactggtc gtagatgcgg agaagctgcc tatcagccgg ctcgcagctg gcagcaaggc 1200

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ggcaaagctg aataaatctg ctgtcttgcg caaggccatc gactacattc gctttctgca 1380

acacagcaac cagaaactca agcaggagaa cctaagtctg cgcactgctg tccacaaaag 1440

caaatctctg aaggatctgg tgtcggcctg tggcagtgga gggaacacag acgtgctcat 1500

ggagggcgtg aagactgagg tggaggacac actgacccca cccccctcgg atgctggctc 1560

acctttccag agcagcccct tgtcccttgg cagcaggggc agtggcagcg gtggcagtgg 1620

cagtgactcg gagcctgaca gcccagtctt tgaggacagc aaggcaaagc cagagcagcg 1680

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aa 4262

<210> 7

<211> 1147

<212> PRT

<213> 人類

<400> 7

Met Asp Glu Pro Pro Phe Ser Glu Ala Ala Leu Glu Gln Ala Leu Gly

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Asp Thr Ser Ser Pro Gly Ser Leu Ser Pro Pro Pro Ala Thr Leu Ser

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Ser Ser Leu Glu Ala Phe Leu Ser Gly Pro Gln Ala Ala Pro Ser Pro

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Leu Ser Pro Pro Gln Pro Ala Pro Thr Pro Leu Lys Met Tyr Pro Ser

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Met Pro Ala Phe Ser Pro Gly Pro Gly Ile Lys Glu Glu Ser Val Pro

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Leu Pro Gln Ser Phe Pro Ala Pro Ala Pro Pro Gln Phe Ser Ser Thr

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Pro Val Leu Gly Tyr Pro Ser Pro Pro Gly Gly Phe Ser Thr Gly Ser

165 170 175

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Pro Pro Gly Val Pro Pro Val Ser Leu His Thr Gln Val Gln Ser Val

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Gln Pro His Phe Ile Lys Ala Asp Ser Leu Leu Leu Thr Ala Met Lys

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Gly Thr Thr Val Gln Thr Gly Pro Leu Pro Thr Leu Val Ser Gly Gly

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Ile Asn Arg Leu Ala Ala Gly Ser Lys Ala Pro Ala Ser Ala Gln Ser

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Arg Gly Glu Lys Arg Thr Ala His Asn Ala Ile Glu Lys Arg Tyr Arg

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Ser Ser Ile Asn Asp Lys Ile Ile Glu Leu Lys Asp Leu Val Val Gly

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Thr Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ser Ala Val Leu Arg Lys Ala Ile Asp

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Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ser Glu Pro Asp Ser Pro Val Phe

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Glu Asp Ser Lys Ala Lys Pro Glu Gln Arg Pro Ser Leu His Ser Arg

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Gly Met Leu Asp Arg Ser Arg Leu Ala Leu Cys Thr Leu Val Phe Leu

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Leu Leu Gly Cys Ala Lys Ala Glu Ser Gly Pro Ala Ser Leu Thr Ile

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Cys Glu Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Gln Asp Ser Leu Ala Thr Thr Pro

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Ala Ser Ser Ser Ile Asp Lys Ala Val Gln Leu Phe Leu Cys Asp Leu

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Leu Leu Val Val Arg Thr Ser Leu Trp Arg Gln Gln Gln Pro Pro Ala

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1145