本申請要求于2014年5月15日提交的美國臨時(shí)申請61/993,659號的權(quán)益，此處將其內(nèi)容以其整體作為參考并入本文。

2.

背景技術(shù)：

檢測胎兒可能的染色體和遺傳異常的產(chǎn)前診斷實(shí)踐使父母和看護(hù)人能夠開始監(jiān)測疾病或病癥的傾向及早期治療。已經(jīng)建立了用于檢測胎兒可能的染色體和遺傳異常的產(chǎn)前診斷實(shí)踐，從而使得父母和看護(hù)人能夠作出明智的決策。在多種不具有生命危險(xiǎn)的染色體異常(21、18、13、X、Y染色體的非整倍性)中，由21號染色體的額外拷貝的全部或部分的存在引起的唐氏綜合癥是精神發(fā)育遲滯最常見的遺傳成因和女性尋求產(chǎn)前診斷的主要原因(Pierce B.Genetics：A conceptual approach(W.H.Freeman and company，2008)，第3版；Driscoll和Gross，2009，N Engl J Med.360：2556-62)。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞遺傳學(xué)異常發(fā)生率在活產(chǎn)嬰中為約1％、在超過35歲的懷孕女性中為2％、在自發(fā)性孕早期流產(chǎn)中為約50％(Thompson and Thompson Genetics in Medicine，第6版，第9章)。據(jù)報(bào)道，在一百萬個(gè)活產(chǎn)嬰兒人群中單基因缺陷的發(fā)生率為約0.36％(Thompson and Thompson Genetics in Medicine，第6版，第9章)。

涉及對來自血清的PAPP-A(妊娠相關(guān)血漿蛋白-A)、游離β-Hcg(游離β-人絨膜促性腺激素)進(jìn)行定量的優(yōu)選孕早期篩查以及頸半透明度的超聲檢查，具有唐氏綜合癥的檢測率為約90％，但以5％顯著性的假陽性率為代價(jià)(Nicolaides等，2005，Ultrasound Obstet Gynecol 25：221-26)。孕早期篩查研究的綜合分析(Evans等，2007，Am J Obstet Gynecol 196：198-05)得出結(jié)論，在實(shí)踐中得到的敏感性可能顯著低于(約80％～84％)報(bào)道的敏感性。

通過對由絨毛膜絨毛采樣、羊膜穿刺術(shù)或臍帶采樣獲得的胎兒組織進(jìn)行核型分析可以明確檢測染色體異常和單基因病。為了最小化諸如唐氏綜合癥等病癥的風(fēng)險(xiǎn)，這些檢測提供給通過一組篩察標(biāo)準(zhǔn)鑒定為具有最高胎兒染色體異常風(fēng)險(xiǎn)的的女性。這個(gè)群組通常包括孕婦年齡為35歲或以上的妊娠，和對胎兒超聲檢查的異常響應(yīng)，和/或在妊娠的孕早期和/或孕中期期間進(jìn)行的孕婦血清標(biāo)志物篩察檢測(Nicolaides等，2005，Ultrasound Obstet Gynecol 25：221-26)。然而，這些程序是高侵入性的，要求熟練的專業(yè)人員，并有顯著的胎兒損失風(fēng)險(xiǎn)(至多1％)和/或孕婦并發(fā)癥(Mujezinovic等，2007，Obstet Gynecol 110：687-94；Tabor等.，1986，Lancet 1：1287-93；Buscaglia等，1996，Prenat Diagn 16：375-76)。來自美國婦產(chǎn)科學(xué)院(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)的指南建議其會員對所有預(yù)期母親檢測遺傳異常(ACOG Practice bulletin Clinical Management Guidelines for Ob-Gyns，第7期，2007年1月)，這表明可安全進(jìn)行胎兒遺傳狀態(tài)的特異性診斷的非侵入式技術(shù)未滿足需求。

幾十年來，對非侵入式的替代方式的搜索集中在胎兒的遺傳材料分離、鑒定和后續(xù)分析上，其通常穿過胎盤屏障進(jìn)入母體循環(huán)。由于1893年關(guān)于胎兒細(xì)胞檢測的開創(chuàng)性報(bào)道及后來的對胎兒無細(xì)胞DNA和在母血中的檢測的報(bào)道(參見Purwosunu等，2006，Taiwanese J.Obstet Gynecol 45(1)：10-20，表1)，兩種基于分析胎兒細(xì)胞或無細(xì)胞胎兒遺傳材料的有前景的方法獲得了極大的關(guān)注。

“無細(xì)胞”胎兒DNA在母血中是相對豐富的，其組成孕婦血漿中的總的無細(xì)胞DNA的5％至10％(Hahn等，2011，Expert Reviews in Molecular Medicine 13：e16)?；跓o細(xì)胞DNA的產(chǎn)前檢測，隨著下一代測序技術(shù)的出現(xiàn)變得可行，其在2011年首先在美國商業(yè)化，且目前至少四種這樣的檢測已商業(yè)化。迄今為止，無細(xì)胞DNA檢測方法允許進(jìn)行性別鑒定、非整倍性檢測和父本DNA中突變的存在，但不允許進(jìn)行更精確的遺傳分析，諸如基因微缺失或基因微插入的檢測(例如參見，Simpson，2013，F(xiàn)ertility and Sterility 99：1124-1134)。此外，已報(bào)道出包括假陽性的不準(zhǔn)確的檢測結(jié)果(雖然并不常見)(參見Simpson，2013，F(xiàn)ertility and Sterility99(4)：1124-1134；Dugo等.，2014，J Prenat Med.8(1-2)：31-35)。

與無細(xì)胞胎兒DNA或RNA相反，完整的胎兒細(xì)胞可提供對于染色體異常檢測重要的完整的胎兒遺傳材料，及對胎兒的遺傳狀態(tài)更完整的評估(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85)。許多重大的挑戰(zhàn)阻礙了可靠的胎兒細(xì)胞分離方法的發(fā)展。分離的主要限制是母血中循環(huán)的胎兒有核細(xì)胞的數(shù)量低，估計(jì)其范圍為1～2個(gè)胎兒細(xì)胞/毫升母血(Bianchi等，1997，Am J Hum Genet 61(4)：822-829)至1～2個(gè)胎兒細(xì)胞/2毫升～6毫升母血(Krabchi等，2001，Clin Genet 60：145-150)，但據(jù)報(bào)道，該數(shù)量在非整倍性妊娠中至多為至多六倍大(Krabchi等，2006，Clin Genet 69：145-154和Bianchi等.，1997，Am J Hum Genet 61(4)：822-829)。就此數(shù)量而言，血液中胎兒細(xì)胞與母體細(xì)胞的比估計(jì)為1/10⁵～1/10⁹(參見Purwosunu等，2006，Taiwanese J.Obstet Gynecol 45(1)：10-20；Simpson，2013，F(xiàn)ertility and Sterility 99(4)：1124-1134)，而在1毫升母血中，對于每1～6個(gè)胎兒細(xì)胞，存在大約4.2×10⁹～5.4×10⁹個(gè)成人紅細(xì)胞、1.16×10³～8.3×10³個(gè)中性粒細(xì)胞、2×10⁵～9.5×10⁵個(gè)單核細(xì)胞、1×10⁶～4.8×10⁶個(gè)淋巴細(xì)胞、1.33×10⁸～3.33×10⁸個(gè)血小板、至多4.5×10⁵個(gè)嗜酸性粒細(xì)胞和至多2×10⁵嗜堿性粒細(xì)胞(數(shù)字取自Uthman，Blood Cells and the CBC，可從web2.iadfw.net/uthman/blood_cell.html獲取)。

在母血中的多種胎兒細(xì)胞中(滋養(yǎng)層細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和造血干細(xì)胞；參見Bianchi，1999，Br J Haematol 105：574-83)，有核紅細(xì)胞(NRBC)(也被稱為幼紅細(xì)胞)具有對于可靠的產(chǎn)前檢測而言最為所需的特性。胎兒NRBC(fNRBC)具有有限的壽命和增殖能力(因此不能從一個(gè)妊娠堅(jiān)持到另一個(gè)妊娠)，其是單核的，具有代表性的胎兒染色體的補(bǔ)體，并始終存在于母血中(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Kavanagh等，2010，J Chromat B 878：1905-1911；Bianchi，1999，Br J Haematol105：574-83；Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-35；Bianchi和Lo，2010，Genetic Disorders and the Fetus：Diagnosis，Prevention and treatment，第6版，第30章，978-1000頁(Milunsky和Milunsky編))。胎兒紅細(xì)胞生成的研究已經(jīng)鑒定了最初在卵黃囊(原始紅細(xì)胞生成，產(chǎn)生原始幼紅細(xì)胞)中發(fā)生的和隨后在胎兒肝臟和骨髓(產(chǎn)生成熟幼紅細(xì)胞)的兩個(gè)不同的過程(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85)。原始幼紅細(xì)胞和成熟幼紅細(xì)胞均在母體循環(huán)中檢測到，其中原始幼紅細(xì)胞是主要的孕早期細(xì)胞類型，所述原始幼紅細(xì)胞逐步被持續(xù)到分娩期的成熟類型所取代(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-235)。

關(guān)于母血中胎兒細(xì)胞最廣泛的研究為多年多中心的NIFTY試驗(yàn)，其被設(shè)計(jì)來評估通過分離胎兒細(xì)胞來診斷胎兒異常的實(shí)用性和可行性。參與的四個(gè)中心嘗試從母血中分離胎兒細(xì)胞，并用通過具有染色體-特異性探針的熒光原位雜交(FISH)分析分離的細(xì)胞(Bianchi等，2002，Prenat Diagn 22：609-615)。命名為A、B、C和D的四個(gè)中心全部使用密度梯度分離作為前期步驟以去除母體細(xì)胞，然后使用不同的方法獲得胎兒細(xì)胞而用于FISH。在中心A處，在密度分離后進(jìn)行細(xì)胞固定，通過使用抗-CD14和抗-CD15抗體的MACS進(jìn)行陰性選擇，使用抗-HbF(胎兒血紅蛋白)進(jìn)行FACS。在中心B處，在密度分離后進(jìn)行細(xì)胞固定并使用FACS同時(shí)進(jìn)行陰性選擇和陽性選擇，對于陽性選擇使用抗-HbF抗體，對于陰性選擇使用抗-CD45或抗-HbA(成人血紅蛋白)。在中心C處，在密度梯度分離后，通過使用抗-CD14和抗-CD45抗體的MACS進(jìn)行陰性選擇，通過使用抗-CD71抗體進(jìn)行FACS，并進(jìn)行細(xì)胞固定。在中心D處，在密度分離后進(jìn)行細(xì)胞固定，并通過使用抗-CD71抗體的MACS進(jìn)行陽性選擇。男性胎兒細(xì)胞中X和Y染色體的一般檢測率僅為病例的41.1％，假陽性率(即，女性胎兒細(xì)胞中X和Y染色體的檢測)為11.1％。非整倍性的整體檢測率為74.4％，其假陽性率估計(jì)在0.6％～4.1％的范圍內(nèi)。參見Bianchi等，2002，Prenat Diagn 22：609-615。據(jù)說基于MACS的方法比基于FACS的方法提供了更好的恢復(fù)和檢測(Bianchi和Lo，2010，Genetic Disorders and the Fetus：Diagnosis，Prevention and treatment，第30章，978-1000頁(Milunsky和Milunsky編))。NIFTY試驗(yàn)的其中一個(gè)參與者陳述所述方法“是費(fèi)力的，缺乏一致的恢復(fù)性，并有一個(gè)不可接受的無信息率”。Simpson，2013，F(xiàn)ertility and Sterility 99(4)：1124-1134。

不得不使用多種其他方法來分離胎兒細(xì)胞，所述方法包括離心、過濾、橫向位移、磁導(dǎo)入、凝集素-結(jié)合、雙向電泳、微操作和激光捕獲以及顯微解剖。還使用諸如微電子機(jī)械系統(tǒng)(MEMS)和自動細(xì)胞富集方法等高通量方法(Kavanagh等，2010.J Chromat B 878：1905-11；Kilpatrick等，2004，J Obstet Gynecol 190：1571-81；Seppo等，2008，Prenat Diagn 28：815-21；Talasaz等，2009，PANS 106：3970-75，2009；Kumo等，2010，第十四屆化學(xué)與生命科學(xué)小型化系統(tǒng)國際會議.2010年10月3日-7日，格羅寧根，荷蘭；1583-1585頁；Cheng等，2011，J Clin Lab Anal 25：1-7；Choolani等，2012，Best Practice&Research Clinical Obstetrics and Gynaecology 26：655-667)。這些方法也提供了不一致的結(jié)果(Simpson，2013，F(xiàn)ertility and Sterility 99(4)：1124-1134)。

因此，仍然存在對允許對胎兒DNA進(jìn)行下游遺傳分析的簡單可靠的胎兒細(xì)胞分離技術(shù)的需求。

3.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開基于分離技術(shù)的發(fā)展，其允許從其中fNRBC是極少數(shù)的混合細(xì)胞群體中富集和分離胎兒有核紅細(xì)胞(fNRBC)。因此，本公開提供了高度富集fNRBC的細(xì)胞制備物及產(chǎn)生所述富集的細(xì)胞群體的方法。

本公開部分基于通常在液體介質(zhì)中進(jìn)行的陽性選擇方法的應(yīng)用，以從諸如母血或母血的富集fNRBC的細(xì)胞級分等生物樣品中富集(及可選地分離)fNRBC。通常在四周妊娠左右開始的時(shí)間段內(nèi)對母血進(jìn)行取材。

通常包括一個(gè)或多個(gè)基于陽性免疫選擇的步驟的陽性選擇方法，可與一種或多種去除其他細(xì)胞類型的其他方法結(jié)合使用，所述其他的細(xì)胞類型例如為來自生物樣品的母體淋巴細(xì)胞或紅細(xì)胞。所述其他方法包括陰性選擇和細(xì)胞密度分離技術(shù)。

通常，陰性選擇方法需要一個(gè)或多個(gè)使用抗體的陰性免疫選擇步驟，所述抗體不與fNRBC特異性結(jié)合，但與生物樣品中存在的一種或多種其他細(xì)胞類型結(jié)合。

一旦制成了富集fNRBC的細(xì)胞制備，所述制備物本身可以用于診斷檢測，或可以使用額外的分離技術(shù)(例如，微操作)來選擇個(gè)體fNRBC以用于診斷檢測。一個(gè)或多個(gè)fNRBC可以用于諸如短串聯(lián)重復(fù)序列(“STR”)分析等驗(yàn)證技術(shù)，以驗(yàn)證細(xì)胞身份為胎兒細(xì)胞。

在某些方面中，本公開提供了用于制備fNRBC的方法，其包括對包含fNRBC的生物樣品進(jìn)行陽性選擇。陽性選擇優(yōu)選包括陽性免疫選擇，及可選地，一種或多種額外的陽性選擇標(biāo)準(zhǔn)。陽性免疫選擇通常包括下列步驟：(a)在液體介質(zhì)中用一種或多種陽性免疫選擇抗體(例如，一種、二種、三種或更多種的陽性免疫選擇抗體)接觸生物樣品，其中相對于生物樣品的一種或多種其他細(xì)胞類型，所述陽性免疫選擇抗體選擇性結(jié)合至fNRBC；及(b)選擇結(jié)合至所述陽性免疫選擇抗體的細(xì)胞?？杉{入前述陽性選擇步驟的陽性選擇的示例性實(shí)施方式在第5.3、6、7.3和7.5節(jié)中進(jìn)行描述。

在某些方面中，至少一種陽性免疫選擇抗體結(jié)合fNRBC有核前體細(xì)胞的表面上存在的抗原，但不結(jié)合成人紅細(xì)胞上存在的CD71或其他表面抗原。在某些實(shí)施方式中，陽性免疫選擇抗體為4B9或與4B9競爭的抗體，以與fNRBC有核前體細(xì)胞表面結(jié)合。用于陽性選擇的其他標(biāo)志物可包括血型糖蛋白A(也被稱為CD235a)、CD36、CD71、和核染料(例如，Hoechst 33342、LDS751、TO-PRO、DC-Ruby、和DAPI)?？梢允褂枚嘀仃栃赃x擇過程，例如，使用MACS進(jìn)行陽性選擇后使用FACS進(jìn)行陽性選擇，其各使用一種、兩種、三種或甚至更多種陽性選擇(例如，陽性免疫選擇)試劑，所述試劑為諸如抗上文鑒定的標(biāo)志物或核染料的抗體等。

陽性選擇可以與陰性選擇(通常為陰性免疫選擇)結(jié)合使用。陰性免疫選擇可包括下列步驟：(a)在液體介質(zhì)中用一種或多種陰性免疫選擇抗體接觸生物樣品，其中，相對于fNRBC，所述陰性免疫選擇抗體選擇性結(jié)合至生物樣品中的其他細(xì)胞；及(b)選擇不與所述陰性免疫選擇抗體結(jié)合的細(xì)胞?？杉{入前述陰性選擇步驟的陰性選擇的示例性實(shí)施方式在第5.3、6、7.2和7.5節(jié)中進(jìn)行描述。

如果進(jìn)行陰性選擇，其可在陽性選擇之前、之后或與陽性選擇同時(shí)進(jìn)行?？梢允褂靡环N或多種陰性免疫選擇抗體，其優(yōu)選抗一種或多種造血細(xì)胞表面標(biāo)志物。示例性細(xì)胞表面標(biāo)志物包括：(a)諸如CD3、CD4或CD8等T-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物；(b)諸如CD19、CD20、或CD32等B-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物；(c)諸如CD45等泛淋巴細(xì)胞標(biāo)志物；(d)諸如CD56等NK細(xì)胞表面標(biāo)志物；(e)諸如CD11c或CD23等樹突細(xì)胞表面標(biāo)志物；及(f)諸如CD14或CD33等巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞表面標(biāo)志物。在特定的實(shí)施方式中，在一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)的陰性選擇步驟中使用兩種、三種、四種或甚至更多種陰性免疫選擇抗體。

免疫選擇步驟可以使用磁性分離，例如，使用包覆抗體的磁珠，或流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞技術(shù)可例如通過可以具有不同程度的復(fù)雜程度的熒光激活細(xì)胞分選器的應(yīng)用(諸如多色通道、低角度和鈍光散射檢測通道、阻抗通道等)提供準(zhǔn)確分離。因此，本文使用的術(shù)語“流式細(xì)胞術(shù)”涵蓋熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。

為了改善fNRBC的富集，在陽性選擇前可使用諸如密度分離等預(yù)富集步驟。示例性預(yù)富集過程在第5.2和7.1節(jié)中進(jìn)行描述。

一旦制成了富集fNRBC的細(xì)胞制備物，所述制備物本身可以用于診斷檢測，或可以使用額外的分離技術(shù)(例如，微操作、在固體表面捕獲細(xì)胞)來選擇個(gè)體fNRBC或fNRBC池以用于診斷檢測。在某些實(shí)施方式中，額外的分離技術(shù)(例如，微操作)可利用用于富集細(xì)胞的熒光標(biāo)簽、fNRBC中血紅蛋白的存在(通過Soret帶濾光器可檢測)和fNRBC的形態(tài)特征(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-35)的優(yōu)勢。微操作的示例性方法在第5.4和7.6節(jié)中進(jìn)行描述。

本公開進(jìn)一步提供通過本文描述的方法制備或可得的fNRBC制備物，其包括通過本文描述的方法分離的個(gè)體fNRBC或fNRBC組。在某些實(shí)施方式中，本公開提供了包含fNRBC的通過FACS分選的細(xì)胞群體。示例性FACS分選群體在第5.5節(jié)中進(jìn)行描述。

所述fNRBC可用于胎兒診斷檢測，例如，用于確定多胎妊娠或胎兒異常的存在?？蓹z測的異常的實(shí)例包括13-三體綜合癥、18-三體綜合癥、21-三體綜合癥、唐氏綜合癥、壓力易感性神經(jīng)病、神經(jīng)纖維瘤病、阿拉吉?dú)W綜合癥、軟骨發(fā)育不全癥、亨廷頓氏病、α-甘露糖苷貯積癥、β-甘露糖苷貯積癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、范-瑞克林豪森氏病、結(jié)節(jié)性硬化癥、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞疾病、泰-薩二氏病、β-地中海貧血、粘多醣貯積癥、苯丙酮尿癥、瓜氨酸尿癥、半乳糖血癥、半乳糖激酶和半乳糖4-差向異構(gòu)酶缺乏癥、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、甲基丙二酸尿癥、丙酸血癥、法伯病、巖藻糖苷貯積癥、神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥、高歇氏病、I-細(xì)胞病、III型粘脂貯積病、尼曼-匹克病、唾液酸沉積癥、沃耳曼氏病、腦肝腎綜合癥、胱氨酸病、凝血因子X缺陷癥、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、布洛姆氏綜合癥、羅伯特綜合癥、著色性干皮病、脆性(X)綜合癥、性染色體非整倍體、克萊恩費(fèi)爾特綜合癥、特納氏綜合癥、XXX綜合癥、類固醇硫酸酯酶缺乏癥、具有線性皮膚缺損的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色體上的睪丸決定因子、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、葡萄糖6-磷酸脫氫酶缺乏癥、萊施-奈恩綜合癥、安德森-費(fèi)勃萊氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥、Becker型肌營養(yǎng)不良癥、(17)(p11.2p11.2)重復(fù)綜合癥、16p11.2缺失、16p11.2重復(fù)、線粒體缺陷、(22)(q11.2q11.2)重復(fù)綜合癥、貓眼綜合癥、貓叫綜合癥、Wolf-Hirschhorn綜合癥、Williams-Beuren綜合癥、Charcot-Marie-Tooth病、染色體重排、染色體缺失、Smith-Magenis綜合癥、腭心面綜合癥、迪喬治綜合癥、1p36缺失、普拉德-威利綜合癥、精子缺乏(因子a)、精子缺乏(因子b)、精子缺乏(因子c)、脊柱裂、無腦畸形、神經(jīng)管缺損、小頭畸形、腦積水、腎缺如、Kallmann綜合癥、腎上腺發(fā)育不良、Angelman綜合癥、腎囊腫、囊性水瘤、胎兒水腫、臍膨出和腹裂、膈疝、十二指腸閉鎖、骨骼發(fā)育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿癥、楓糖尿病、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥、肝醣貯積癥、腎上腺增生、低磷酸酯酶癥、胎盤類固醇硫酸酯酶缺乏癥、重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥、T-細(xì)胞免疫缺陷、埃勒斯-當(dāng)洛斯綜合癥、成骨不全癥、成人多囊腎疾病、范科尼氏貧血癥、大皰性表皮松解癥綜合癥、少汗型外胚層發(fā)育不良癥、先天性腎變病(芬蘭型)和多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤。

診斷分析可以是核酸(例如，DNA或RNA)分析、蛋白質(zhì)(例如，基于抗體的)分析、或組織學(xué)分析、或其組合。DNA分析的實(shí)例包括FISH、PCR和DNA測序分析。RNA分析的實(shí)例包括RT-PCR分析和FISH分析。為了方便得到核酸，在進(jìn)行診斷檢測前，可以對fNRBC進(jìn)行裂解或透化?？梢栽谖㈥嚵猩线M(jìn)行DNA、RNA和蛋白質(zhì)分析。用于分子診斷檢測的示例性技術(shù)在第5.7節(jié)中進(jìn)行描述。

可在診斷分析前、伴隨診斷分析或在診斷分析后通過分子驗(yàn)證技術(shù)來驗(yàn)證診斷的細(xì)胞或細(xì)胞群體的身份為胎兒細(xì)胞。示例性驗(yàn)證技術(shù)在第5.6節(jié)中進(jìn)行描述。

在給定的妊娠過程中，本文描述的方法可以進(jìn)行一次或多次，例如，用來驗(yàn)證特定診斷或檢測妊娠中的變化或胎兒的狀態(tài)。

對于實(shí)踐本公開的方法有用的試劑盒在第5.8節(jié)中進(jìn)行描述。

4.附圖描述

圖1：圖1顯示了fNRBC分離和下游分析的示例性工作流程。對于fNRBC的分離，優(yōu)選的工作流程包括：在細(xì)胞密度梯度上從母血中分離單核細(xì)胞(如第7.1節(jié)所述)，其使用如7.3節(jié)所述(采用或不采用陰性選擇，例如，可選地，7.2節(jié)中的CD45耗竭步驟)的陽性選擇(例如，使用磁性激活細(xì)胞分選富集4B9陽性細(xì)胞)；并分選CD235+、核染色的4B9陽性細(xì)胞。在fNRBC富集后，例如根據(jù)本文描述的方法，基于如本申請中描述的用于下游細(xì)胞遺傳學(xué)和/或分子分析的形態(tài)學(xué)或染色，可以選擇個(gè)體細(xì)胞。工作流程可經(jīng)調(diào)整以利用第7節(jié)概述的任何組合方案。

圖2：圖2顯示了圖1概述的工作流程的具體實(shí)施方式。

圖3A-3D：圖3A-3D顯示了使用本文公開的方法以從母血中分離fNRBC的示例性FACS數(shù)據(jù)集。圖3A顯示了使用細(xì)胞光散射性質(zhì)來區(qū)分細(xì)胞類型的FSC(X軸)和BSC(Y軸)的相關(guān)測量。圖3B是淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的亞選通。X軸表示CD235a染色，Y軸表示DC-Ruby染色。右上象限包含核DC-Ruby和CD235a PE(血型糖蛋白-a)陽性的事件。圖3C是CD235a+區(qū)域的亞選通。X軸表示AF 488染色，Y軸表示DC-Ruby染色。右上象限包含核DC-Ruby和4B9AF 488陽性的事件?？梢苑诌x所述細(xì)胞以用于下游分析，例如將其直接放入用于核酸擴(kuò)增的PCR管中或放在用于微操作的載玻片上。圖3D顯示了圖3A-3C所示的在不同選通水平上進(jìn)行選擇的細(xì)胞的示例性分布。

圖4：使用X和Y染色體雜交探針通過熒光原位雜交(FISH)并用DAPI進(jìn)行復(fù)染以分析fNRBC。

圖5：從具有男性胎兒的女性妊娠者的外周血中分離細(xì)胞。細(xì)胞與X和Y探針雜交并用核染料DAPI進(jìn)行復(fù)染。

圖6：從具有男性胎兒的女性妊娠者的外周血中分離細(xì)胞。細(xì)胞與X和Y探針雜交并用核染料DAPI進(jìn)行復(fù)染。

圖7A-7D：圖7A顯示了使用細(xì)胞的光散射性質(zhì)以區(qū)分細(xì)胞類型的FSC(X軸)和BSC(Y軸)的相關(guān)測量。圖7B是是淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的亞選通。X軸表示CD235a染色，Y軸表示DC-Ruby染色。右上象限包含核DC-Ruby和CD235a PE(血型糖蛋白-a)陽性的事件。圖7C是CD235a+區(qū)域的亞選通。X軸表示AF 488染色，Y軸表示DC-Ruby染色。右上象限包含核DC-Ruby和4B9AF 488陽性的事件。圖7D是對于每個(gè)不同選通水平的統(tǒng)計(jì)。

圖8A-8B：圖8A顯示了使用細(xì)胞的光散射性質(zhì)以區(qū)分通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分選的4B9陰性細(xì)胞級分的細(xì)胞類型的FSC(X軸)和BSC(Y軸)的相關(guān)測量。圖8B顯示了來自4B9陰性細(xì)胞級分的淋巴細(xì)胞的FACS亞選通。X軸表示AF 488染色，Y軸表示DC-Ruby染色。

圖9A-9B：圖8A顯示了使用細(xì)胞的光散射性質(zhì)以區(qū)分通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分選的4B9陽性細(xì)胞級分的細(xì)胞類型的FSC(X軸)和BSC(Y軸)的相關(guān)測量。圖8B顯示了來自4B9陽性細(xì)胞級分的淋巴細(xì)胞的FACS亞選通。X軸表示AF 488染色，Y軸表示DC-Ruby染色。

圖10A-10C：來自男性血液中胎兒肝細(xì)胞的加標(biāo)混合物的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖10A顯示了純化的男性基因組DNA的FAM分析。圖10B顯示了來自女性胎兒肝細(xì)胞的純化DNA的FAM分析。圖10C顯示了富集后，F(xiàn)ACS分選4B9陽性級分的FAM分析。

圖11A-11C：來自男性血液中胎兒肝細(xì)胞的加標(biāo)混合物的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖11A顯示了純化的男性基因組DNA的VIC分析。圖11B顯示了來自女性胎兒肝細(xì)胞的純化DNA的VIC分析。圖11C顯示了富集后，F(xiàn)ACS分選4B9陽性級分的VIC分析。

圖12A-12C：來自男性血液中胎兒肝細(xì)胞的加標(biāo)混合物的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖12A顯示了純化的男性基因組DNA的NED分析。圖12B顯示了來自女性胎兒肝細(xì)胞的純化DNA的NED分析。圖12C顯示了富集后，F(xiàn)ACS分選4B9陽性級分的NED分析。

圖13A-13C：來自男性血液中胎兒肝細(xì)胞的加標(biāo)混合物的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖13A顯示了純化的男性基因組DNA的PET分析。圖13B顯示了來自女性胎兒肝細(xì)胞的純化DNA的PET分析。圖13C顯示了富集后，F(xiàn)ACS分選4B9陽性級分的PET分析。

圖14：來自男性血液中胎兒肝細(xì)胞的加標(biāo)混合物的4B9陽性級分的FAM STR產(chǎn)物的分離的毛細(xì)管電泳：面板顯示了D10S1248標(biāo)志物的兩種主要的貢獻(xiàn)等位基因(A，C)及兩種次要等位基因(B，D)；D13S317標(biāo)志物的兩種主要的貢獻(xiàn)等位基因(F，G)及兩種次要等位基因(E)。

圖15A-15D：來自從具有男性胎兒的7周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖15A和圖15B各顯示樣品細(xì)胞的FAM分析。圖15C顯示了母本基因組DNA的FAM分析。圖15D顯示了父本基因組DNA的FAM分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖16A-16D：來自從具有男性胎兒的7周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖16A和圖16B各顯示樣品細(xì)胞的VIC分析。圖16C顯示了母本基因組DNA的VIC分析。圖16D顯示了父本基因組DNA的VIC分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖17A-17D：來自從具有男性胎兒的7周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖17A和圖17B各顯示樣品細(xì)胞的NED分析。圖17C顯示了母本基因組DNA的NED分析。圖17D顯示了父本基因組DNA的NED分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。通過更短的短線形成的圈注明僅在父本譜中發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖18A-18D：來自從具有男性胎兒的7周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖18A和圖18B各顯示樣品細(xì)胞的PET分析。圖18C顯示了母本基因組DNA的PET分析。圖18D顯示了父本基因組DNA的PET分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。通過更短的短線形成的圈注明僅在父本譜中發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖19A-19C：來自從具有男性胎兒的9周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖19A顯示了母本基因組DNA的FAM分析。圖19B顯示了樣品細(xì)胞的FAM分析。圖19C顯示了父本基因組DNA的FAM分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖20A-20C：來自從具有男性胎兒的9周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖20A顯示了母本基因組DNA的VIC分析。圖20B顯示了樣品細(xì)胞的VIC分析。圖20C顯示了父本基因組DNA的VIC分析。

圖21A-21C：來自從具有男性胎兒的9周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖21A顯示了母本基因組DNA的NED分析。圖21B顯示了樣品細(xì)胞的NED分析。圖21C顯示了父本基因組DNA的NED分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。通過更短的短線形成的圈注明僅在父本譜中發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖22A-22C：來自從具有男性胎兒的9周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖22A顯示了母本基因組DNA的PET分析。圖22B顯示了樣品細(xì)胞的PET分析。圖22C顯示了父本基因組DNA的PET分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。通過更短的短線形成的圈注明僅在父本譜中發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖23A-23D：來自從具有男性胎兒的12周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖23A顯示了母本基因組DNA的FAM分析。圖23B和圖23C各顯示了樣品細(xì)胞的FAM分析。圖23D顯示了父本基因組DNA的FAM分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。通過更短的短線形成的圈注明僅在父本譜中發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖24A-24D：來自從具有男性胎兒的12周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖24A顯示了母本基因組DNA的VIC分析。圖24B和圖24C各顯示了樣品細(xì)胞的VIC分析。圖24D顯示了父本基因組DNA的VIC分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖25A-25D：來自從具有男性胎兒的12周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖25A顯示了母本基因組DNA的NED分析。圖25B和圖25C各顯示了樣品細(xì)胞的NED分析。圖25D顯示了父本基因組DNA的NED分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。

圖26A-26D：來自從具有男性胎兒的12周妊娠女性的外周血分離的4B9細(xì)胞的STR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳。圖26A顯示了母本基因組DNA的PET分析。圖26B和圖26C各顯示了樣品細(xì)胞的PET分析。圖26D顯示了父本基因組DNA的PET分析。通過交替的短線和點(diǎn)形成的圈注明在母本和父本譜中均發(fā)現(xiàn)的等位基因。通過更短的短線形成的圈注明僅在父本譜中發(fā)現(xiàn)的等位基因。

5.詳細(xì)內(nèi)容

5.1.定義

“抗體”是通過至少一個(gè)位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)的抗原識別位點(diǎn)能夠特異性結(jié)合至諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等靶標(biāo)的免疫球蛋白分子。本文使用的術(shù)語不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，還包括其任意抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié)合部分”)或其單鏈、包含抗體的融合蛋白、和包含抗原識別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其他修飾的構(gòu)成，其例如包括但不限于，單鏈(scFv)和域抗體(例如，人類、駱駝科、或鯊魚域抗體)、大抗體、小抗體、胞內(nèi)抗體、雙價(jià)抗體、三價(jià)抗體、四價(jià)抗體、vNAR和雙-scFv(例如參見，Hollinger和Hudson，2005，Nature Biotech 23：1126-1136)?？贵w包括任何類別的抗體，諸如IgG、IgA、或IgM(或其亞類)，且不要求所述抗體必須為任何特定的類別。取決于其重鏈恒定域的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的類別。有5種主要的免疫球蛋白類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些某些免疫球蛋白種類可以進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂?！翱贵w”還包括已經(jīng)過修飾來便于分選和檢測的每種前述抗體/免疫球蛋白類型的任一種，例如如5.3.5節(jié)中所描述。

本文使用的抗體的“抗原結(jié)合部分”，是指保留與給定抗原(例如，靶標(biāo)X)特異性結(jié)合能力的完整抗體的一個(gè)或多個(gè)片段?？贵w的抗原結(jié)合功能可以通過完整抗體的片段展現(xiàn)。結(jié)合片段的實(shí)例包括在術(shù)語“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。

“生物樣品”是其中存在或懷疑存在fNRBC的樣品。在具體實(shí)施方式中，所述生物樣品是母血或其富集fNRBC的級分(例如，來自母本非有核紅細(xì)胞已耗竭的級分)。母血通常在4周、5周、6周、8周、10周、12周、16周、20周、24周、30周或38周的妊娠時(shí)取材，或在前述實(shí)施方式的任意兩個(gè)之間的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行一次或多次取材，例如，4周～38周、4周～10周、4周～16周、4周～24周、5周～16周、5周～24周、5周～38周、6周～12周、6周～16周、6周～30周、6周～20周、8周～38周等等。對于富集fNRBC，進(jìn)行母血取材的最優(yōu)時(shí)間段為約6周～約20周的妊娠。在此時(shí)間段內(nèi)，原始胎兒紅細(xì)胞和成熟胎兒紅細(xì)胞均存在于母體循環(huán)中，從而將通過本公開的方法富集的fNRBC的量最大化。母血可來自單胎或多胎妊娠(例如，雙胞胎、三胞胎、四胞胎)且可包括單性別(男性或女性)或兩種性別的fNRBC。生物樣品的其他類型為血漿、來自絨毛膜絨毛采樣(CVS)活檢的細(xì)胞、或來自臍帶血液經(jīng)皮采樣的細(xì)胞，或其級分。本文使用的“生物樣品”可包括在富集或分離fNRBC中使用的試劑，諸如緩沖液、抗體和核染料。

本文使用的關(guān)于抗體的“競爭”指第一抗體或其抗原結(jié)合部分，以與第二抗體或抗原結(jié)合部分的結(jié)合足夠類似的方式結(jié)合至表位，這樣與不存在第二抗體時(shí)的第一抗體的結(jié)合相比，在存在第二抗體時(shí)，第一抗體與其同源表位的結(jié)合結(jié)果明顯減少。作為另一種選擇，在存在第一抗體時(shí)，第二抗體與其表位的結(jié)合也可以是明顯減少的，但并非必須如此。即在第二抗體不抑制第一抗體與其相應(yīng)的表位結(jié)合的情況下，第一抗體可抑制第二抗體與其表位的結(jié)合。然而，在每個(gè)抗體顯著抑制其他抗體與其同源表位或配體的結(jié)合時(shí)，無論是以相同、更大還是更小的程度，抗體彼此之間對其相應(yīng)的表位的結(jié)合被稱為“交叉競爭”。競爭抗體和交叉競爭抗體均涵蓋在本公開中。

“陰性選擇”是指從混合細(xì)胞群體中耗竭除了靶細(xì)胞以外的細(xì)胞。陰性選擇可基于靶細(xì)胞中不存在的(或在靶細(xì)胞中靶細(xì)胞檢測不到的)標(biāo)志物。陰性選擇還可基于其他標(biāo)準(zhǔn)，例如，大小、形態(tài)學(xué)、或其他物理性質(zhì)。

“陰性免疫選擇”是指使用抗體耗竭細(xì)胞，例如，與除了感興趣的靶細(xì)胞以外的一種或多種細(xì)胞類型選擇性結(jié)合但不與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體。

“陰性免疫選擇抗體”是可以在陰性免疫選擇中使用的抗體，例如，結(jié)合至存在于除了靶細(xì)胞以外的一種或多種類型的細(xì)胞上或細(xì)胞中而在靶細(xì)胞上不存在的標(biāo)志物的抗體。所述抗體與細(xì)胞表面標(biāo)志物或內(nèi)部標(biāo)志物結(jié)合，但標(biāo)志物優(yōu)選為表面標(biāo)志物以避免對固定的需求。

“陽性選擇”是指從混合細(xì)胞群體中選擇包含感興趣的靶細(xì)胞的細(xì)胞(例如，用于富集和/或分離目的)。陽性選擇可以基于靶細(xì)胞上或靶細(xì)胞內(nèi)存在的標(biāo)志物。在某些實(shí)施方式中，所述標(biāo)志物在待分離或富集靶細(xì)胞(例如，當(dāng)靶細(xì)胞是fNRBC時(shí)，母血或母血級分)的群體(例如，生物樣品)中在一種或多種類型的細(xì)胞(除了靶細(xì)胞)中不存在(或在其中或其上檢測不到)。在其它實(shí)施方式中，所述標(biāo)志物在分離或富集靶細(xì)胞的群體中在除了感興趣的靶細(xì)胞以外的任何類型細(xì)胞的中不存在(或在其中或其上檢測不到)。陽性選擇還可基于其他標(biāo)準(zhǔn)，例如，大小、形態(tài)學(xué)、或其他物理性質(zhì)。

“陽性免疫選擇”是指使用抗體選擇細(xì)胞，例如，結(jié)合至感興趣的靶細(xì)胞上或靶細(xì)胞中存在的標(biāo)志物因而對于陽性選擇有用的抗體。

“陽性免疫選擇抗體”是可以在陽性免疫選擇中使用的抗體，例如，結(jié)合至靶細(xì)胞上或靶細(xì)胞中存在的標(biāo)志物的抗體。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與靶細(xì)胞選擇性結(jié)合，但不與其中存在靶細(xì)胞的細(xì)胞群體中存在的一種或多種其他細(xì)胞類型特異性結(jié)合?？贵w可與細(xì)胞表面標(biāo)志物或內(nèi)部標(biāo)志物結(jié)合，但所述標(biāo)志物優(yōu)選為表面標(biāo)志物以避免對固定的需要。

對特定細(xì)胞的“選擇性結(jié)合”是指抗體與混合細(xì)胞群體(例如，生物樣品)中的至少一種細(xì)胞類型之中或其上存在但在所述群體中的至少一種其他類型的細(xì)胞中不存在(或在其中或其上檢測不到)的標(biāo)志物的特定的或優(yōu)選的結(jié)合。例如，如果在含有細(xì)胞類型A、B、C、D、和E的混合細(xì)胞群體中，抗體僅與細(xì)胞類型A或細(xì)胞類型A和E特異性結(jié)合，抗體分別被稱為與細(xì)胞類型A選擇性結(jié)合或與細(xì)胞類型A和E選擇性結(jié)合。

與抗體和其他物質(zhì)的結(jié)合相比，如果抗體與靶標(biāo)的結(jié)合具有更強(qiáng)的親和力、親合性、更容易結(jié)合、和/或結(jié)合時(shí)間更長，則抗體與該靶標(biāo)“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”。例如，與fNRBC上存在的標(biāo)志物特異性或優(yōu)先結(jié)合的抗體是如下的抗體：該抗體與上述標(biāo)志物的結(jié)合相比該抗體和其它標(biāo)志物的結(jié)合具有更強(qiáng)的親和力、親合性、更容易結(jié)合、和/或結(jié)合時(shí)間更長。特異性結(jié)合或優(yōu)先結(jié)合不是必須要求(但其可以包括)排他性結(jié)合。通常(但不是必須)，提及“結(jié)合”是指優(yōu)先結(jié)合(preferential binding)。

5.2.預(yù)富集

為了改善fNRBC的富集，可以在陽性和優(yōu)化選擇步驟前進(jìn)行預(yù)富集步驟。下面描述示例性預(yù)富集過程。

密度分離是根據(jù)細(xì)胞大小、形狀和密度進(jìn)行細(xì)胞分離的技術(shù)。通過不同密度的分層溶液(致密端在管底部)在離心管中產(chǎn)生密度梯度。即使以相對低的離心速度，細(xì)胞通常在蔗糖或其他惰性碳水化合物的淺層梯度上分離。

不連續(xù)密度梯度離心通常用于從粒細(xì)胞和紅細(xì)胞中分離外周血單核細(xì)胞。例如在被稱為Ficoll密度分離中，全血分層在之上，然后離心。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和部分單核細(xì)胞沉降為細(xì)胞團(tuán)塊，而其余的單核細(xì)胞沉降至Ficoll血漿界面。使用Ficoll的示例性密度分離過程在7.1節(jié)中進(jìn)行描述。

作為另一種選擇，可以聚集成人紅細(xì)胞而將其從生物樣品中耗竭，從而能夠富集含fNRBC的單核細(xì)胞級分。如果允許抗凝血液在管中沉淀，可以在1.5小時(shí)或更長之后除去白細(xì)胞之上的紅細(xì)胞沉降物，及富含白細(xì)胞的血漿層。由于紅細(xì)胞結(jié)塊的自發(fā)傾向，紅細(xì)胞沉降比白細(xì)胞更快。通過添加聚集劑可以加速紅細(xì)胞的沉降。示例性聚集劑為諸如多糖和合成聚合物等非離子型聚合物。在某些實(shí)施方式中，聚合物為分子量為60,000至500,000的葡聚糖、分子量為360,000的聚乙烯吡咯烷酮和分子量為20,000的聚氧乙烯(POE)。可以將聚集劑添加到含有生物樣品的緩沖液中。

5.3.fNRBC的富集

本公開的方法限定了一種或多種用于富集和/或分離fNRBC的陽性選擇過程，通常限定了至少一種使用與fNRBC結(jié)合的抗體的陽性免疫選擇步驟。陽性免疫選擇可以與陰性選擇(例如，陰性免疫選擇)結(jié)合使用以從生物樣品中耗竭除fNRBC外的一種或多種細(xì)胞類型，例如，母本淋巴細(xì)胞。

為了實(shí)施陽性免疫選擇，將陽性免疫選擇抗體添加到生物樣品中。通過進(jìn)行檢測分離和分析可以經(jīng)驗(yàn)性地確定結(jié)合NRBC所需的抗體的量。細(xì)胞與抗體溫育足夠形成復(fù)合物的時(shí)間段，通常至少約5分鐘，更通常至少約10分鐘，且通常不大于1小時(shí)，更通常不大于約30分鐘。

可以將生物樣品與本文描述的另外的陽性選擇和/或陰性選擇試劑進(jìn)行額外的溫育，這可以同時(shí)進(jìn)行或依次進(jìn)行。

根據(jù)特定的抗體制備而分離標(biāo)記的細(xì)胞。熒光染料標(biāo)記的抗體對于FACS分離、用于免疫磁性選擇、特別是高梯度磁性選擇(HGMS)的磁性顆粒等是有用的。示例性磁性分離設(shè)備描述在WO 90/07380、PCT/US96/00953和EP 438,520中。

可以使用諸如超濾或微流體分離等其他自動化方法進(jìn)行選擇和/或陰性選擇。

5.3.1.陽性選擇

本公開的陽性選擇試劑可以是用來將生物樣品中的fNRBC與所述樣品中至少一種其他類型的細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分的任何試劑。

用于fNRBC富集的優(yōu)選方法是在液體介質(zhì)中進(jìn)行的陽性免疫選擇方法的應(yīng)用。通常，陽性免疫選擇方法使用陽性免疫選擇抗體。在某些方面中，在陽性免疫選擇過程中使用多個(gè)陽性免疫選擇抗體。

因此，在某些方面中，本公開提供了一種fNRBC的制備方法，其包括：使包含fNRBC的生物樣品進(jìn)行陽性免疫選擇，所述陽性免疫選擇包括以下步驟：(a)在液體介質(zhì)中用陽性免疫選擇抗體接觸生物樣品，其中相對于所述生物樣品中的一種或多種其他細(xì)胞類型，所述陽性免疫選擇抗體與fNRBC選擇性結(jié)合；及(b)選擇與所述陽性免疫選擇抗體結(jié)合的細(xì)胞。

5.3.2.陽性選擇標(biāo)志物和抗體

fNRBC的陽性選擇標(biāo)志物包括血型糖蛋白A(也被稱為CD235a)、“i”抗原、CD36、CD71及核標(biāo)志物。當(dāng)下游分析允許細(xì)胞固定(例如，F(xiàn)ISH)時(shí)，胎兒血紅蛋白可以是陽性選擇標(biāo)志物。

表達(dá)標(biāo)志物血型糖蛋白A、“i”抗原、CD36、CD71和胎兒血紅蛋白的細(xì)胞可以使用針對所述標(biāo)志物的抗體進(jìn)行選擇(例如，分選或富集)。

與母本紅細(xì)胞相反，fNRBC是有核的并可以使用諸如Hoechst 33342、LDS751、TO-PRO、DC-Ruby及DAPI等核染料進(jìn)行選擇。

在某些實(shí)施方式中，使用單克隆抗體4B9選擇fNRBC。產(chǎn)生抗體4B9的雜交瘤保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zelkulturen GmbH中，其檢索號為DSM ACC 2666fNRBCs(參見Hollmann等的美國專利7,858,757 B2和8,563,312 B2)。在其他實(shí)施方式中，使用和4B9競爭與fNRBC表面的結(jié)合的抗體來選擇fNRBC。例如，單克隆抗體4B8與4B9競爭結(jié)合至fNRBC(參見Hollmann等的美國專利7,858,757 B2和8,563,312 B2)。

可以使用Hollmann等的方法產(chǎn)生結(jié)合fNRBC的其他抗體。其與4B9競爭結(jié)合fNRBC的能力使用競爭檢測來測試。在競爭檢測的一個(gè)實(shí)例中，使用4B9抗體分離其靶抗原(例如，來自胎兒肝細(xì)胞)，該靶抗原附著到固體表面上(例如，微孔板)。將在緩沖液中連續(xù)稀釋的亞飽和量的生物素化的和未標(biāo)記的4B9或候選競爭抗體(“測試”抗體)的混合物添加至孔和板中，并輕輕振動溫育1小時(shí)。沖洗板，將在ELISA緩沖液中稀釋的HRP-結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素添加至各孔和板中，溫育1小時(shí)。沖洗板，通過添加底物(例如，TMB，Biofx Laboratories Inc.，Owings Mills，Md.)來檢測結(jié)合的抗體。通過加入終止緩沖液(例如，Bio FX終止試劑，Biofx Laboratories Inc.，Owings Mills，Md.)來終止反應(yīng)，并使用微孔板讀板器(例如，VERSAmax，Molecular Devices，Sunnyvale，Calif.)在650nm處測量吸光度。作為另一種選擇，可以使用全fNRBC來代替分離抗原。在一種方法中，將1微克/毫升的結(jié)合第一熒光染料(例如，F(xiàn)ITC)的4B9添加至含有1×10⁵個(gè)胎兒肝細(xì)胞的微量滴定孔中。結(jié)合第二熒光染料(例如，藻紅蛋白)的檢測抗體以從10微克/毫升到0.001微克/毫升降低(5個(gè)1:2的連續(xù)稀釋液)的濃度滴定。測量兩種抗體的平均熒光強(qiáng)度。當(dāng)檢測抗體以與對照抗體相同濃度或更低的濃度添加時(shí)，如果對照抗體的MFI減少了至少50％，則認(rèn)為檢測抗體與4B9競爭。在某些實(shí)施方式中，MFI減少至少60％、至少70％或至少80％。競爭檢測的其他形式是本領(lǐng)域已知的，且可以采用。

5.3.3.陰性選擇

通常，本公開的陰性選擇方法使用一種或多種不識別fNRBC的試劑。在某些方面中，所述試劑是陰性免疫選擇抗體。

因此，陰性免疫選擇可包括以下步驟：(a)在液體介質(zhì)中用陰性免疫選擇抗體接觸生物樣品，其中，相對于fNRBC，陰性免疫選擇抗體選擇性結(jié)合生物樣品中的其他細(xì)胞；及(b)選擇不與所述陰性免疫選擇抗體結(jié)合的細(xì)胞。如果進(jìn)行陰性選擇，其可在陽性免疫選擇之前、之后進(jìn)行、或與陽性免疫選擇同時(shí)進(jìn)行。

5.3.4.陰性選擇標(biāo)志物和抗體

陰性選擇試劑可以是用于在生物樣品中將除fNRBC外的細(xì)胞與fNRBC分離的任何試劑。

所述試劑優(yōu)選為與存在于母體細(xì)胞(即成熟細(xì)胞)的細(xì)胞表面上但在fNRBC細(xì)胞表面上不存在的抗原結(jié)合的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，陰性免疫選擇抗體包括抗-CD45抗體。可以使用一種或多種陰性免疫選擇抗體，優(yōu)選為抗一種或多種造血細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體。示例性細(xì)胞表面標(biāo)志物包括：(a)諸如CD3、CD4或CD8等T-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物；(b)諸如CD19、CD20、或CD32等B-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物；(c)諸如CD45等泛淋巴細(xì)胞標(biāo)志物；(d)諸如CD56等NK細(xì)胞表面標(biāo)志物；(e)諸如CD11c或CD23等樹突細(xì)胞表面標(biāo)志物；及(f)諸如CD14或CD33等巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物。在特定的實(shí)施方式中，使用至少兩種、三種、四種、或五種陰性免疫選擇抗體。

5.3.5.抗體標(biāo)記

方便而言，用于本公開的陽性和陰性選擇過程的抗體和核染料可以是經(jīng)修飾的，以允許從其他細(xì)胞類型中選擇和分離fNRBC。修飾的抗體可以包括允許分選和檢測的任何分子或物質(zhì)，例如磁珠或熒光染料。在特定的實(shí)施方式中，抗體與比色分子、熒光部分、化學(xué)發(fā)光體部分、抗原、酶、可檢測的珠(諸如磁性珠或電子致密的(例如，金)珠)或結(jié)合其他分子(例如，生物素或抗生蛋白鏈菌素)的分子結(jié)合。

熒光染料可以與熒光激活細(xì)胞分選器一起使用。多色分析可以與FACS一同使用，或以免疫磁性分離和流式細(xì)胞術(shù)的組合使用。多色分析對于基于多種表面抗原的細(xì)胞分離是重要的?？稍诙嗌治鲋惺褂玫臒晒馊玖习ㄔ迥懙鞍?，例如，藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白；熒光素及德克薩斯紅。陰性代稱表明染色水平處于或低于同種型匹配的陰性對照的亮度。暗淡(dim)代稱表明染色水平在陰性染色的水平附近，但也可能比同種型匹配的對照更亮。優(yōu)選地，本公開的陽性免疫選擇抗體相對于fNRBC引起“明亮”代稱，而相對于在存在fNRBC的生物樣品(諸如母血)中可以存在的一種或多種其他細(xì)胞類型引起“陰性”或“暗淡”代稱。優(yōu)選地，本公開的陰性免疫選擇抗體相對于在存在fNRBC的生物樣品(諸如母血)中可以存在的一種或多種其他細(xì)胞類型引起“陰性”或“暗淡”代稱。

在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫選擇抗體直接或間接綴合至磁性試劑，諸如超順磁性微粒(微粒)。使用如本領(lǐng)域已知的多種化學(xué)連接基團(tuán)獲得與磁性顆粒的直接綴合。通過側(cè)鏈氨基或巰基和多官能交聯(lián)劑，抗體可以連接到微顆粒。用于連接實(shí)體的大量的多官能化合物是可利用的。優(yōu)選的連接基團(tuán)為3-(2-二硫代吡啶)丙酸N-羥基丁二酰亞胺酯(SPDP)或4-(N-馬來酰亞氨基甲基)-環(huán)己烷-1-甲酸N-羥基丁二酰亞胺酯(SMCC)，其具有在抗體上的反應(yīng)性巰基和在磁性顆粒上的反應(yīng)性氨基。

作為另一種選擇，免疫選擇抗體不直接連接到磁性顆粒上?？贵w直接綴合到半抗原上，半抗原特異性的第二階段抗體綴合到所述顆粒上。適合的半抗原包括地高辛、異羥基洋地黃毒苷、FITC、二硝基苯基、硝基苯基、抗生物素蛋白、生物素等。半抗原與蛋白質(zhì)的綴合方法為本領(lǐng)域已知的，且用于所述結(jié)合的試劑盒可商購。

熒光標(biāo)簽可以包括羅丹明、鑭系磷光體(lanthanide phosphor)、熒光素及其衍生物、熒光染料、GFP(GFP代表“綠色熒光蛋白”)、丹酰、傘形花內(nèi)酯、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二甲醛及熒光胺。

酶標(biāo)簽可以包括辣根過氧化物酶、β半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶及過氧化物酶。

化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽或化學(xué)發(fā)光體，諸如異魯米諾、魯米諾和二氧雜環(huán)丁烷。

其他可檢測部分包括諸如生物素、洋地黃毒苷或5-溴脫氧尿苷等分子。

在某些實(shí)施方式中，用于選擇或檢測免疫選擇抗體不直接進(jìn)行修飾，但用作一抗?？梢允褂美缤ㄟ^附著到磁珠或熒光染料上修飾的二抗來選擇或檢測與一抗結(jié)合的細(xì)胞。

5.3.6.選擇技術(shù)

免疫選擇步驟可以使用磁性分離(例如，使用抗體涂覆的磁珠)，或流式細(xì)胞術(shù)。通過例如熒光激活細(xì)胞分選器的應(yīng)用，流式細(xì)胞技術(shù)可以提供準(zhǔn)確分離，其可具有不同的復(fù)雜程度，諸如多色通道、低角度和鈍光散射檢測通道、阻抗通道等。

在各個(gè)方面中，磁性分離(例如，MACS)和流式細(xì)胞術(shù)(例如，F(xiàn)ACS)均可用于富集fRNBC。MACS和FACS中的每一種可用于陰性選擇和/或陽性選擇。在某些實(shí)施方式中，在使用FACS的陰性選擇和/或陽性選擇之前，進(jìn)行使用MACS的陽性和/或陰性選擇。因此，本公開提供富集fNRBC的方法，其包括以下的任意組合：(A)使用MACS的陰性選擇，(B)使用MACS的陽性選擇，(C)使用FACS的陰性選擇；及(D)使用FACS的陽性選擇。實(shí)施方式的示例性組合為：(1)A然后B然后D；(2)A然后D；(3)A然后B然后同時(shí)C+D；(4)A然后同時(shí)C+D；(5)B然后D；及(6)B然后同時(shí)C+D。前述選擇步驟中的每一個(gè)可以使用一種、兩種、三種或更多種試劑，例如，抗體和在陽性選擇的情況下的核染料。

方便而言，抗體與標(biāo)簽綴合，例如，磁珠和熒光染料，以使fNRBC容易從其他細(xì)胞類型中分離。熒光染料可以與熒光激活細(xì)胞分選器一起使用。多色分析可以與FACS一起采用或者在免疫磁性分離和流式細(xì)胞術(shù)的組合中使用。多色分析對于基于多種表面抗原的細(xì)胞分離是重要的。在多色分析中可使用的熒光染料包括藻膽蛋白，例如，藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白；熒光素及德克薩斯紅。陰性代稱表明染色水平處于或低于同種型匹配的陰性對照的亮度。暗淡(dim)代稱表明染色水平在陰性染料的水平附近，但也可能比同種型匹配的對照更亮。優(yōu)選地，本公開的陽性免疫選擇抗體相對于fNRBC引起“明亮”代稱，而相對于在存在fNRBC的生物樣品(諸如母血)中可以存在的一種或多種其他細(xì)胞類型引起“陰性”或“暗淡”代稱。優(yōu)選地，本公開的陰性免疫選擇抗體相對于在存在fNRBC的生物樣品(諸如母血)中可以存在的一種或多種其他細(xì)胞類型引起“陰性”或“暗淡”代稱。

在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫選擇抗體直接或間接綴合磁性試劑，諸如超順磁性微粒(微粒)。使用如本領(lǐng)域已知的多種化學(xué)連接基團(tuán)獲得與磁性顆粒的直接綴合。通過側(cè)鏈氨基或巰基和多官能交聯(lián)劑，抗體可以連接到微顆粒。用于連接實(shí)體的大量的多官能化合物是可利用的。優(yōu)選的連接基團(tuán)為3-(2-二硫代吡啶)丙酸N-羥基丁二酰亞胺酯(SPDP)或4-(N-馬來酰亞氨基甲基)-環(huán)己烷-1-甲酸N-羥基丁二酰亞胺酯(SMCC)，其具有在抗體上的反應(yīng)性巰基和在磁性顆粒上的反應(yīng)性氨基。

作為另一種選擇，免疫選擇抗體不直接連接到磁性顆粒上。抗體直接綴合到半抗原上，而半抗原特異性的第二階段抗體綴合到所述顆粒上。適合的半抗原包括地高辛、異羥基洋地黃毒苷、FITC、二硝基苯基、硝基苯基、抗生物素蛋白、生物素等。半抗原與蛋白質(zhì)的綴合方法為本領(lǐng)域已知的，且用于所述綴合的試劑盒可商購。

為了實(shí)施陽性免疫選擇方法，將陽性免疫選擇抗體添加到生物樣品中。通過進(jìn)行檢測分離和分析可以經(jīng)驗(yàn)性地確定結(jié)合NRBC所需的抗體的量。細(xì)胞和抗體溫育足夠形成復(fù)合物的時(shí)間段，通常至少約5分鐘，更通常至少約10分鐘，且通常不大于1小時(shí)，更通常不大于約30分鐘。

生物樣品可能額外地與如本文描述的額外的陽性和/或陰性免疫選擇抗體進(jìn)行溫育。根據(jù)特定的抗體制備分離標(biāo)記的細(xì)胞。熒光染料標(biāo)記的抗體對于FACS分離、用于免疫磁性選擇、特別是高梯度磁性選擇(HGMS)的磁性顆粒等是有用的。示例性磁性分離設(shè)備描述在WO 90/07380、PCT/US96/00953和EP 438,520中。

可以使用諸如超濾或微流體分離等其他自動化方法進(jìn)行陽性免疫選擇和/或陰性免疫選擇。

本公開的方法優(yōu)選以在液相中的一個(gè)或多個(gè)陽性免疫選擇步驟和具有可溶形式(即，不固定在固體表面)的一種或多種陽性免疫選擇抗體時(shí)進(jìn)行。本公開的方法可以適用于包括一個(gè)或多個(gè)其中陽性和/或免疫選擇抗體結(jié)合至固體表面的步驟。用于細(xì)胞捕獲的固體表面上固定的4B9例如為2011年11月14日提交的美國申請13/295,532和2013年5月16日公開的US 2013/0122492中所描述，其內(nèi)容以其整體作為參考并入本文。

5.4.下游分離技術(shù)

陽性選擇(及可選的陰性選擇)之后，可以通過在固體表面上捕獲(例如，用諸如4B9等陽性免疫選擇抗體或二抗來捕獲陽性免疫選擇抗體結(jié)合的細(xì)胞)或諸如微操作等物理技術(shù)而分離fNRBC。

附著到陽性免疫選擇抗體上的可檢測部分可以用于鑒定和分離胎兒NRBC。微操作可以在顯微鏡下進(jìn)行或通過其他視覺增強(qiáng)或輔助進(jìn)行?？梢酝ㄟ^自動化過程或通過使用手動微操作設(shè)備進(jìn)行微操作。例如，微操作可以選擇或分離單個(gè)fNRBC或多個(gè)fNRBC。例如，通過微操作可以分離1個(gè)、5個(gè)、10個(gè)或20個(gè)細(xì)胞的組，并放置在1個(gè)、5個(gè)、10個(gè)或20個(gè)細(xì)胞的獨(dú)立的樣品管內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，通過微操作分離1組、2組、3組、4組或5組的1個(gè)～20個(gè)細(xì)胞(例如，1個(gè)～5個(gè)細(xì)胞、1個(gè)～10個(gè)細(xì)胞、5個(gè)～20個(gè)細(xì)胞、或5個(gè)～10個(gè)細(xì)胞)。

在某些實(shí)施方式中，額外的分離技術(shù)(例如，微操作)可利用用于富集細(xì)胞的熒光標(biāo)簽、fNRBC中血紅蛋白的存在(通過Soret帶通濾光器可檢測)和fNRBC形態(tài)特征(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol Hum Repro9：227-35)。

5.5.fNRBC群體

本公開進(jìn)一步提供通過本文描述的方法制備或可得的fNRBC制備。示例性制備包括包含fNRBC的細(xì)胞群體。

在某些實(shí)施方式中，通過如第6節(jié)所描述的任意工作流程從母血(例如，約4周～約38周的妊娠之間或約6周～約20周的妊娠之間提取的母血)中獲得或可得的細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方式中，對于陽性和/或陰性富集，工作流程需要密度梯度分離和流式細(xì)胞術(shù)(例如，F(xiàn)ACS)，具有或不具有干涉MACS步驟。

在某些方面中，所述群體包含大約10個(gè)、25個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、500個(gè)、或1,000個(gè)細(xì)胞或FACS“事件”，或者包含上述值的任何一對之間范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù)或FACS“事件”的群體，例如，大約25個(gè)～200個(gè)、大約50個(gè)～500個(gè)、大約10個(gè)～300個(gè)、大約50個(gè)～1,000個(gè)細(xì)胞或FACS“事件”，等等。優(yōu)選至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％的細(xì)胞是fNRBC，或者至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％FACS“事件”對應(yīng)fNRBC。在某些實(shí)施方式中，群體中的fNRBC或?qū)?yīng)fNRBC的FACS“事件”的比例在上述值的任意兩個(gè)的范圍內(nèi)，例如，2％～20％、5％～10％、5％～20％、3％～15％等等。

fNRBC可以是原始fNRBC、成熟的fNRBC或兩者的混合物。在某些實(shí)施方式中，原始和成熟fNRBC的比例是在約6周～約20周妊娠的母血中發(fā)現(xiàn)的比例。fNRBC可以結(jié)合了抗體，例如，本文描述的一種或多種陽性免疫選擇抗體，或者無抗體。例如可以通過從細(xì)胞中去除陽性免疫選擇抗體制備無抗體的fNRBC。

當(dāng)從母血樣品中制備fNRBC時(shí)，群體中剩余的細(xì)胞通常是一種或多種妊娠過程中在母血中存在的細(xì)胞類型。母體細(xì)胞可以與抗體結(jié)合，例如，一種或多種本文描述的陰性免疫選擇抗體，或甚至與一種或多種陽性免疫選擇抗體結(jié)合，或者無抗體。例如可以通過從細(xì)胞中去除結(jié)合的抗體而制備無抗體的母體細(xì)胞。

5.6.fNRBC的驗(yàn)證

可以采用涉及例如使用短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分析、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析或單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析來產(chǎn)生遺傳譜的遺傳指紋分析方法驗(yàn)證通過本文描述的方法分離的fNRBC為胎兒細(xì)胞。通過比較分離的細(xì)胞產(chǎn)生的譜與母體細(xì)胞(和可選的父本細(xì)胞)產(chǎn)生的譜，可以驗(yàn)證所分離的細(xì)胞為胎兒細(xì)胞的身份。用于產(chǎn)生遺傳譜的適合的試劑盒可商購。例如，來自Promega的Fusion STR試劑盒及來自Affymetrix的全基因組人類SNP陣列6.0可以分別用于產(chǎn)生STR和SNP譜，其可以用來驗(yàn)證fNRBC的身份。在某些實(shí)施方式中，全基因組擴(kuò)增(WGA)用于增加分析可利用的遺傳材料的量。

5.7.下游分析

所述制備可以用于胎兒診斷檢測，例如，用于測定多胎妊娠或胎兒異常的存在?？梢杂糜跈z測的異常的實(shí)例包括13-三體綜合癥、18-三體綜合癥、21-三體綜合癥、唐氏綜合癥、壓力易感性神經(jīng)病、神經(jīng)纖維瘤病、阿拉吉?dú)W綜合癥、軟骨發(fā)育不全癥、亨廷頓氏病、α-甘露糖苷貯積癥、β-甘露糖苷貯積癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、范-瑞克林豪森氏病、結(jié)節(jié)性硬化癥、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞疾病、泰-薩二氏病、β-地中海貧血、粘多醣貯積癥、苯丙酮尿癥、瓜氨酸尿癥、半乳糖血癥、半乳糖激酶和半乳糖4-差向異構(gòu)酶缺乏癥，腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、甲基丙二酸尿癥、丙酸血癥、法伯病、巖藻糖苷貯積癥、神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥、高歇氏病、I-細(xì)胞病、III型粘脂貯積病、尼曼-匹克病、唾液酸沉積癥、沃耳曼氏病、腦肝腎綜合癥、胱氨酸病、凝血因子X缺陷癥、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、布洛姆氏綜合癥、羅伯特綜合癥、著色性干皮病、脆性(X)綜合癥、性染色體非整倍體、克萊恩費(fèi)爾特綜合癥、特納氏綜合癥、XXX綜合癥、類固醇硫酸酯酶缺乏癥、具有線性皮膚缺損的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色體上的睪丸決定因子、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、葡萄糖6-磷酸脫氫酶缺乏癥、萊施-奈恩綜合癥、安德森-費(fèi)勃萊氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥、Becker型肌營養(yǎng)不良癥、(17)(p11.2p11.2)重復(fù)綜合癥、16p11.2缺失、16p11.2重復(fù)，線粒體缺陷、(22)(q11.2q11.2)重復(fù)綜合癥、貓眼綜合癥、貓叫綜合癥、Wolf-Hirschhorn綜合癥、Williams-Beuren綜合癥、Charcot-Marie-Tooth病、染色體重排、染色體缺失、Smith-Magenis綜合癥、腭心面綜合癥、迪喬治綜合癥、1p36缺失、普拉德-威利綜合癥、精子缺乏(因子a)，精子缺乏(因子b)，精子缺乏(因子c)，脊柱裂、無腦畸形、神經(jīng)管缺損、小頭畸形、腦積水、腎缺如、Kallmann綜合癥、腎上腺發(fā)育不良、Angelman綜合癥、腎囊腫、囊性水瘤、胎兒水腫、臍膨出和腹裂、膈疝、十二指腸閉鎖、骨骼發(fā)育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿癥、楓糖尿病、3-甲基巴豆酰輔酶A，羧化酶缺乏癥，肝醣貯積癥、腎上腺增生、低磷酸酯酶癥、胎盤類固醇硫酸酯酶缺乏癥，重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥、T-細(xì)胞免疫缺陷、埃勒斯-當(dāng)洛斯綜合癥、成骨不全癥、成人多囊腎疾病、范科尼氏貧血癥、大皰性表皮松解癥綜合癥、少汗型外胚層發(fā)育不良癥、先天性腎變病(芬蘭型)和多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤。

診斷檢測可以是核酸(例如，DNA或RNA)檢測、蛋白質(zhì)(例如，基于抗體的)檢測、或組織學(xué)檢測，或其組合。DNA檢測的實(shí)例包括FISH、PCR和DNA測序檢測。RNA檢測的實(shí)例包括RT-PCR檢測和FISH檢測。為了方便得到核酸，在進(jìn)行診斷檢測前，可以對fNRBC進(jìn)行裂解或透化(permeabilized)。DNA、RNA和蛋白質(zhì)檢測可以在微陣列上進(jìn)行。下面描述例示性方法。

在某些實(shí)施方式中，可以通過全基因組擴(kuò)增(WGA)擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞或者二個(gè)以上至四個(gè)以上的細(xì)胞的組以提供足夠的分析用核酸。包含5個(gè)以上胎兒NRBC的細(xì)胞組可以不使用全基因組擴(kuò)增(WGA)而進(jìn)行分析。WGA是指個(gè)體的細(xì)胞或細(xì)胞組的整個(gè)基因組的擴(kuò)增。例如，可以使用單個(gè)細(xì)胞的遺傳材料擴(kuò)增基因組(即，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(SCWGA))。

使用來自通過本公開的方法產(chǎn)生的來自裂解的胎兒NRBC的染色體或核酸，通過包括熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、多次復(fù)性環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(MALBAC)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析和DNA測序等多種方法中的任意一種，可檢測染色體異常、單基因異常、等位基因變異和單核苷酸多態(tài)性(SNP)。PCR技術(shù)可以是簡單的PCR擴(kuò)增技術(shù)或定量PCR、實(shí)時(shí)PCR或逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)。其他有用的遺傳分析技術(shù)包括陣列比較基因組雜交(CGH)和在DNA微陣列中進(jìn)行分析。例如，可以在產(chǎn)前染色體微陣列中分析胎兒NRBC。

單倍型是共同出現(xiàn)的且位于染色體上相鄰位置的等位基因的組合?？梢栽趩位蜃蛟诙嗷蜃习l(fā)現(xiàn)單倍型。單倍型可以出現(xiàn)在整個(gè)染色體中。單倍型可以包括任意數(shù)量的重組事件。單倍型還可以涉及一組相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)在存在從正常(例如，野生型)核苷酸序列的單核苷酸(例如，A、T、C或G)的變異時(shí)出現(xiàn)。例如，單核苷酸多態(tài)性可以導(dǎo)致等位基因變異體。已知的等位基因可通過單核苷酸多態(tài)性或通過多個(gè)核苷酸變化而限定。

限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是在DNA的同源序列上的差異。其可以使用特定的限制性內(nèi)切酶或限制性內(nèi)切酶的組合消化DNA后發(fā)現(xiàn)的片段長度的差異來檢測。RFLP可以通過凝膠電泳或Southern印記來測定。

熒光原位雜交(FISH)是通過熒光探針結(jié)合與熒光探針互補(bǔ)的固定的核酸序列部分進(jìn)行的。FISH可以用于出現(xiàn)在核酸序列在更大的核酸序列中的特定位置對RNA或DNA中的靶核酸序列進(jìn)行熒光標(biāo)記。例如，F(xiàn)ISH可以用于在染色體上標(biāo)記靶序列?？梢允褂脽晒怙@微鏡觀察熒光探針。

PCR用來通過使用兩個(gè)引物擴(kuò)增特定核酸序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝(即，擴(kuò)增子)。PCR方法易于利用并且常用于診斷遺傳性疾病。

定量PCR(qPCR)基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其用于擴(kuò)增并同時(shí)對核酸序列的拷貝總數(shù)或相對拷貝數(shù)進(jìn)行定量。qPCR的一個(gè)實(shí)例為實(shí)時(shí)PCR。在實(shí)時(shí)PCR中，由PCR產(chǎn)生的核酸拷貝的數(shù)量或相對數(shù)量是實(shí)時(shí)檢測的。qPCR產(chǎn)生的拷貝的數(shù)量或相對數(shù)量可以使用由熒光染料產(chǎn)生的信號檢測及定量。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)是可以用于檢測RNA分子或測定特定的RNA序列(例如，mRNA)表達(dá)水平的方法，其通過將RNA分子轉(zhuǎn)錄為DNA拷貝(cDNA)并擴(kuò)增該DNA來進(jìn)行。RT-PCR可以通過一步法或兩步法進(jìn)行。

陣列比較基因組雜交(陣列CGH)是用于測定在全基因組范圍內(nèi)發(fā)生的染色體拷貝數(shù)變異的微陣列技術(shù)。陣列CGH將檢測基因組與正常(例如，野生型)基因組進(jìn)行比較以檢測甚至相對小的(例如，200個(gè)堿基對)結(jié)構(gòu)變異。例如，陣列CGH可以檢測缺失、擴(kuò)增、斷點(diǎn)或非整倍性。陣列CGH還可以用于檢測發(fā)展癌癥的傾向。

多次復(fù)性環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(MALBAC)是一種全基因組擴(kuò)增方法。MALBAC可用于單個(gè)細(xì)胞、全基因組擴(kuò)增。MALBAC可以用于以擬線性模式擴(kuò)增基因組并避免了優(yōu)選擴(kuò)增某些DNA序列。在MALBAC中，擴(kuò)增子可以具有互補(bǔ)末端，其在擴(kuò)增子中形成環(huán)，并因此防止了擴(kuò)增子的指數(shù)拷貝。擴(kuò)增子環(huán)可以防止擴(kuò)增偏差。MALBAC可以使用單個(gè)fNRBC應(yīng)用于診斷胎兒異常，或可以使用單個(gè)fNRBC用于鑒定胎兒發(fā)展癌癥的傾向。

下一代測序(NGS)是一組用于檢測胎兒異常的高通量測序技術(shù)。NGS(例如，大規(guī)模平行測序)使用小到單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞樣品而對大段核酸序列或整個(gè)基因組進(jìn)行測序。例如，在NGS中，可以從來自小片段(即，讀出)的文庫的基因組DNA(gDNA)樣品中同時(shí)對很多相對小的核酸序列測序。然后對所述讀出進(jìn)行重組以鑒定染色體的大核酸序列或完整核酸序列。例如，在NGS中，至多500,000個(gè)測序操作可以平行運(yùn)行。NGS是一種單個(gè)細(xì)胞形式的全基因組擴(kuò)增(WGA)。例如，當(dāng)其后進(jìn)行傳統(tǒng)PCR時(shí)，MALBAC可以用于NGS。

大規(guī)模平行信號測序(MPSS)是NGS的一個(gè)實(shí)例。MPSS識別來自17個(gè)～20個(gè)堿基對信號引物序列的mRNA轉(zhuǎn)錄?？梢允褂肕PSS而對樣品中的mRNA轉(zhuǎn)錄進(jìn)行鑒定和定量(Brenner等，2000，Nature biotechnology 18(6)：630-634，2000)。

Polony測序是NGS的另一個(gè)實(shí)例。Polony測序可以用于平行讀取數(shù)百萬固定的DNA序列。已發(fā)現(xiàn)Polony測序是非常準(zhǔn)確(低錯(cuò)誤率)的多路測序技術(shù)(Shendure等，2004。Nature Reviews Genetics 5(5)：335-344，2004；Shendure等，2008，Nature Biotech26(10)：1135-1145)。

454焦磷酸測序是NGS的另一個(gè)實(shí)例。454焦磷酸測序使用熒光素酶來檢測添加到新生DNA中的獨(dú)立的核苷酸。454焦磷酸測序在油溶液中擴(kuò)增包含在水滴中的DNA。每個(gè)水滴包含一個(gè)附著到引物包被的珠上的DNA模板(Vera等，2008，Molecular Ecology 17(7)：1636-1647)。

Illumina測序是NGSd的另一個(gè)實(shí)例。在Illumina測序中，DNA分子和引物附著到載玻片上。形成通過聚合酶和DNA克隆(DNA簇)擴(kuò)增的DNA分子(Shendure等，2008，Nature Biotech 26(10)：1135-1145；Meyer等，2010，Cold Spr Hbr Protocols2010(6)：pdb-prot 5448)。

通過寡核苷酸連接測序和檢測(SOLiD測序)是NGS的另一個(gè)實(shí)例。SOLiD測序是通過連接進(jìn)行測序的方法。SOLiD測序同時(shí)隨機(jī)產(chǎn)生數(shù)千個(gè)小序列讀出，并將所述DNA片段固定在固體支持物上用于測序(Shendure等，2008，Nature Biotech 26(10)：1135-1145；Meyer等，2009，New Biotechnology 25(4)：195-203)。

離子激流半導(dǎo)體測序是NGS的另一個(gè)實(shí)例。離子激流半導(dǎo)體測序是通過合成測序的方法，其在DNA聚合過程中檢測氫離子的釋放。將三磷酸脫氧核糖核苷酸引入含有模板DNA鏈的微孔以進(jìn)行測序。當(dāng)dNTP與先導(dǎo)模板核苷酸互補(bǔ)時(shí)，dNTP被納入到互補(bǔ)DNA鏈中，氫離子釋放(Quail等，2012，BMC Genomics 13(1)：341)。

DNA納米球測序是NGS的另一個(gè)實(shí)例。DNA納米球測序可以用于測定生物體的整個(gè)基因組序列，諸如，例如新發(fā)現(xiàn)的生物體。使用滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增基因組DNA的小片段以形成DNA納米球。然后通過使用熒光探針作為引導(dǎo)連接DNA序列(Ansorge等，2009，New Biotechnology 25(4)：195-203；Drmanac等，2010，Science 327(5961)：78-81)。

Heliscope單分子測序是NGS的另一個(gè)實(shí)例。Heliscope單分子測序是直接測序方法，其不要求連接或PCR擴(kuò)增。DNA經(jīng)剪切，以poly-A尾部結(jié)尾，然后用oligo(dT)雜交到流動細(xì)胞的表面。然后可以對數(shù)十億的分子進(jìn)行平行測序(Pushkarev等，2009，Nature Biotechnology 27(9)：847-850)。

單分子實(shí)時(shí)(SMRT)測序是NGS的另一個(gè)實(shí)例。SMRT測序是一種通過合成測序的方法。DNA在被稱為零模波導(dǎo)(ZMW)的小孔樣容器中合成。附著到ZMW的底部的未經(jīng)修飾的聚合酶用于對DNA與溶液中自由流動的熒光標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行測序。隨著核苷酸被并入DNA鏈，熒光標(biāo)簽從所述核苷酸上脫離(Flusberg等，2010，Nature methods 7(6)：461-465)。

超深度測序是指測定來自多模板拷貝的核酸序列的次數(shù)。超深度測序通過擴(kuò)增相對小的可能包含罕見突變的靶核酸序列可以用于鑒定罕見的遺傳突變。

DNA微陣列可以用于同時(shí)測量多個(gè)基因的表達(dá)水平。DNA微陣列還可以用于基因組的多個(gè)區(qū)域的基因分型。例如，產(chǎn)前染色體微陣列(CMA)可以用于檢測拷貝數(shù)變化，諸如染色體中的非整倍性。產(chǎn)前CMA可以檢測全部或部分染色的缺失或重復(fù)。

5.8.試劑盒

本公開進(jìn)一步提供包括在本公開的陽性免疫選擇方法中有用的一種或多種抗體的試劑盒，所述抗體如以上5.3.2節(jié)中所描述。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒包含抗體4B9?？贵w可以附著到可檢測部分，例如，生物素或熒光部分。如果抗體是生物素化的，試劑盒還可以包括抗生物素蛋白結(jié)合的檢測試劑(即，抗體)。

所述試劑盒還可以包括一種或多種陰性免疫選擇抗體，諸如抗以上5.3.4節(jié)中所描述的靶標(biāo)的抗體。陰性免疫選擇抗體優(yōu)選附著到可檢測部分，所述可檢測部分不同于陽性免疫選擇抗體所附著的可檢測部分。

所述試劑盒還可以包括用于更好地選擇fNRBC的核染料。

可用于使用抗體來富集fNRBC的緩沖液等是本領(lǐng)域眾所周知的，并可以通過終端用戶制備或作為試劑盒的組分提供。所述試劑盒還可以包括含有陽性對照和陰性對照組織樣品的固體支撐物，例如，胎兒肝細(xì)胞作為陽性對照和/或成人血液或成人血液細(xì)胞組分作為陰性對照。

所述試劑盒還可以包括一種或多種適于胎兒細(xì)胞診斷的試劑，諸如適于進(jìn)行如上文5.7節(jié)中所述的診斷方法的試劑。在示例性實(shí)施方式中，所述試劑包括引物(例如，用于PCR或測序的引物)和/或可選的探針(例如，用于檢測胎兒細(xì)胞異常的探針)。

6.示例性工作流程

圖1和圖2示出了用于fNRBC富集和/或分離的某些示例性工作流程。本公開的方法可需要圖1或圖2中描述的一個(gè)完整的工作流程，或者是適合于富集或分離fNRBC的工作流程的步驟的組合。

參考圖1，示例性工作流程以預(yù)富集步驟(3)起始，然后進(jìn)行富集(4)。可以根據(jù)5.2節(jié)或部分7.1節(jié)中的方法進(jìn)行預(yù)富集。富集可能涉及使用磁性細(xì)胞分選的陽性和/或陰性選擇，例如，如5.3節(jié)、7.2節(jié)和7.3節(jié)中所描述。所得的細(xì)胞群體可以：(i)直接分選(4b)并分析(7)；(ii)進(jìn)行微操作以分離個(gè)體fNRBC或fRNBC池(4a)并分析(7)；(iii)進(jìn)行熒光染色(5)，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)(6)，直接分選(6b)并分析(7)；或者(iv)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)(6)，進(jìn)行微操作以分離個(gè)體fNRBC或fRNBC池(6a)并分析(7)。微操作可以如7.6節(jié)中所描述來進(jìn)行。分析可能涉及檢驗(yàn)來驗(yàn)證fNRBC為胎兒fNRBC(例如，如5.6節(jié)中所描述)和/或下游分析，例如檢驗(yàn)多胎妊娠或胎兒異常(例如，如5.7節(jié)中所描述)。在驗(yàn)證和/或下游分析前，fNRBC基因組可以進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。相同的核酸樣品(直接從細(xì)胞中提取或者在諸如全基因組擴(kuò)增等擴(kuò)增后)可用于驗(yàn)證和下游分析。預(yù)富集(3)和富集(4)可以使用如第7節(jié)所闡明的示例性方案組合#1至#18中的任意一種。對于涉及流式細(xì)胞術(shù)的工作流程，在流式細(xì)胞術(shù)之前富集的(例如，磁性分選的)細(xì)胞群體可以是熒光染色的，例如，如第7節(jié)中所描述。染色可以使用直接標(biāo)記的免疫選擇抗體和/或核染料(例如，如5.3.5節(jié)所描述)，或者被標(biāo)記的二抗。在某些實(shí)施方式中，使用二抗來標(biāo)記在磁性分選中使用的一抗。在某些實(shí)施方式中，一抗為4B9。在某些實(shí)施方式中，流式細(xì)胞術(shù)使用至少兩種或至少三種用于選擇fNRBC的試劑，例如，4B9抗體、抗-CD235a抗體和核染料中的任意兩種或全部三種。如果使用陽性選擇，單克隆抗體4B9可以用作陽性選擇試劑。如果使用陰性選擇，抗-CD45抗體可以用作陰性選擇試劑。

還參考圖1，另一個(gè)示例性工作流程以預(yù)富集步驟(3)起始，然后進(jìn)行熒光染色(5)和流式細(xì)胞術(shù)(6)。流式細(xì)胞術(shù)后可以進(jìn)行直接分選(6b)并分析(7)，或者進(jìn)行微操作以分離個(gè)體fNRBC或fRNBC池(6a)并分析(7)。微操作可以如7.6節(jié)中所描述而進(jìn)行。分析可能涉及檢驗(yàn)來驗(yàn)證fNRBC為胎兒fNRBC(例如，如5.6節(jié)中所描述)和/或下游分析，例如檢驗(yàn)多胎妊娠或胎兒異常(例如，如5.7節(jié)中所描述)。在驗(yàn)證和/或下游分析之前，fNRBC基因組可以進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。相同的核酸樣品(直接從細(xì)胞中提取或者在諸如全基因組擴(kuò)增等擴(kuò)增后)可用于驗(yàn)證和下游分析。在流式細(xì)胞術(shù)之前，預(yù)富集的細(xì)胞群體可以是熒光染色的，例如，如節(jié)中所描述。染色可以使用直接標(biāo)記的免疫選擇抗體和/或核染料(例如，如5.3.5節(jié)中所描述)，或者是經(jīng)標(biāo)記的二抗。在某些實(shí)施方式中，流式細(xì)胞術(shù)使用至少兩種或至少三種用于選擇fNRBC的試劑，例如，4B9抗體、抗-CD235a抗體和核染料中的任意兩種或全部三種。

參考圖2，示例性工作流程以Ficoll分離步驟起始(例如，如7.1節(jié)中所描述)，然后進(jìn)行磁性細(xì)胞分選(陰性和/或陽性，例如，如5.3節(jié)、7.2節(jié)和7.3節(jié)中所描述)，然后進(jìn)行(A)FISH，(B)微操作以分離個(gè)體fNRBC或fNRBC池，或(C)FACS以分選fNRBC。FACS后可進(jìn)行微操作。微操作(B)可以如7.6節(jié)中所描述而進(jìn)行。微操作后，所選擇的fNRBC可以驗(yàn)證為胎兒fNRBC(例如，如5.6節(jié)中所描述)，和/或進(jìn)行下游分析，例如檢測多胎妊娠或胎兒異常(例如，如5.7節(jié)中所描述)。驗(yàn)證和/或下游分析之前，fNRBC基因組可以是進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。相同的核酸樣品(直接從細(xì)胞中提取的或者在諸如全基因組擴(kuò)增等擴(kuò)增后)可用于驗(yàn)證和下游分析。Ficoll分離和磁性細(xì)胞分選步驟可以使用如部分7所闡明的示例性方案組合#1至#18中的任意一種。對于需要FACS分選的工作流程，磁性分選的細(xì)胞群體可以在FACS之前進(jìn)行熒光染色(例如，如第7節(jié)中所描述)。染色可以使用直接標(biāo)記的免疫選擇抗體和/或核染料(例如，如5.3.5節(jié)中所描述)，或標(biāo)記的二抗。在某些方面中，使用二抗來標(biāo)記用于FACS分析的磁性分選中使用的一抗。在某些實(shí)施方式中，所述一抗為4B9。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ACS分選使用至少兩種或至少三種用于選擇fNRBC的試劑，例如，4B9抗體、抗-CD235a抗體和核染料中的任意兩種或全部三種。如果磁性分選用于陽性選擇，單克隆抗體4B9可以用作陽性選擇試劑。如果磁性分選用于陰性選擇，抗-CD45抗體可以用作陰性選擇試劑。

在每個(gè)涉及fNRBC分析的前述工作流程的某些實(shí)施方式中，分析fNRBC基因組的染色體拷貝數(shù)?？梢酝ㄟ^FISH或通過定量DNA擴(kuò)增對來自細(xì)胞的染色體拷貝數(shù)進(jìn)行分析，例如，通過全基因組擴(kuò)增或定量PCR。

7.示例性方案

使用7.1節(jié)的密度分離方案、7.2節(jié)的陰性選擇方案、和/或7.3節(jié)的陽性選擇方案的多種組合來從包含fNRBC和母體細(xì)胞的樣品(例如，母血)中富集NRBC。例如，以下方案組合落在本公開的范圍內(nèi)。在富集后，對富集的NRBC可以進(jìn)行熒光染色(例如，如7.4節(jié)中所描述)，以進(jìn)行進(jìn)一步分析。在分析之前，可以通過FACS進(jìn)一步富集NRBC，例如使用圖1和圖2所示的工作流程。

組合#1：密度分離方案#1和陽性選擇方案#1。

組合#2：密度分離方案#1和陽性選擇方案#2。

組合#3：密度分離方案#2和陽性選擇方案#1。

組合#4：密度分離方案#2和陽性選擇方案#2。

組合#5：密度分離方案#3和陽性選擇方案#1。

組合#6：密度分離方案#3和陽性選擇方案#2。

組合#7：密度分離方案#1、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#1。

組合#8：密度分離方案#、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#2。

組合#9：密度分離方案#2、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#1。

組合#10：密度分離方案#2、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#2。

組合#11：密度分離方案#3、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#1。

組合#12：密度分離方案#3、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#2。

組合#13：密度分離方案#1和陽性選擇方案#3。

組合#14：密度分離方案#2和陽性選擇方案#3。

組合#15：密度分離方案#3和陽性選擇方案#3。

組合#16：密度分離方案#1、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#3。

組合#17：密度分離方案#2、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#3。

組合#18：密度分離方案#3、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#3。

7.1.密度分離

7.1.1.密度分離方案#1

下列示例性密度分離方案#1適合于用于本公開的方法：

1.向管中放置有多孔隔板的離心管(例如，管)添加一定量的密度分離培養(yǎng)基。將所述管進(jìn)行離心以用培養(yǎng)基填充多孔隔板以下的管，例如，以230×g離心1分鐘。添加到管中的培養(yǎng)基的量應(yīng)當(dāng)在離心后足夠填充多孔隔板以下的管部分。離心后，如果有任何殘留在多孔隔板以上的培養(yǎng)基，棄掉任何培養(yǎng)基。雖然在本公開的方法中可以使用缺少多孔隔板的離心管用于密度分離，使用具有多孔隔板離心管防止了樣品與培養(yǎng)基的混合、保持不連續(xù)的梯度并且改善分離。

2.向離心管中添加一定量的血液。處理血液，例如，用諸如含有2mM EDTA的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)等緩沖液稀釋血液，可以有助于改善分離。因此，添加到離心管中的血液可以是處理過的，例如用緩沖液稀釋的。

3.對所述管進(jìn)行離心以在多孔隔板以上形成血漿層和富集的細(xì)胞級分，例如，以1000×g離心20分鐘。

4.將多孔隔板以上的全部物質(zhì)(血漿、PBMC等)轉(zhuǎn)移至第二離心管。

5.向第二離心管中添加沖洗緩沖液，例如，PBS+2mM EDTA(pH 7.2)并混合。然后對第二離心管進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以450×g離心10分鐘。

6.不攪動所述團(tuán)塊而完全吸出上清液。

7.在沖洗緩沖液中重懸所述團(tuán)塊。

8.對重懸的團(tuán)塊進(jìn)行離心以使細(xì)胞再次成團(tuán)塊。

9.不攪動所述團(tuán)塊而完全吸出上清液。

沖洗步驟5至9從所富集的細(xì)胞中去除密度分離培養(yǎng)基和血漿，并可以改善后續(xù)處理步驟的產(chǎn)率。

7.1.2.密度分離方案#2

通過對密度分離方案#1進(jìn)行如下改變而提供密度分離方案#2：在步驟2后添加沖洗步驟2.1：

2.1向步驟2中添加至離心管中的包含血液的容器中添加沖洗緩沖液，然后向離心管中添加沖洗緩沖液。

此沖洗步驟2.1可以增加fNRBC的產(chǎn)率。

7.1.3.密度分離方案#3

通過對密度分離方案#2進(jìn)行如下改變而提供密度分離方案#3：用下列步驟4代替步驟4：

4.去除離心管中的血漿層并棄掉。將多孔隔板之上剩余的液體轉(zhuǎn)移至第二離心管。

在沖洗步驟5至9之前去除血漿層可以提供更純的富集的細(xì)胞群體。

7.2.陰性選擇

在本公開的某些實(shí)施方式中，對包含fNRBC和母體細(xì)胞的樣品進(jìn)行陰性選擇以耗竭母體細(xì)胞的樣品。在某些實(shí)施方式中，陰性選擇采用具有結(jié)合抗-CD45抗體的微珠磁性激活細(xì)胞分選(MACS)。

7.2.1.陰性選擇方案#1

下列示例性陰性選擇方案#1適合于在本公開的方法中使用：

1.用MACS電泳緩沖液重懸來自密度分離方案#1至3中的任意一種的最終團(tuán)塊，例如，自動電泳緩沖液(Miltenyi Biotec)。

2.對樣品進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以450×g離心10分鐘。

3.完全吸出上清液。

4.在MACS電泳緩沖液中重懸所述團(tuán)塊。

5.向樣品中添加CD45微珠(即，附著到抗-CD45抗體上的微珠)，混合并溫育以允許CD45微珠與母體細(xì)胞結(jié)合。

6.向樣品中添加MACS電泳緩沖液并混合。然后離心樣品以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以450×g離心10分鐘。完全吸出上清液。

7.在MACS電泳緩沖液中重懸所述團(tuán)塊。

8.根據(jù)制造商的說明書，使用MACS柱磁性分選細(xì)胞以獲得CD45陰性級分和CD45陽性細(xì)胞級分。

步驟1至3從細(xì)胞中去除殘留的沖洗緩沖液。沖洗步驟6從樣品中去除未結(jié)合CD45微珠。

7.3.陽性選擇

在本公開某些實(shí)施方式中，使用抗體4B9對包含fNRBC和母體細(xì)胞的樣品進(jìn)行陽性選擇。

7.3.1.陽性選擇方案#1

下列示例性陽性選擇方案#1適合于在本公開的方法中使用：

1.如果以通過陰性選擇方案#1所得的包含fNRBC的懸浮液起始，對所述懸浮液進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以450×g離心10分鐘，并完全吸出上清液。如果以來自密度分離方案#1至3的任意一種的細(xì)胞團(tuán)塊起始，由步驟2開始。

2.在MACS電泳緩沖液中重懸所述團(tuán)塊。

3.添加FcR阻斷劑，例如，F(xiàn)cR阻斷劑(Miltenyi Biotec)，并且充分混合。FcR阻斷劑阻斷非特異性Fc受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合。

4.添加生物素化的4B9；進(jìn)行溫育以允許生物素化的4B9與fNRBC結(jié)合。

5.向樣品中添加MACS電泳緩沖液；進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以300×g離心10分鐘。

6.完全吸出上清液。

7.向樣品中添加MACS電泳緩沖液，并進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以450×g離心10分鐘。

8.完全吸出上清液。

9.在MACS電泳緩沖液中重懸所述團(tuán)塊。

10.向樣品中添加FcR阻斷劑，與阻斷步驟11中的非特異性Fc受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合。

11.向樣品中添加抗生物素微珠；進(jìn)行溫育以允許微珠與生物素化的4B9結(jié)合。

12.向樣品中添加MACS電泳緩沖液并混合。然后，對樣品進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以450×g離心10分鐘。完全吸出上清液。

13.向樣品中添加MACS電泳緩沖液。

14.根據(jù)制造商的說明書，使用MACS柱磁性分選細(xì)胞以獲得4B9陽性級分和4B9陰性級分。

步驟5至8從樣品中去除未結(jié)合的生物素化的4B9。沖洗步驟12從樣品中去除未結(jié)合的抗-生物素微珠。

7.3.2.陽性選擇方案#2

通過對陽性選擇方案#1進(jìn)行如下改變而提供陽性選擇方案#2：用未結(jié)合的4B9代替生物素化的4B9，及用抗-IgM微珠代替抗生物素微珠。

7.3.3.陽性選擇方案#3

4B9+細(xì)胞通過用未結(jié)合的4B9(IgM單克隆抗體)溫育而進(jìn)行選擇，沖洗以去除未結(jié)合的4B9抗體，用山羊抗小鼠IgM微珠結(jié)合4B9包被的細(xì)胞，然后沖洗，重懸并對所得細(xì)胞進(jìn)行離心。離心后棄去上清液，并在諸如PBS等緩沖液中重懸所述團(tuán)塊。

7.4.染色

在本公開的某些實(shí)施方式中，對根據(jù)本公開制備的包含fNRBC的樣品進(jìn)行用于可視化的熒光染色，通過例如FACS進(jìn)行分選，和/或挑選分離的fNRBC。

7.4.1.染色方案#1

下列示例性染色方案#1可以用于對包含fNRBC的樣品進(jìn)行熒光染色：

1.對根據(jù)以上組合#1-18中任意一種所制備的4B9陽性級分進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以400×g離心10分鐘。

2.吸出上清液。

3.向樣品中添加熒光預(yù)混液并進(jìn)行溫育，其中所述預(yù)混液包含根據(jù)上述方案中的任意一種用于檢測富集的fNRBC的適合的標(biāo)記的標(biāo)志物，例如，抗生蛋白鏈菌素Alexa 488和/或山羊抗小鼠IgM Alexa 488，及核標(biāo)志物(例如，Hoechst)。

4.向樣品中添加緩沖液，例如，具有0.5％BSA的1×PBS，以沖洗細(xì)胞。

5.對樣品進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以400×g離心10分鐘。

6.吸出上清液。

7.在適合的緩沖液(例如，1×PBS)中重懸所述團(tuán)塊。

7.4.2.染色方案#2

下列示例性染色方案#2也可用于對包含fNRBC的樣品進(jìn)行熒光染色：

1.對根據(jù)以上組合#1至18中任意一種所制備的4B9陽性級分進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以400×g離心10分鐘。

2.在緩沖液(例如，1×PBS)中重懸所述團(tuán)塊。

3.添加FcR阻斷劑以阻斷步驟4中的非特異性Fc受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合。

4.向樣品中添加未綴合的4B9；溫育樣品以使4B9能與fNRBC結(jié)合。

5.向樣品中添加熒光預(yù)混液并進(jìn)行溫育，其中，所述預(yù)混液包含用于檢測fNRBC的適合的標(biāo)記的標(biāo)志物，例如，CD235a-PE和/或山羊抗小鼠IgM Alexa 488、及核標(biāo)志物(如DC-Ruby)。

6.向樣品中添加緩沖液，例如，1×PBS，以沖洗細(xì)胞。

7.對樣品進(jìn)行離心以使細(xì)胞成團(tuán)，例如，以300×g離心5分鐘。

8.吸出上清液。

9.在適合的緩沖液(例如，1×PBS)中重懸所述團(tuán)塊，例如。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以選擇在以上方案中使用的試劑的適合的體積和濃度、溫度、混合時(shí)間、離心時(shí)間、離心力和具體試劑。類似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，在不改變方案的基本操作時(shí)，可以在以上方案中加入或省略沖洗步驟。

7.5.用于下游分析的制備

包含fNRBC的初始生物樣品或通過任意一種上述方法步驟富集fNRBC的樣品，可以進(jìn)行進(jìn)一步處理以富集或分離步驟fNRBC。

自動化細(xì)胞分離技術(shù)是適合的。所述技術(shù)的實(shí)例包括但不限于，熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、流式細(xì)胞術(shù)、超濾、微流體或兩種以上這些方法的任意組合?？梢允褂迷O(shè)備制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)程序和說明書進(jìn)行FACS以進(jìn)一步富集或分離fNRBC。根據(jù)本文描述的方法可以用于分離fNRBC的示例性FACS選通及所得結(jié)果數(shù)據(jù)集顯示在圖3和圖7中。

fNRBC還可以通過諸如微操作等手動方法分離。微操作技術(shù)的應(yīng)用是本領(lǐng)域已知的或如以下7.6節(jié)中所描述的，個(gè)體fNRBC可以經(jīng)挑選和分離。

在富集后，細(xì)胞可以進(jìn)行下游分析，例如，細(xì)胞基因組DNA的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分析、DNA指紋分析、染色體拷貝數(shù)分析，和/或用于驗(yàn)證胎兒細(xì)胞身份、診斷胎兒異?；蚣膊∫约皺z測胎兒特征的其他方法。

7.6.通過微操作挑選細(xì)胞

將商購的微操作儀配置到倒置顯微鏡上以用于細(xì)胞分離。所述顯微鏡配備有多個(gè)物鏡、熒光濾光器、照相機(jī)、監(jiān)測儀、操縱桿操作的微操作儀平臺。微操作由三個(gè)線性軸-X、Y、和Z方向組成。

將獲自陽性選擇級分并用多種抗體進(jìn)行熒光染色的細(xì)胞放置到經(jīng)預(yù)清潔的顯微鏡載玻片上，并使用毛細(xì)血管尖上的開口直徑被配置為fNRBC大小的無菌毛細(xì)血管進(jìn)行分離。熒光染料可以相應(yīng)于識別胎兒細(xì)胞的一種或多種抗體，所述抗體選自4B9(Zimmermann等，2013，Exp Cell Res 319：2700-2707)、抗-CD34、抗-CD71、抗血型糖蛋白-A、和抗-i-抗原(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-35；Calabrese等，2012，Clin Genet.82(2)：131-9)。如果細(xì)胞是固定的(例如，為了進(jìn)行FISH)，可以使用據(jù)報(bào)道為具有高度特異性的原始胎兒成紅細(xì)胞識別物的抗-ε球蛋白(Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-35；Choolani等，2001，Blood 98：554-7)。

在熒光染色步驟中使用的每個(gè)抗體在顯微鏡上對應(yīng)于其具有的特定的熒光過濾器，可通過目鏡觀察和/或根據(jù)波長監(jiān)測。

除了熒光標(biāo)志物，fNRBC的選擇標(biāo)準(zhǔn)可以是血紅蛋白含量(通過Soret濾光器可檢測)和形態(tài)學(xué)特征。原始fNRBC具有不同的形態(tài)特征：其具有高的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之比，及相對更大的尺寸(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-35)。

用微操作儀手動挑選具有期望的形態(tài)學(xué)、核與細(xì)胞的比例、及熒光染色模式的細(xì)胞，并出于下游分析目的，將其放入0.2ml的PCR管中。

描述的示例性方案是用于獲得如下表1所示的包含fNRBC的富集的細(xì)胞群體。

8.實(shí)施例1：通過密度分離+MACS從母血中分離的fNRBC的FISH分析

根據(jù)密度分離方案#3和陽性選擇方案#2處理獲自40名5周～16周妊娠具有男性胎兒的女性的母體外周血樣品，以提供包含fNRBC的磁性細(xì)胞分離“湯”(MCSS)。將細(xì)胞固定在載玻片上并使用FISH進(jìn)行分析以鑒定X和Y染色體。

當(dāng)在顯微鏡下觀察載玻片時(shí)，對至少5個(gè)具有Y染色體的細(xì)胞/樣品進(jìn)行手動計(jì)數(shù)。隨機(jī)選擇40個(gè)樣品中的10個(gè)樣品，以測定樣品中存在Y染色體的細(xì)胞的平均數(shù)量。在顯微鏡下掃描整個(gè)載玻片，對每個(gè)Y探針進(jìn)行手動計(jì)數(shù)。對10個(gè)樣品中的每一個(gè)進(jìn)行fNRBC數(shù)量的計(jì)數(shù)顯示在表2中。平均計(jì)得每個(gè)樣品24個(gè)fNRBC。

探測X和Y染色體的樣品8的細(xì)胞的顯微照片顯示在圖4中。

使用密度分離和MACS從母血中分離的胎兒細(xì)胞的其他示例性FISH圖像顯示在圖5和6中。

9.實(shí)施例2：胎兒肝臟中的fNRBC的特征

新鮮或冷凍的單核胎兒肝細(xì)胞獲自多個(gè)不同胎齡的供體并儲存在液氮中。細(xì)胞在具有相應(yīng)的分析證書的被認(rèn)可的IRB供體程序下通過外部來源進(jìn)行處理。

獲自多個(gè)供體的新鮮單核男性細(xì)胞作為陰性對照。

使用密度梯度分離處理胎兒肝臟單核細(xì)胞和男性單核細(xì)胞。在某些研究中，在其后使用MACS通過4B9對包含fNRBC的密度梯度級分進(jìn)行陽性選擇，MACS-分選的4B9陽性級分通過FACS進(jìn)行分選。在其他研究中，通過FACS對包含fNRBC的密度梯度級分進(jìn)行分選而不使用干涉MACS選擇過程。在FACS分選之前，細(xì)胞使用4B9和山羊抗小鼠IgM第二抗體、抗-CD235a和DC-Ruby進(jìn)行熒光染色。

FACS分選分析了不同選通區(qū)(淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞、CD235a+、和三陽性(DC-Ruby+、4B9+、CD235a+細(xì)胞)的事件的數(shù)量、親本％及總％。對于兩種樣品類型觀察到的三陽性事件如下：在分選的總事件中，胎兒肝細(xì)胞在20％～45％之間，男性細(xì)胞在0.02％～0.10％。

用對應(yīng)的熒光濾光器在顯微鏡上分選及觀察細(xì)胞。對胎兒肝臟和男性單核細(xì)胞的分析允許基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)、核與細(xì)胞的比例及熒光染色模式對細(xì)胞進(jìn)行表征，及建立FACS分選的包含fNRBC的細(xì)胞群體的質(zhì)量控制措施。

10.實(shí)施例3：通過密度分離+MACS+FACS從混合細(xì)胞群體中分離的胎兒肝臟fNRBC的STR分析

此實(shí)施例證明了通過加標(biāo)(spike-in)實(shí)驗(yàn)，本公開的方法允許fNRBC的富集。

10.1.從混合的細(xì)胞群體的富集4B9+的細(xì)胞群體的制備

在通過密度梯度離心分離單核細(xì)胞之前，將四千個(gè)女性胎兒肝細(xì)胞添加到25ml的來自無關(guān)男性受試者的正常男性血液中。

通過密度梯度離心方案#2制備PBMC。根據(jù)陽性選擇方案#2，對得到的細(xì)胞群體進(jìn)行陽性選擇。

細(xì)胞用山羊抗小鼠IgM Alexa Flour 488和DC-Ruby進(jìn)行染色，然后使用索尼SH800細(xì)胞分揀器通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分選。

圖8A顯示了4B9陰性細(xì)胞級分的FSC和BSC相關(guān)測量，其表明了細(xì)胞類型的區(qū)別。圖8B顯示了基于來自4B9陰性細(xì)胞級分的FSC相對BSC的淋巴細(xì)胞選通的細(xì)胞亞群，觀察有核的和4B9細(xì)胞類型。4B9陽性細(xì)胞級分在圖9A和圖9B中表示。圖9B表明了有核的4B9陽性細(xì)胞在右上象限。無核的4B9陽性細(xì)胞位于右下象限。

將圖9B中上方選通的事件(4B9陽性：43.53％)分選入0.2ml的PCR管中，進(jìn)行STR分析以鑒定位于此區(qū)域的細(xì)胞類型。

10.2.4B9+細(xì)胞級分的下游分析

4B9+級分的STR(短串聯(lián)重復(fù))分析使用針對23個(gè)STR基因座和性別特異性釉原蛋白多態(tài)性基因的基因座的熒光檢測的Fusion(Promega，WI)五色試劑盒進(jìn)行。

圖10～13是男性基因組DNA、胎兒肝臟基因組DNA、和4B9陽性分選級分的電泳圖，其顯示了FAM、VIC、NED和PET標(biāo)記的基因座的峰。

在圖10～13(分別為FAM、VIC、NED和PET)中所示的每個(gè)通道中，產(chǎn)生男性基因組DNA、胎兒肝臟基因組DNA和4B9陽性級分的STR譜。

圖10～13中的4B9陽性級分(底部)證明了在分離、富集和FACS分選后，分離的大部分細(xì)胞是胎兒來源的。4B9陽性級分譜由男性和胎兒肝臟譜組成；然而，主要貢獻(xiàn)者是胎兒譜。

此混合的細(xì)胞群體的譜包含兩個(gè)不同的貢獻(xiàn)者導(dǎo)致的主要峰和次要峰?；诘任换虻拇嬖诤瓦@些峰隨后的高度，測定主要和次要貢獻(xiàn)者。

圖14表示來自4B9陽性級分的FAM通道的兩個(gè)標(biāo)志物。此時(shí)觀察到標(biāo)志物D10S1248包含4個(gè)等位基因(A、B、C、和D)。等位基因A和C是四個(gè)峰中最高的且是胎兒來源的，而等位基因B和D是四個(gè)峰中最低的且是男性來源的(參見圖10)。標(biāo)志物D13S317僅包含3個(gè)等位基因(E、F、和G)。此時(shí)男性和胎兒肝細(xì)胞在F處共享一個(gè)常見的等位基因，其導(dǎo)致了最高的峰。第二高的峰為來自胎兒來源的G，最低的峰為男性來源的E。因此，圖14證明，胎兒譜是來自4B9陽性級分的譜的主要貢獻(xiàn)者。

此外，圖10包含性別特異性基因座釉原蛋白(AMEL)，其包含代表女性樣品的單個(gè)X和代表男性樣品的X和Y。4B9級分沒有指示存在Y基因座，重申了大多數(shù)4B9陽性級分是胎兒細(xì)胞并且不是男性細(xì)胞。

此實(shí)施例證明，當(dāng)將少量胎兒肝細(xì)胞添加到顯著較大數(shù)量的男性細(xì)胞中，使用本文描述的分離和富集方法恢復(fù)的大多數(shù)細(xì)胞為胎兒細(xì)胞。

11.實(shí)施例5：通過多種方案從母血中分離的fNRBC的STR分析

11.1.通過密度分離+MACS從母血中分離的fNRBC的STR分析

根據(jù)密度分離方案#1、陰性選擇方案#1、和陽性選擇方案#1處理獲自40名4周～14周妊娠的具有男性或女性胎兒的女性的母體外周血樣品，以對每個(gè)樣品提供MCSS。根據(jù)染色方案#1對樣品進(jìn)行染色。然后從每個(gè)MCSS中挑選4B9標(biāo)記的細(xì)胞，匯集，使用用于熒光檢測23個(gè)STR基因座和性別特異性釉原蛋白多態(tài)性基因的基因座的Fusion(Promega，WI)STR試劑盒進(jìn)行分析以驗(yàn)證胎兒身份。在100％的樣品中鑒定胎兒等位基因。

圖15～18顯示處理獲自具有7周妊娠的男性胎兒的女性妊娠者的母體外周血所得的樣品的STR分析。細(xì)胞在陽性選擇后用山羊抗小鼠IgM AF 488、抗生蛋白鏈菌素488和Hoechst進(jìn)行熒光染色。兩組10個(gè)手動挑選的匯集的細(xì)胞用于STR分析。圖15～18中所示的電泳圖中四個(gè)通道中的每一個(gè)中，具有四個(gè)STR譜。從上到下的四個(gè)譜為：分離的4B9陽性級分A和B(分別)、母本基因組DNA、和父本基因組DNA。由交替的的短線和點(diǎn)形成的圈指示母本譜和父本譜之間共享的分離的4B9陽性級分中發(fā)現(xiàn)的等位基因。由更短的短線形成的圈指示僅在父本譜中發(fā)現(xiàn)的分離的4B9陽性級分中發(fā)現(xiàn)的等位基因。

11.2.通過密度分離+MACS+FACS從母血中分離的fNRBC的STR分析

11.2.1.通過密度分離方案#2、陽性選擇方案#2和FACS分離fNRBC

在來自通過密度分離方案#2、陽性選擇方案#2和FACS而不進(jìn)行陰性選擇處理的妊娠女性的母血的樣品上進(jìn)行STR分析。圖19～22顯示處理獲自具有9周妊娠的男性胎兒的女性妊娠者的母體外周血所得的樣品的STR分析。細(xì)胞在陽性選擇后用山羊抗-小鼠IgM、CD235a、和DC-Ruby進(jìn)行熒光染色，F(xiàn)ACS分選，手動挑選，并匯集在一起進(jìn)行STR分析?？偣蔡暨x8個(gè)細(xì)胞。圖19～22從上到下顯示三個(gè)譜：母本基因組DNA、分離的4B9陽性級分和父本基因組DNA。由交替的的短線和點(diǎn)形成的圈指示母本譜和父本譜之間共享的分離的4B9陽性級分中發(fā)現(xiàn)的等位基因。由更短的短線形成的圈指示僅在父本譜中發(fā)現(xiàn)的分離的4B9陽性級分中發(fā)現(xiàn)的等位基因。

11.2.2.通過密度分離方案#3、陽性選擇方案#2、和FACS分離fNRBC

在來自通過密度分離方案#3、陽性選擇方案#2和FACS而不進(jìn)行陰性選擇處理的妊娠雌性的母血的樣品上進(jìn)行STR分析。圖23～26顯示處理獲自具有12周妊娠的男性胎兒的女性妊娠者的母體外周血所得的樣品的STR分析。細(xì)胞在陽性選擇后用山羊抗小鼠IgM、CD235a和DC-Ruby進(jìn)行熒光染色，將其直接放入0.2ml的PCR管中用于FACS分選，進(jìn)行STR分析。總共挑選35個(gè)細(xì)胞。管A-C包含10個(gè)事件，管D包含5個(gè)事件。圖23～26從上到下的四個(gè)譜顯示：母本基因組DNA、從4B9陽性級分分離的兩個(gè)不同反應(yīng)(分別是管C和D)、和父本基因組DNA。由交替的短線和點(diǎn)形成的圈指示母本譜和父本譜之間共享的分離的4B9陽性級分中發(fā)現(xiàn)的等位基因。由更短的短線形成的圈指示僅在父本譜中發(fā)現(xiàn)的分離的4B9陽性級分中發(fā)現(xiàn)的等位基因。

12.實(shí)施例6：分離的NRBCS的指紋分析

根據(jù)密度分離方案#3和陽性選擇方案#2處理100個(gè)母體外周血樣品以提供MCSS。根據(jù)染色方案#2對MCSS的細(xì)胞進(jìn)行染色。然后通過FACS使帶4B9標(biāo)簽的細(xì)胞與其他細(xì)胞和碎屑分離。在載玻片上分選對于DC-Ruby、CD235a、和4B9是三陽性的細(xì)胞。通過微操作挑選單個(gè)細(xì)胞并基于形態(tài)學(xué)和熒光分級。

基于它們的單核苷酸多態(tài)性譜從100個(gè)母血樣品中選擇總共235個(gè)細(xì)胞，用于WGA和指紋分析。母體細(xì)胞也進(jìn)行WGA和指紋分析。指紋分析驗(yàn)證了分離自母血的235個(gè)細(xì)胞中的230個(gè)(即，97.3％的細(xì)胞)為胎兒細(xì)胞，至少一個(gè)分離自每個(gè)母血樣品為確認(rèn)的胎兒細(xì)胞。

13.具體實(shí)施方式

本公開通過以下具體實(shí)施方式舉例說明。

1.一種胎兒有核紅細(xì)胞(NRBC)的制備方法，其包括對包含fNRBC的生物樣品進(jìn)行陽性免疫選擇，所述陽性免疫選擇包括以下步驟：

(a)在液體介質(zhì)中用第一抗體接觸生物樣品，其中，相對于其他細(xì)胞(例如，一種或多種其他細(xì)胞類型)，所述第一抗體選擇性結(jié)合至生物樣品中的fNRBC；及

(b)選擇與所述第一抗體結(jié)合的細(xì)胞。

2.如實(shí)施方式1所述的方法，其進(jìn)一步包括對所述生物樣品進(jìn)行陰性免疫選擇，所述陰性免疫選擇包括以下步驟：

(a)在液體介質(zhì)中用第二抗體接觸生物樣品，其中，相對于fNRBC，所述第二抗體選擇性結(jié)合生物樣品中的其他細(xì)胞；及

(b)選擇不與所述第二抗體結(jié)合的細(xì)胞。

3.如實(shí)施方式2所述的方法，其中，在陰性免疫選擇之前進(jìn)行陽性免疫選擇。

4.如實(shí)施方式2所述的方法，其中，在陽性免疫選擇之前進(jìn)行陰性免疫選擇。

5.如實(shí)施方式2所述的方法，其中，同時(shí)進(jìn)行陽性免疫選擇和陰性免疫選擇。

6.如實(shí)施方式1～5中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，所述第一抗體結(jié)合存在于fNRBC有核前體細(xì)胞表面上的抗原，但不結(jié)合存在于成人紅細(xì)胞上的CD71或其他表面抗原。

7.如實(shí)施方式6所述的方法，其中，所述第一抗體為4B9或與4B9競爭與fNRBC有核前體細(xì)胞表面的結(jié)合的抗體。

8.如實(shí)施方式1～7中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，使用多種第一抗體。

9.如實(shí)施方式1～8中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，通過自動化方法進(jìn)行陽性免疫選擇。

10.如實(shí)施方式9所述的方法，其中，所述自動化方法為細(xì)胞分選、超濾或微流體分離。

11.如實(shí)施方式2～10中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，所述第二抗體針對選自下組的細(xì)胞表面標(biāo)志物：

(a)T-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地，CD3、CD4或CD8；

(b)B-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地，CD19、CD20或CD32；

(c)泛淋巴細(xì)胞標(biāo)志物，可選地，CD45；

(d)NK細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地，CD56；

(e)樹突細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地，CD11c或CD23；及

(f)巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地，CD14或CD33。

12.如實(shí)施方式2～11中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，使用多種第二抗體。

13.如實(shí)施方式12所述的方法，其中，所述多種第二抗體包括針對以下細(xì)胞表面標(biāo)志物中的至少一種、兩種、三種、四種、或五種的抗體：CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD45、CD56、CD11c、CD23、CD14、CD32和CD33。

14.如實(shí)施方式2～13中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，使用自動化方法進(jìn)行所述陰性免疫選擇。

15.如實(shí)施方式11所述的方法，其中，所述自動化方法為細(xì)胞分選、超濾或微流體分離。

16.如實(shí)施方式1～15中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其進(jìn)一步包括使用密度分離方法富集fNRBC。

17.如實(shí)施方式16所述的方法，其中，所述密度分離方法在所述陽性免疫選擇之前進(jìn)行。

18.如實(shí)施方式1～17中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其進(jìn)一步包括通過微操作分離fNRBC。

19.如實(shí)施方式18所述的方法，其中，所述微操作在陽性免疫選擇后進(jìn)行。

20.如實(shí)施方式1～19中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，所述生物液體包括血液、血漿、尿液或來自絨毛膜絨毛采樣(CVS)活檢或經(jīng)皮臍帶血液采樣的細(xì)胞懸浮液。

21.如實(shí)施方式20所述的方法，其中，所述生物樣品包括母血。

22.如實(shí)施方式21所述的方法，其中，所述母血是來自取自約5周～約38周妊娠的妊娠受試者的母血樣品。

23.一種通過如實(shí)施方式1～22中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法制備或可獲得的fNRBC的制備物。

24.如實(shí)施方式1～22中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其進(jìn)一步包括在fNRBC上進(jìn)行診斷檢測。

25.一種fNRBC的診斷方法，其包括在實(shí)施方式23的fNRBC制備物上進(jìn)行診斷檢測。

26.如實(shí)施方式24或?qū)嵤┓绞?5所述的方法，其中，所述診斷檢測用來確定多胎妊娠的存在。

27.如實(shí)施方式24或?qū)嵤┓绞?5所述的方法，其中，所述診斷檢測用來確定胎兒異常的存在。

28.如實(shí)施方式27所述的方法，其中，所述胎兒異常為13-三體綜合癥、18-三體綜合癥、21-三體綜合癥、唐氏綜合癥、壓力易感性神經(jīng)病、神經(jīng)纖維瘤病、阿拉吉?dú)W綜合癥、軟骨發(fā)育不全癥、亨廷頓氏病、α-甘露糖苷貯積癥、β-甘露糖苷貯積癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、范-瑞克林豪森氏病、結(jié)節(jié)性硬化癥、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化，鐮狀細(xì)胞疾病、泰-薩二氏病、β-地中海貧血、粘多醣貯積癥、苯丙酮尿癥、瓜氨酸尿癥、半乳糖血癥、半乳糖激酶和半乳糖4-差向異構(gòu)酶缺乏癥、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、甲基丙二酸尿癥、丙酸血癥、法伯病、巖藻糖苷貯積癥、神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥、高歇氏病、I-細(xì)胞病、III型粘脂貯積病、尼曼-匹克病、唾液酸沉積癥、沃耳曼氏病、腦肝腎綜合癥、胱氨酸病、凝血因子X缺陷癥、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、布洛姆氏綜合癥、羅伯特綜合癥、著色性干皮病、脆性(X)綜合癥、性染色體非整倍體、Klinefelter氏綜合癥、特納氏綜合癥、XXX綜合癥、類固醇硫酸酯酶缺乏癥、具有線性皮膚缺損的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色體上的睪丸決定因子、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、葡萄糖6-磷酸脫氫酶缺乏癥、萊施-奈恩綜合癥、安德森-費(fèi)勃萊氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥、Becker型肌營養(yǎng)不良癥、(17)(p11.2p11.2)重復(fù)綜合癥、16p11.2缺失、16p11.2重復(fù)、線粒體缺陷、(22)(q11.2q11.2)重復(fù)綜合癥、貓眼綜合癥、貓叫綜合癥、Wolf-Hirschhorn綜合癥、Williams-Beuren綜合癥、Charcot-Marie-Tooth病、染色體重排、染色體缺失、Smith-Magenis綜合癥、腭心面綜合癥、迪喬治綜合癥、1p36缺失、普拉德-威利綜合癥、精子缺乏(因子a)、精子缺乏(因子b)、精子缺乏(因子c)、脊柱裂、無腦畸形、神經(jīng)管缺損、小頭畸形、腦積水、腎缺如、Kallmann綜合癥、腎上腺發(fā)育不良、Angelman綜合癥、腎囊腫、囊性水瘤、胎兒水腫、臍膨出和腹裂、膈疝、十二指腸閉鎖、骨骼發(fā)育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿癥、楓糖尿病、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥，肝醣貯積癥、腎上腺增生、低磷酸酯酶癥、胎盤類固醇硫酸酯酶缺乏癥、重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥、T-細(xì)胞免疫缺陷、埃勒斯-當(dāng)洛斯綜合癥、成骨不全癥、成人多囊腎疾病、范科尼氏貧血癥、大皰性表皮松解癥綜合癥、少汗型外胚層發(fā)育不良癥、先天性腎變病(芬蘭型)和多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤。

29.如實(shí)施方式24～28中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，所述診斷檢測為核酸檢測。

30.如實(shí)施方式29所述的方法，其中，所述核酸檢測為DNA檢測，可選地，其中DNA檢測在微陣列上進(jìn)行。

31.如實(shí)施方式29或?qū)嵤┓绞?0所述的方法，其中，所述核酸分析為FISH、PCR或DNA測序檢測。

32.如實(shí)施方式29所述的方法，其中，所述核酸檢測為RNA檢測，可選地，其中RNA檢測在微陣列上進(jìn)行。

33.如實(shí)施方式32所述的方法，其中，所述RNA檢測為RT-PCR檢測或FISH檢測。

34.如實(shí)施方式29～33中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其進(jìn)一步包括在進(jìn)行診斷測試之前，對fNRBC進(jìn)行裂解或透化。

35.如實(shí)施方式24～28中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，所述診斷檢測為蛋白質(zhì)測定檢測，可選地，其中所述蛋白質(zhì)測定檢測在微陣列上進(jìn)行。

36.如實(shí)施方式35所述的方法，其中，使用抗體檢測蛋白質(zhì)。

37.如實(shí)施方式24～28中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，所述診斷檢測為組織學(xué)檢測。

38.一種用于診斷檢測的胎兒有核紅細(xì)胞(NRBC)的制備方法，所述方法包括：

(a)可選地，提供一種生物液體，其包含一個(gè)或多個(gè)其中每一個(gè)均具有胎兒細(xì)胞表面的fNRBC，及多個(gè)其中每一個(gè)均具有母體細(xì)胞表面的母體細(xì)胞；

(b)通過密度分離方法，從來自第一部分的多個(gè)母體細(xì)胞富集一個(gè)或多個(gè)fNRBC，從而產(chǎn)生包含所述一個(gè)或多個(gè)fNRBC和第一數(shù)量的剩余母體細(xì)胞的第一懸浮液；

(c)用結(jié)合至第一分離顆粒的第一抗體溫育所述第一懸浮液，其中，在第一抗體結(jié)合第一抗原以產(chǎn)生第一顆粒-細(xì)胞復(fù)合物的情況下，所述第一抗體結(jié)合存在于母體細(xì)胞的母體細(xì)胞表面上但在fNRBC的胎兒細(xì)胞表面上不存在的第一抗原，從第一懸浮液中分離和去除第一顆粒-細(xì)胞復(fù)合物，從而產(chǎn)生包含所述一個(gè)或多個(gè)fNRBC和第二數(shù)量的剩余母體細(xì)胞的第二懸浮液；

(d)將第二抗體添加至第二懸浮液，其中，所述第二抗體結(jié)合存在于fNRBC的胎兒細(xì)胞表面上的第二抗原，其中所述第二抗原在母體細(xì)胞的表面上不存在，在第二抗體結(jié)合第二抗原以產(chǎn)生第二抗體-細(xì)胞復(fù)合物的情況下溫育所述第二懸浮液，從第二懸浮液中分離和去除第二抗體-細(xì)胞復(fù)合物，從而產(chǎn)生包含所述一個(gè)或多個(gè)fNRBC的用于診斷檢測的第三懸浮液。

39.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其中，所述第一抗體包括抗-CD45抗體。

40.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其中，所述第二抗體結(jié)合存在于fNRBC有核前體細(xì)胞的細(xì)胞表面上的表面抗原，但不結(jié)合存在于成人紅細(xì)胞上的CD71或其他表面抗原。

41.如實(shí)施方式40所述的fNRBC的制備方法，其中，所述第二抗體為4B9。

42.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其進(jìn)一步包括對fNRBC的細(xì)胞成分進(jìn)行染色。

43.如實(shí)施方式42所述的fNRBC的制備方法，其中，fNRBC的細(xì)胞成分是直接或間接染色的。

44.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法。其進(jìn)一步包括通過微操作分離一個(gè)或多個(gè)fNRBC。

45.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其進(jìn)一步包括通過自動化分離技術(shù)分離或進(jìn)一步富集fNRBC。

46.如實(shí)施方式45所述的fNRBC的制備方法，其中，所述自動化分離通過選自下組的方法進(jìn)行：細(xì)胞分選、超濾和微流體分離技術(shù)。

47.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其中，fNRBC包括一個(gè)或多個(gè)原始幼紅細(xì)胞。

48.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其中，fNRBC包括一個(gè)或多個(gè)成熟幼紅細(xì)胞。

49.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其中，所述生物液體包括血液、血漿、尿液、或來自絨毛膜絨毛采樣(CVS)活檢或經(jīng)皮臍帶血液采樣的細(xì)胞懸浮液。

50.如實(shí)施方式44所述的fNRBC的制備方法，其中，所述生物液體包括母血。

51.如實(shí)施方式50所述的fNRBC的制備方法，其中，所述母血是來自取自約5周～約38周妊娠的妊娠受試者的母血樣品。

52.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其中，所述第二抗體用可檢測的標(biāo)簽標(biāo)記。

53.如實(shí)施方式52所述的fNRBC的制備方法，其中，可檢測的標(biāo)簽包括熒光標(biāo)簽、酶標(biāo)簽、放射性同位素標(biāo)簽、或化學(xué)反應(yīng)性連接劑。

54.如實(shí)施方式40所述的fNRBC的制備方法，其進(jìn)一步包括裂解富集的fNRBC以產(chǎn)生包含一種或多種核酸的裂解的fNRBC，并分析所述一種或多種核酸序列，從而確定是否存在指示胎兒異常或等位基因變異體的核酸序列。

55.如實(shí)施方式40所述的fNRBC的制備方法，其進(jìn)一步包括確定多胎妊娠的存在。

56.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，分析所述一種或多種核酸序列的步驟包括檢測染色體異常。

57.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，所述胎兒異常包括單基因異常。

58.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，所述胎兒異常包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)。

59.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，分析所述一種或多種核酸序列的步驟通過FISH、PCR或DNA測序進(jìn)行。

60.如實(shí)施方式59所述的fNRBC的制備方法，其中，分析所述一種或多種核酸序列的步驟通過定量PCR、實(shí)時(shí)PCR或逆轉(zhuǎn)錄酶PCR進(jìn)行。

61.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，分析一種或多種提取的核酸的步驟通過陣列比較基因組雜交(CGH)進(jìn)行。

62.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，分析一種或多種提取的核酸的步驟通過多次復(fù)性環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(MALBAC)進(jìn)行。

63.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，所述胎兒異常選自由13-三體綜合癥、18-三體綜合癥、21-三體綜合癥、唐氏綜合癥、壓力易感性神經(jīng)病、神經(jīng)纖維瘤病、阿拉吉?dú)W綜合癥、軟骨發(fā)育不全癥，亨廷頓氏病、α-甘露糖苷貯積癥、β-甘露糖苷貯積癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、范-瑞克林豪森氏病、結(jié)節(jié)性硬化癥、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞疾病、泰-薩二氏病、β-地中海貧血、粘多醣貯積癥、苯丙酮尿癥、瓜氨酸尿癥、半乳糖血癥、半乳糖激酶和半乳糖4-差向異構(gòu)酶缺乏癥、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、甲基丙二酸尿癥、丙酸血癥、法伯病、巖藻糖苷貯積癥、神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥、高歇氏病、I-細(xì)胞病、III型粘脂貯積病、尼曼-匹克病、唾液酸沉積癥、沃耳曼氏病、腦肝腎綜合癥、胱氨酸病、凝血因子X缺陷癥、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、布洛姆氏綜合癥、羅伯特綜合癥、著色性干皮病、脆性(X)綜合癥、性染色體非整倍體、克萊恩費(fèi)爾特綜合癥、特納氏綜合癥、XXX綜合癥、類固醇硫酸酯酶缺乏癥、具有線性皮膚缺損的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色體上的睪丸決定因子、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、葡萄糖6-磷酸脫氫酶缺乏癥、萊施-奈恩綜合癥、安德森-費(fèi)勃萊氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥、Becker型肌營養(yǎng)不良癥、(17)(p11.2p11.2)重復(fù)綜合癥、16p11.2缺失、16p11.2重復(fù)、線粒體缺陷、(22)(q11.2q11.2)重復(fù)綜合癥、貓眼綜合癥、貓叫綜合癥、Wolf-Hirschhorn綜合癥、Williams-Beuren綜合癥、Charcot-Marie-Tooth病、染色體重排、染色體缺失、Smith-Magenis綜合癥、腭心面綜合癥、迪喬治綜合癥、1p36缺失、普拉德-威利綜合癥、精子缺乏(因子a)、精子缺乏(因子b)、精子缺乏(因子c)、脊柱裂、無腦畸形、神經(jīng)管缺損、小頭畸形、腦積水、腎缺如、Kallmann綜合癥、腎上腺發(fā)育不良、Angelman綜合癥、腎囊腫、囊性水瘤、胎兒水腫、臍膨出和腹裂、膈疝、十二指腸閉鎖、骨骼發(fā)育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿癥、楓糖尿病、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥、肝醣貯積癥、腎上腺增生、低磷酸酯酶癥、胎盤類固醇硫酸酯酶缺乏癥、重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥、T-細(xì)胞免疫缺陷、埃勒斯-當(dāng)洛斯綜合癥、成骨不全癥、成人多囊腎疾病、范科尼氏貧血癥、大皰性表皮松解癥綜合癥、少汗型外胚層發(fā)育不良癥、先天性腎變病(芬蘭型)和多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤組成的組。

64.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其進(jìn)一步包括在分離的fNRBC中檢測是否存在蛋白質(zhì)或代謝物。

65.如實(shí)施方式38所述的fNRBC的制備方法，其進(jìn)一步包括在分離的fNRBC中檢測蛋白質(zhì)或代謝物的水平。

66.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，分析所述一種或多種核酸的步驟包括下一代測序技術(shù)或超深度測序。

67.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，在DNA微陣列中分析所述一種或多種核酸。

68.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，在產(chǎn)前染色體微陣列中分析所述一種或多種核酸。

69.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，通過限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測所述胎兒異常。

70.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，所述胎兒異常包括微缺失或微重復(fù)。

71.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，fNRBC包括與正常范圍的端粒長度相比長度增加或減少的端粒。

72.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，分析所述一種或多種核酸的步驟包括對fNRBC的核酸的片段(stretch)進(jìn)行測序。

73.如實(shí)施方式72所述的fNRBC的制備方法，其中，fNRBC的所述核酸片段是通過下一代測序技術(shù)或大規(guī)模平行測序進(jìn)行測序的。

74.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，所述胎兒異常為發(fā)展癌癥的傾向。

75.如實(shí)施方式54所述的fNRBC的制備方法，其中，所述癌癥選自由乳腺癌、腦癌、肝癌、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、腺癌、腺瘤、腎上腺癌、基底細(xì)胞癌、骨癌、支氣管癌、急性或慢性淋巴細(xì)胞或粒細(xì)胞瘤、急性粒細(xì)胞性白血病、宮頸非典型增生、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸癌、表皮樣癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、腎癌、喉癌、平滑肌瘤、惡性高鈣血癥、惡性黑色素瘤、馬方習(xí)性瘤、尤文肉瘤、膽囊癌、膽結(jié)石瘤、骨巨細(xì)胞瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞腫瘤、頭癌、增生、畸胎瘤、增生性角膜神經(jīng)腫瘤、原位癌、腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、髓樣癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、肺癌、淋巴瘤、惡性類癌、粘膜神經(jīng)瘤、蕈狀霉菌病、骨髓增生異常綜合癥、骨髓瘤、頸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、神經(jīng)組織癌、甲狀腺癌、局部皮膚損害、甲狀旁腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性腦腫瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、精原細(xì)胞瘤、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤和腎母細(xì)胞瘤組成的組。

76.一種胎兒有核紅細(xì)胞細(xì)胞(NRBC)的分離方法，其包括：

(a)可選地，提供一種生物液體，其包含一個(gè)或多個(gè)其中每一個(gè)均具有胎兒細(xì)胞表面的fNRBC，及多個(gè)其中每一個(gè)均具有母體細(xì)胞表面的母體細(xì)胞；

(b)通過密度分離方法，從來自第一部分的多個(gè)母體細(xì)胞富集一個(gè)或多個(gè)fNRBC，從而產(chǎn)生包含所述一個(gè)或多個(gè)fNRBC和第一數(shù)量的剩余母體細(xì)胞的第一懸浮液；

(c)用結(jié)合至第一可回收的顆粒的第一抗體溫育所述第一懸浮液，其中，在第一抗體結(jié)合第一抗原以產(chǎn)生第一顆粒-細(xì)胞復(fù)合物的情況下，所述第一抗體結(jié)合存在于母體細(xì)胞的細(xì)胞表面上但在fNRBC細(xì)胞表面上不存在的第一抗原，從第一懸浮液中分離和去除第一顆粒-細(xì)胞復(fù)合物，從而產(chǎn)生包含所述一個(gè)或多個(gè)fNRBC和第二數(shù)量的剩余母體細(xì)胞的第二懸浮液；

(d)將結(jié)合至第二可回收的顆粒的第二抗體添加至第二懸浮液，其中，所述第二抗體結(jié)合存在于fNRBC的細(xì)胞表面上的第二抗原，其中，所述第二抗原在母體細(xì)胞的細(xì)胞表面上不存在，在第二抗體結(jié)合第二抗原以產(chǎn)生第二顆粒-細(xì)胞復(fù)合物的情況下溫育所述第二懸浮液，從第二懸浮液中分離和去除第二顆粒-細(xì)胞復(fù)合物，從第二顆粒-細(xì)胞復(fù)合物中釋放并重懸細(xì)胞，從而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)fNRBC；及

(e)通過物理技術(shù)分離一個(gè)或多個(gè)fNRBC。

77.如實(shí)施方式76所述的胎兒有核紅細(xì)胞細(xì)胞(NRBC)的分離方法，其中所述第二抗體結(jié)合存在于fNRBC有核前體細(xì)胞的細(xì)胞表面上的表面抗原，但不結(jié)合成人紅細(xì)胞上存在的CD71或其他表面抗原。

78.如實(shí)施方式76所述的胎兒有核紅細(xì)胞細(xì)胞(NRBC)的分離方法，其中，所述第二抗體為4B9。

79.如實(shí)施方式76所述的胎兒有核紅細(xì)胞細(xì)胞(NRBC)的分離方法，其中，所述第一抗體包括抗-CD45抗體。

80.如實(shí)施方式76所述的胎兒有核紅細(xì)胞細(xì)胞(NRBC)的分離方法，其進(jìn)一步包括對fNRBC的細(xì)胞組分進(jìn)行染色。

81.如實(shí)施方式76所述的胎兒有核紅細(xì)胞細(xì)胞(NRBC)的分離方法，其中，所述物理技術(shù)為微操作。

82.一種胎兒異常的檢測方法，其包括：

(a)可選地，提供一種生物液體，其包含一個(gè)或多個(gè)其中每一個(gè)均具有胎兒細(xì)胞表面的fNRBC，及多個(gè)其中每一個(gè)均具有母體細(xì)胞表面的母體細(xì)胞；

(b)通過密度分離方法，從來自第一部分的多個(gè)母體細(xì)胞富集一個(gè)或多個(gè)fNRBC，從而產(chǎn)生包含所述一個(gè)或多個(gè)fNRBC和第一數(shù)量的剩余母體細(xì)胞的第一懸浮液；

(c)用結(jié)合至第一可回收的顆粒的第一抗體溫育所述第一懸浮液，其中，在第一抗體結(jié)合第一抗原以產(chǎn)生第一顆粒-細(xì)胞復(fù)合物的情況下，所述第一抗體結(jié)合存在于母體細(xì)胞的細(xì)胞表面上但在fNRBC細(xì)胞表面上不存在的第一抗原，從第一懸浮液中分離和去除第一顆粒-細(xì)胞復(fù)合物，從而產(chǎn)生包含所述一個(gè)或多個(gè)fNRBC和第二數(shù)量的剩余母體細(xì)胞的第二懸浮液；

(d)將結(jié)合至第二可回收的顆粒的第二抗體添加至第二懸浮液，其中，所述第二抗體結(jié)合存在于fNRBC的細(xì)胞表面上的第二抗原，其中，所述第二抗原在母體細(xì)胞的細(xì)胞表面上不存在，在第二抗體結(jié)合第二抗原以產(chǎn)生第二顆粒-細(xì)胞復(fù)合物的情況下溫育所述第二懸浮液，其中，從第二懸浮液中分離和去除第二顆粒-細(xì)胞復(fù)合物，從第二顆粒-細(xì)胞復(fù)合物中釋放并重懸細(xì)胞，從而產(chǎn)生包含所述一個(gè)或多個(gè)fNRBC的第三懸浮液；及

(e)對一個(gè)或多個(gè)fNRBC進(jìn)行分析，從而確定存在或不存在胎兒異常。

83.如實(shí)施方式82所述的胎兒異常的檢測方法，其中所述第二抗體結(jié)合fNRBC有核前體細(xì)胞的細(xì)胞表面上存在的表面抗原，但不結(jié)合成人紅細(xì)胞上存在的CD71或其他表面抗原。

84.如實(shí)施方式82所述的胎兒異常的檢測方法，其中，所述第二抗體為4B9。

85.如實(shí)施方式82所述的胎兒異常的檢測方法，其中，所述第一抗體包括抗-CD45抗體。

86.如實(shí)施方式82所述的胎兒異常的檢測方法，其進(jìn)一步包括對fNRBC的細(xì)胞組分進(jìn)行染色。

87.如實(shí)施方式82所述的胎兒異常的檢測方法，其中所述胎兒異常選自由13-三體綜合癥、18-三體綜合癥、21-三體綜合癥、唐氏綜合癥、壓力易感性神經(jīng)病、神經(jīng)纖維瘤病、阿拉吉?dú)W綜合癥、軟骨發(fā)育不全癥、亨廷頓氏病、α-甘露糖苷貯積癥、β-甘露糖苷貯積癥、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、范-瑞克林豪森氏病、結(jié)節(jié)性硬化癥、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞疾病、泰-薩二氏病、β-地中海貧血、粘多醣貯積癥、苯丙酮尿癥、瓜氨酸尿癥、半乳糖血癥、半乳糖激酶和半乳糖4-差向異構(gòu)酶缺乏癥、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、甲基丙二酸尿癥、丙酸血癥、法伯病、巖藻糖苷貯積癥、神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥、高歇氏病、I-細(xì)胞病、III型粘脂貯積病、尼曼-匹克病、唾液酸沉積癥、沃耳曼氏病、腦肝腎綜合癥、胱氨酸病、凝血因子x缺陷癥、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、布洛姆氏綜合癥、羅伯特綜合癥、著色性干皮病、脆性(X)綜合癥、性染色體非整倍體、Klinefelter氏綜合癥、特納氏綜合癥、XXX綜合癥、類固醇硫酸酯酶缺乏癥、具有線性皮膚缺損的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色體上的睪丸決定因子、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、葡萄糖6-磷酸脫氫酶缺乏癥、萊施-奈恩綜合癥、安德森-費(fèi)勃萊氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥、Becker型肌營養(yǎng)不良癥、(17)(p11.2p11.2)重復(fù)綜合癥、16p11.2缺失、16p11.2重復(fù)，線粒體缺陷、(22)(q11.2q11.2)重復(fù)綜合癥、貓眼綜合癥、貓叫綜合癥、Wolf-Hirschhorn綜合癥、Williams-Beuren綜合癥、Charcot-Marie-Tooth病、染色體重排、染色體缺失、Smith-Magenis綜合癥、腭心面綜合癥、迪喬治綜合癥、1p36缺失、普拉德-威利綜合癥、精子缺乏(因子a)、精子缺乏(因子b)、精子缺乏(因子c)、脊柱裂、無腦畸形、神經(jīng)管缺損、小頭畸形、腦積水、腎缺如、Kallmann綜合癥、腎上腺發(fā)育不良、Angelman綜合癥、腎囊腫、囊性水瘤、胎兒水腫、臍膨出和腹裂、膈疝、十二指腸閉鎖、骨骼發(fā)育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿癥、楓糖尿病、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥、肝醣貯積癥、腎上腺增生、低磷酸酯酶癥、胎盤類固醇硫酸酯酶缺乏癥、重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥、T-細(xì)胞免疫缺陷、埃勒斯-當(dāng)洛斯綜合癥、成骨不全癥、成人多囊腎疾病、范科尼氏貧血癥、大皰性表皮松解癥綜合癥、少汗型外胚層發(fā)育不良癥、先天性腎變病(芬蘭型)和多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤組成的組。

88.一種用于富集來自生物樣品的胎兒有核紅細(xì)胞(fNRBC)的方法，其包括：

(a)對生物樣品進(jìn)行密度分離以獲得包含fNRBC的細(xì)胞級分；

(b)使用至少一種fNRBC陽性選擇試劑對步驟(a)中所得的包含fNRBC的細(xì)胞級分進(jìn)行磁性激活細(xì)胞分選(MACS)以獲得MACS分選的細(xì)胞群體；

(c)用至少一種fNRBC陽性選擇試劑對步驟(b)中所得的MACS分選的細(xì)胞群體中的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記以獲得熒光標(biāo)記的細(xì)胞群體；及

(d)通過選擇fNRBC的流式細(xì)胞術(shù)對步驟(c)中所得的熒光標(biāo)記的細(xì)胞群體進(jìn)行分選，從而獲得富集fNRBC的細(xì)胞群體；

可選地，實(shí)施方式88所述方法進(jìn)一步包括步驟(e)和/或(f)：

(e)可選地，通過諸如微操作等物理方法分離個(gè)體fNRBC或fNRBC組；及

(f)可選地，驗(yàn)證fNRBC的胎兒身份，例如通過遺傳指紋分析。

89.如實(shí)施方式88所述的方法，其中，步驟(b)使用至少一種fNRBC陽性選擇試劑，步驟(c)使用至少兩種fNRBC陽性選擇試劑，可選地，其中，步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑與步驟(c)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑選擇相同的靶標(biāo)(例如，其均為抗相同靶標(biāo)的抗體)。

90.如實(shí)施方式88所述的方法，其中，步驟(b)使用至少一種fNRBC陽性選擇試劑，步驟(c)使用至少三種fNRBC陽性選擇試劑，可選地，其中，步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑與步驟(c)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑選擇相同的靶標(biāo)(例如，其均為抗相同靶標(biāo)的抗體)。

91.如實(shí)施方式88～90中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括單克隆抗體4B9。

92.如實(shí)施方式88～91中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括抗-CD235a抗體。

93.如實(shí)施方式88～92中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，步驟(c)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括單克隆抗體4B9。

94.如實(shí)施方式88～93中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括抗-CD235a抗體。

95.如實(shí)施方式88～94中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括核染料。

96.如實(shí)施方式88～95中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其進(jìn)一包括進(jìn)行微操作以分離個(gè)體fNRBC或fNRBC組。

97.如實(shí)施方式88～96中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其不包括陰性選擇步驟。

98.如實(shí)施方式88～96中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，在步驟(b)之前，對步驟(a)中所得的包含fNRBC的細(xì)胞級分進(jìn)行陰性選擇。

99.如實(shí)施方式88～96中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，在步驟(c)之前，對步驟(b)中所得的MACS分選的細(xì)胞群體進(jìn)行陰性選擇。

100.如實(shí)施方式98或?qū)嵤┓绞?9所述的方法，其中，所述陰性選擇是陰性免疫選擇。

101.如實(shí)施方式100所述的方法，其中，所述陰性免疫選擇使用一種或多種針對選自下組的一種或多種細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體：

(a)T-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD3、CD4或CD8；

(b)B-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD19、CD20或CD32；

(c)泛淋巴細(xì)胞標(biāo)志物，可選地為CD45；

(d)NK細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD56；

(e)樹突細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD11c或CD23；及

(f)巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD14或CD33。

102.一種富集來自生物樣品的fNRBC的方法，其包括：

(a)對生物樣品進(jìn)行密度分離以獲得包含fNRBC的細(xì)胞級分；

(b)使用至少兩種fNRBC陽性選擇試劑對步驟(a)中所得的包含fNRBC的細(xì)胞級分進(jìn)行MACS以獲得MACS分選的細(xì)胞群體；

(c)在步驟(b)中所得的MACS分選的細(xì)胞群體上進(jìn)行微操作以分離個(gè)體fNRBC或fNRBC組。

103.如實(shí)施方式102所述的方法，其中，步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括單克隆抗體4B9。

104.如實(shí)施方式102或?qū)嵤┓绞?03所述的方法，其中，步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括抗-CD235a抗體。

105.如實(shí)施方式102～104中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其不包括陰性選擇步驟。

106.如實(shí)施方式102～104中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，在步驟(b)之前，對步驟(a)中所得的包含fNRBC的細(xì)胞級分進(jìn)行陰性選擇。

107.如實(shí)施方式102～104中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，在步驟(c)之前，對步驟(b)中所得的MACS分選的細(xì)胞群體進(jìn)行陰性選擇。

108.如實(shí)施方式106或?qū)嵤┓绞?07所述的方法，其中，所述陰性選擇是陰性免疫選擇。

109.如實(shí)施方式108所述的方法，其中，所述陰性免疫選擇使用一種或多種抗選自下組的一種或多種細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體：

(a)T-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD3、CD4或CD8；

(b)B-淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD19、CD20或CD32；

(c)泛淋巴細(xì)胞標(biāo)志物，可選地為CD45；

(d)NK細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD56；

(e)樹突細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD11c或CD23；及

(f)巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞表面標(biāo)志物，可選地為CD14或CD33。

110.如實(shí)施方式88～109中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，所述生物樣品是母血。

111.如實(shí)施方式110所述的方法，其中，母血在約4周～約38周的妊娠期間提取。

112.如實(shí)施方式111所述的方法，其中，母血在約6周～約20周的妊娠期間提取。

113.一種通過如實(shí)施方式88～112中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法獲得或可得的富集fNRBC的細(xì)胞群體。

114.一種FACS分選的細(xì)胞群體，其包含從母血富集的(a)至少2個(gè)、至少5個(gè)或至少10個(gè)和/或(b)至多15個(gè)、至多25個(gè)、或至多35個(gè)fNRBC。

115.如實(shí)施方式114所述的FACS分選的細(xì)胞群體，其包含(a)至少20個(gè)、至少50個(gè)或至少100個(gè)和/或(b)至多150個(gè)、至多250個(gè)、或至多350個(gè)FACS事件。

116.如實(shí)施方式113～115中任意一種實(shí)施方式所述的細(xì)胞群體，其未經(jīng)固定。

117.一種檢測胎兒異常的方法，其包括對來自實(shí)施方式113～116中任一個(gè)實(shí)施方式所述的細(xì)胞群體的至少一個(gè)fNRBC進(jìn)行針對胎兒異常的分析。

118.如實(shí)施方式117所述的方法，其進(jìn)一步包括在進(jìn)行分析之前，根據(jù)實(shí)施方式1～112中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法富集fNRBC。

119.如實(shí)施方式117或?qū)嵤┓绞?18所述的方法，其包括對單個(gè)fNRBC進(jìn)行針對胎兒異常的分析。

120.如實(shí)施方式117或?qū)嵤┓绞?18所述的方法，其包括對fNRBC組進(jìn)行針對胎兒異常的分析。

121.如實(shí)施方式119或?qū)嵤┓绞?20所述的方法，其包括在進(jìn)行分析之前，進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。

122.如實(shí)施方式119或?qū)嵤┓绞?20所述的方法，其包括在進(jìn)行分析之前，進(jìn)行基因組子集的擴(kuò)增。

123.如實(shí)施方式117～122中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，所述分析包括定量PCR。

124.如實(shí)施方式117～122中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其中，所述分析在微陣列上進(jìn)行。

125.如實(shí)施方式117～124中任一個(gè)實(shí)施方式所述的方法，其進(jìn)一步包括驗(yàn)證所述fNRBC為胎兒細(xì)胞。

126.如實(shí)施方式125所述的方法，其中，驗(yàn)證包括進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分析、遺傳指紋分析或單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析。

127.如實(shí)施方式125或?qū)嵤┓绞?26所述的方法，其中，驗(yàn)證包括將fNRBCDNA與母本DNA進(jìn)行比較。

128.如實(shí)施方式125或?qū)嵤┓绞?26所述的方法，其中，驗(yàn)證包括將fNRBCDNA與母本和父本DNA均進(jìn)行比較。

雖然示出和描述了多種具體的實(shí)施方式，但可以理解的是，在不脫離本公開的主旨和范圍的情況下可以進(jìn)行多種變化。

14.參考文獻(xiàn)的引用

本申請中引用的全部公開、專利、專利申請和其他文件出于所有目的以其整體作為參考并入本文，其程度等同于單獨(dú)指明將各個(gè)公開、專利、專利申請和其他文件出于所有目的通過參考并入。在本文并入的一種或多種參考文獻(xiàn)與本公開的教導(dǎo)不一致的情況下，以本說明書的教導(dǎo)為準(zhǔn)。