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用于診斷測試的胎兒有核紅細胞(NRBCS)的制備的制作方法

文檔序號:12185038閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種用于富集來自生物樣品的胎兒有核紅細胞(fNRBC)的方法,其包括:

(a)對生物樣品進行密度分離以獲得包含fNRBC的細胞級分;

(b)使用至少一種fNRBC陽性選擇試劑對步驟(a)中所得的包含fNRBC的細胞級分進行磁性激活細胞分選(MACS)以獲得MACS分選的細胞群體;

(c)用至少一種fNRBC陽性選擇試劑對步驟(b)中所得的MACS分選的細胞群體中的細胞進行熒光標記以獲得熒光標記的細胞群體;及

(d)通過流式細胞術對步驟(c)中所得的熒光標記的細胞群體進行分選以選擇fNRBC,從而獲得富集fNRBC的細胞群體。

2.如權利要求1所述的方法,其中,步驟(b)使用至少一種fNRBC陽性選擇試劑,步驟(c)使用至少兩種fNRBC陽性選擇試劑。

3.如權利要求1所述的方法,其中,步驟(b)使用至少一種fNRBC陽性選擇試劑,步驟(c)使用至少三種fNRBC陽性選擇試劑。

4.如權利要求1~3中任一項所述的方法,其中,步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括單克隆抗體4B9。

5.如權利要求1~4中任一項所述的方法,其中,步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括抗-CD235a抗體。

6.如權利要求1~5中任一項所述的方法,其中,步驟(c)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括單克隆抗體4B9。

7.如權利要求1~6中任一項所述的方法,其中,步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括抗-CD235a抗體。

8.如權利要求1~7中任一項所述的方法,其中,步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括核染料。

9.如權利要求1~8中任一項所述的方法,其進一步包括進行微操作以分離個體fNRBC或fNRBC組。

10.如權利要求1~9中任一項所述的方法,其不包括陰性選擇步驟。

11.如權利要求1~9中任一項所述的方法,其中,在步驟(b)之前,對步驟(a)中所得的包含fNRBC的細胞級分進行陰性選擇。

12.如權利要求1~9中任一項所述的方法,其中,在步驟(c)之前,對步驟(b)中所得的MACS分選的細胞群體進行陰性選擇。

13.如權利要求11或權利要求12所述的方法,其中,所述陰性選擇是陰性免疫選擇。

14.如權利要求13所述的方法,其中,所述陰性免疫選擇使用一種或多種抗體,所述一種或多種抗體針對選自以下的一種或多種細胞表面標志物:

(a)T-淋巴細胞細胞表面標志物,可選地為CD3、CD4或CD8;

(b)B-淋巴細胞細胞表面標志物,可選地為CD19、CD20或CD32;

(c)泛淋巴細胞標志物,可選地為CD45;

(d)NK細胞表面標志物,可選地為CD56;

(e)樹突細胞表面標志物,可選地為CD11c或CD23;及

(f)巨噬細胞或單核細胞表面標志物,可選地為CD14或CD33。

15.一種富集來自生物樣品的fNRBC的方法,其包括:

(a)對生物樣品進行密度分離以獲得包含fNRBC的細胞級分;

(b)使用至少兩種fNRBC陽性選擇試劑對步驟(a)中所得的包含fNRBC的細胞級分進行MACS以獲得MACS分選的細胞群體;

(c)在步驟(b)中所得的MACS分選的細胞群體上進行微操作以分離個體fNRBC或fNRBC組。

16.如權利要求15所述的方法,其中,步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括單克隆抗體4B9。

17.如權利要求15或權利要求16所述的方法,其中,步驟(b)中的至少一種fNRBC陽性選擇試劑包括抗-CD235a抗體。

18.如權利要求15~17中任一項所述的方法,其不包括陰性選擇步驟。

19.如權利要求15~17中任一項所述的方法,其中,在步驟(b)之前,對步驟(a)中所得的包含fNRBC的細胞級分進行陰性選擇。

20.如權利要求15~17中任一項所述的方法,其中,在步驟(c)之前,對步驟(b)中所得的MACS分選的細胞群體進行陰性選擇。

21.如權利要求19或權利要求20所述的方法,其中,所述陰性選擇是陰性免疫選擇。

22.如權利要求21所述的方法,其中,所述陰性免疫選擇使用一種或多種抗體,所述抗體針對選自以下的一種或多種細胞表面標志物:

(a)T-淋巴細胞細胞表面標志物,可選地為CD3、CD4或CD8;

(b)B-淋巴細胞細胞表面標志物,可選地為CD19、CD20或CD32;

(c)泛淋巴細胞標志物,可選地為CD45;

(d)NK細胞表面標志物,可選地為CD56;

(e)樹突細胞表面標志物,可選地為CD11c或CD23;及

(f)巨噬細胞或單核細胞表面標志物,可選地為CD14或CD33。

23.如權利要求1~22中任一項所述的方法,其中,所述生物樣品是母血。

24.如權利要求23所述的方法,其中,母血在約4周~約38周的妊娠之間提取。

25.如權利要求24所述的方法,其中,母血在約6周~約20周的妊娠之間提取。

26.如權利要求1~25中任一項所述的方法,其進一步包括驗證至少一個fNRBC的身份為胎兒細胞。

27.一種通過如權利要求1~25中任一項所述的方法獲得或能夠獲得的富集fNRBC的細胞群體。

28.一種FACS分選的細胞群體,其包含從母血富集的(a)至少2個、至少5個或至少10個和/或(b)至多15個、至多25個、或至多35個fNRBC。

29.如權利要求28所述的FACS分選的細胞群體,其包含(a)至少20個、至少50個或至少100個和/或(b)至多150個、至多250個、或至多350個FACS事件。

30.如權利要求27~29中任一項所述的細胞群體,其未經(jīng)固定。

31.一種檢測胎兒異常的方法,其包括對來自權利要求27~30中任一項所述的細胞群體的至少一個fNRBC進行針對胎兒異常的分析。

32.如權利要求31所述的方法,其進一步包括在進行所述分析之前,根據(jù)權利要求1~25中任一項所述的方法富集fNRBC。

33.如權利要求31或權利要求32所述的方法,其包括對單個fNRBC進行針對胎兒異常的分析。

34.如權利要求31或權利要求32所述的方法,其包括對fNRBC組進行針對胎兒異常的分析。

35.如權利要求33或權利要求34所述的方法,其包括在進行所述分析之前,進行全基因組擴增。

36.如權利要求33或權利要求34所述的方法,其包括在進行所述分析之前,進行基因組子集的擴增。

37.如權利要求31~36中任一項所述的方法,其中,所述分析包括定量PCR。

38.如權利要求31~36中任一項所述的方法,其中,所述分析在微陣列上進行。

39.如權利要求31~38中任一項所述的方法,其進一步包括驗證所述fNRBC為胎兒細胞。

40.如權利要求39所述的方法,其中,驗證包括進行短串聯(lián)重復序列(STR)分析、遺傳指紋分析或單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析。

41.如權利要求39或權利要求40所述的方法,其中,驗證包括將fNRBC DNA與母本DNA進行比較。

42.如權利要求39或權利要求40所述的方法,其中,驗證包括將fNRBC DNA與母本和父本DNA均進行比較。

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