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獲得多表位蛋白的方法以及用于體現(xiàn)該方法的DNA載體與流程

文檔序號:12185042閱讀:586來源:國知局
獲得多表位蛋白的方法以及用于體現(xiàn)該方法的DNA載體與流程

Shen,S-H P.N.A.Sci USA 81:4627-4631(1984)公開了獲得多聚體胰島素原(多達(dá)7個拷貝)的方法。利用使用IIS內(nèi)切酶-SfaNI切割的合成DNA片段、堿性磷酸酶、多核苷酸激酶和DNA連接酶,利用DNA長度的連續(xù)串聯(lián)獲得多聚體。然而,該方法不能使在一個反應(yīng)中產(chǎn)生多倍重復(fù)的DNA序列成為可能,因為每次僅可添加單個其它的單體拷貝。

Lennick et al.Gene 61:103-112(1987)公開了編碼8個拷貝的肽激素-心房鈉尿肽的多聚體基因。所描述的方法沒有使用將使產(chǎn)生多個拷貝的編碼肽的序列成為可能的載體,并且所得到的在體外產(chǎn)生的多聚體基因最終被克隆至常用的表達(dá)載體中。該方法也沒有使在單個反應(yīng)中容易地增加DNA序列成為可能,因為每次僅可添加單個其它的單體拷貝。

Kim,S.C.and Szybalski,W.,Gene 71:1-8(1988)公開了使用IIS限制性內(nèi)切酶-BspMI、pSK3DNA載體以及DNA連接酶定向擴增克隆的DNA片段的方法。在多聯(lián)體(concatemer)中獲得30個單體拷貝。然而,BspMI的使用使得在實踐中是困難的,因為其無法徹底消化底物DNA。實際上,保持ORF的連續(xù)性是不可能的,并且擴增將另外的DNA序列引入至擴增的多聯(lián)體中。所描述的方法無法使重復(fù)擴增循環(huán)成為可能,這顯著限制了獲得期望數(shù)目的重復(fù)DNA區(qū)段的可能性。公開的載體不是表達(dá)載體。

Lee,J.H.et al.,Genetic Analysis:Biomolecular Engineering 13:139-145(1996)公開了使用IIS限制性內(nèi)切酶BspMI和Bbsl、pBBS1 DNA載體以及DNA連接酶定向擴增克隆的DNA片段的方法。基于4-核苷酸(nt)的粘DNA末端的自連接,該方法使得不可能保持ORF的連續(xù)性,因為其使得重復(fù)擴增循環(huán)以便實現(xiàn)期望拷貝數(shù)目的擴增的DNA區(qū)段成為可能。使用的載體不是表達(dá)載體。將該方法用于擴增短的抗菌肽基因-mogainin(108個拷貝)。

Lee,J.H.et al.,Protein Expression and purification 12:53-60(1998)公開了基于先前所描述的載體,pBBS1的方法的另一變型。使用的載體不是表達(dá)載體。作者使用Bbsl酶以生成4-nt粘末端,從而嚴(yán)重阻礙了ORF的連續(xù)性。該文獻(xiàn)描述了擴增序列中不超過6個拷貝的DNA單體DNA的產(chǎn)生。該方法用于擴增mogainin抗菌肽基因以及百服嚀(bufferin)II。

Wang,Y.-Q and Cai,J.Y.Appl Biochem Biotechnol.141:203-13(2007)公開了在存在2種DNA適配體的情況下,使用含有不對稱粘末端的合成的DNA片段的自連接,編碼抗生素肽的多聚化基因的另一變體。該適配體含有被限制性內(nèi)切酶Sall和EcoRI識別的序列。該程序不使用載體,擴增難以控制且需要在反應(yīng)期間添加連續(xù)的合成的DNA單體的部分。公開的設(shè)計用于抗菌肽的產(chǎn)生的聚合體基因構(gòu)建的方法,導(dǎo)致在聚合體蛋白質(zhì)中有8個單體拷貝。

本發(fā)明的目標(biāo)為提供容易獲得任意長度的多表位蛋白的方法,可用于該方法的實施方案中的載體以及獲得高階多表位結(jié)構(gòu)的方法。所得到的多表位蛋白以及高階多表位結(jié)構(gòu)可用于廣泛選擇的用途,且尤其可被用于制備改善的功效增強的疫苗。

本發(fā)明的主題為含有擴增模塊的序列的DNA載體,所述擴增模塊包含兩個會聚的被SapI內(nèi)切酶識別的DNA序列以及含有被內(nèi)切酶SmaI識別的用于克隆入插入物的位點的間插DNA序列,其中,優(yōu)選地,擴增模塊具有序列GCTCTTCACCCGGGCCCAGAAGAGC(Seq.Id.No.11)。

優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的DNA載體為蛋白表達(dá)載體,其另外地含有復(fù)制起點,優(yōu)選p15A;抗生素抗性基因,優(yōu)選氯霉素;轉(zhuǎn)錄啟動子,優(yōu)選λ噬菌體的PR;阻遏基因,優(yōu)選c1857ts;翻譯起始信號和可能的編碼6個組氨酸殘基的序列以及編碼翻譯終止信號的序列。

優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的DNA載體含有選自也在圖2中顯示的序列1-6之中的序列。

優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的DNA載體具有序列7(pAMP1-HisA)。

本發(fā)明的下一個主題為獲得多表位蛋白的方法,其特征在于:

a)將編碼表位的平末端DNA序列克隆至以上所定義的DNA載體的被內(nèi)切酶SmaI識別的位點處,或?qū)⒕幋a表位的粘末端DNA序列克隆至以上所定義的DNA載體的被SapI內(nèi)切酶識別的位點處。任選地,為了增加多聯(lián)體形成的效率,有可能進(jìn)行具有粘末端的DNA序列的預(yù)連接,這確保了在添加已經(jīng)被SapI-消化的載體之前的定向連接。

b)將所得到的載體在細(xì)菌宿主中擴增、分離并且用IIS亞型限制性SapI內(nèi)切酶消化,然后修飾含有編碼表位的DNA序列的分離片段,以使得其配備有確保插入物與多聯(lián)體定向連接的單鏈粘末端,

c)使分離片段自連接,

d)將自連接產(chǎn)物克隆至權(quán)利要求1-4所限定的DNA載體的被IIS亞型限制性SapI內(nèi)切酶識別的位點處,以及

e)將所得到的載體用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌宿主,然后表達(dá)并分離多表位蛋白,

其中,為了增加多表位蛋白的大小,在實現(xiàn)步驟e)之前,重復(fù)步驟b)至d)。

任選地,用途由通過將所得到的以上所定義的多表位蛋白固定在大分子載體之上的另一表位擴增步驟構(gòu)成,所述大分子載體如:微生物、細(xì)胞、細(xì)菌、噬菌體、病毒、缺陷病毒體、自聚集蛋白質(zhì)或納米顆粒。

下述實施例含有根據(jù)本發(fā)明的方法的一個可能實施方案變型的詳述??寺∪氩迦胛锏奶娲椒槭褂肧apI-消化的載體,其粘末端在存在脫氧核糖核苷三磷酸的情況下,使用DNA聚合酶填充。按照本發(fā)明,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠提出隨后的實施方案變型。

優(yōu)選地,表位為HBV表位,特別是由合成序列9(也參見圖3)編碼的表位。

優(yōu)選地,擴增的單體區(qū)段可以含有來自不同蛋白或同一蛋白的不同區(qū)域的不同表位,其優(yōu)選由合成序列(參見圖1的示意圖)編碼。

我們還公開了使用基因工程方法以及化學(xué)合成來構(gòu)建以及使用自然界中不存在的人工基因的方法,該人工基因包含編碼含有一種或多種肽的多個單體單元的重復(fù)區(qū)段的多個DNA拷貝。編碼具有特定生物學(xué)功能或化學(xué)功能的肽(表位)的基因的擴增導(dǎo)致所得到的(多)肽與特定配體的期望相互作用的放大。具體地,此類多表位蛋白被用作:(i)人工抗原-新一代對免疫系統(tǒng)具有放大的潛在刺激的疫苗;(ii)聚蛋白,其含有用于其工業(yè)生產(chǎn)或環(huán)境修復(fù)的稀有金屬螯合模塊;(iii)酶輔因子(如陽離子、陰離子、有機分子)的結(jié)合模塊,如在傷口內(nèi)起作用以便終止有害活性的蛋白酶;(iv)保護(hù)性多表位蛋白,即含有用于治療分子疾病、病毒疾病和細(xì)菌疾病的生物學(xué)功能的激活劑或抑制劑的肽的多元模塊;(V)含有肽激素或信號蛋白和刺激組織再生的那些蛋白的生物活性片段的多聚體的多表位蛋白。置于創(chuàng)傷中時,此類蛋白質(zhì)會在蛋白酶的影響下逐步釋放生物活性肽,從而刺激組織的再生;(vi)多表位蛋白固定于大分子載體上,如微生物、細(xì)胞、細(xì)菌、噬菌體、病毒、缺陷病毒體、自聚集蛋白質(zhì)或納米顆粒??梢允褂没蚧蚧瘜W(xué)手段進(jìn)行固定。固定化的多表位蛋白可以放大設(shè)想的用途(i)-(vi)的作用。

具體地,我們設(shè)計了用于擴增DNA區(qū)段的載體-酶系統(tǒng)。擴增的DNA區(qū)段可以為天然來源的或化學(xué)合成的結(jié)果。

實施例1:根據(jù)本發(fā)明的方法的實施方案的總體示意圖。

圖1顯示使用擴增HBV的表面抗原的實例所描述的本發(fā)明方法的總體示意圖。這代表表位(在圖中:合成的HBV表位)的擴增載體以及擴增反應(yīng)的示意圖。

擴增載體含有2個會聚的被IIS亞型限制性內(nèi)切酶識別的DNA序列,所述IIS亞型限制性內(nèi)切酶優(yōu)先識別相對長的DNA序列,切割DNA并生成3-nt(或3nt的倍數(shù))的粘末端。我們使用SapI內(nèi)切酶,其特有特征為:其識別7個堿基對的相對長的序列(在載體和擴增的DNA區(qū)段中為唯一的),在上鏈的1nt和下鏈的4nt距離處切割DNA,從而產(chǎn)生3-nt粘末端或單個密碼子的等同物。在載體中,SapI位點與經(jīng)典的II型內(nèi)切酶的序列相鄰,這設(shè)計用于克隆入插入的DNA。我們使用SmaI內(nèi)切酶,其切割識別序列內(nèi)的DNA,產(chǎn)生所謂的“平”末端。用SmaI切割的載體可以克隆任何任意的合成或天然的DNA區(qū)段,然后擴增該DNA區(qū)段。在優(yōu)選實施方案中,擴增的DNA區(qū)段編碼包含一些相同或不同抗原的抗原或氨基酸序列。唯一的限制為擴增的片段的長度,如給定類別的DNA載體所接受的插入物DNA的長度所決定。使用克隆,可以將擴增模塊轉(zhuǎn)移至不同類別的載體。

實施例2:一系列的6種設(shè)計的pAMP1載體。

在圖2所示的示例性實施方案中,我們基于含有p15A復(fù)制起點的載體骨架設(shè)計了第一系列的pAMP載體。從設(shè)計的載體中,我們構(gòu)建了pAMP1-A(不含6組氨酸殘基融合標(biāo)簽)以及pAMP1-HisA(含有6組氨酸殘基標(biāo)簽)。此外,用λ噬菌體PR的控制下高表達(dá)蛋白的選擇以及與His6標(biāo)簽融合的選擇構(gòu)建pAMP載體系列,所述His6標(biāo)簽使得使用有效的金屬親和層析方案來分離多表位蛋白成為可能。載體含有復(fù)制起點p15A、對抗氯霉素的抗生素抗性基因、來自λ噬菌體的強轉(zhuǎn)錄啟動子PR、阻遏基因c1857ts、翻譯起始信號、具有針對鎳離子的親和力的6個組氨酸殘基的序列、用于與翻譯起始密碼子ATG融合的限制性位點系統(tǒng)以及定向擴增DNA片段的模塊,所述模塊維持ORF,含有被短的DNA區(qū)段隔開的IIS亞型內(nèi)切酶(優(yōu)選SapI)的會聚的限制性位點,所述短的DNA區(qū)段可含有克隆入插入物DNA的輔助限制性位點,優(yōu)選SmaI。變體在操作三個閱讀框的可能性(當(dāng)擴增天然的非合成的DNA序列,其可能是重要的)以及存在或不存在His6標(biāo)簽(對于簡化表達(dá)的多表位蛋白的后續(xù)分離是極好的,而不管多表位蛋白的電荷、溶解性和其它生化參數(shù))方面相異。將變體4用于來自HBV的表面抗原的表位的擴增的下述實施例??梢酝ㄟ^在不同類別的載體中克隆來引入擴增模塊,該載體含有,例如,替代性復(fù)制起點、抗生素抗性基因、轉(zhuǎn)錄啟動子和翻譯信號。例如,我們將擴增模塊轉(zhuǎn)移至分別具有氨芐青霉素抗性、colE1復(fù)制起點以及araBAD或T7轉(zhuǎn)錄啟動子的載體pBAD/Myc-HisA以及pET21d21d(+)。將呈含有和不含His6殘基親和標(biāo)簽形式的,具有針對酶NcoI和SacI的粘末端的合成模塊克隆至用這些酶切割的載體中,從而使得使用araBAD或T7啟動子(分別地)進(jìn)行多表位蛋白的表達(dá)成為可能。我們獲得了在標(biāo)準(zhǔn)MCS(多克隆位點)處具有插入的擴增模塊的載體:pBADAMP1-A、pBADAMP1-HisA、pETAMP1-A、pETAMP1-HisA。

實施例3中所用的pAMP1-HisA載體的全部序列如序列7所示。此外,在圖8中,我們顯示了pAMP1-HisA載體的限制性圖譜,在圖9中,顯示了具有克隆入13-mer抗原肽的pAMP1-HisA載體的限制性圖譜。

實施例2中所用的編碼轉(zhuǎn)移至pBAD和pET載體中的擴增模塊的合成的寡脫氧核糖核苷酸的序列如序列12、13、14和15所示。

實施例3:含有HBV表面抗原的模型7氨基酸表位的多表位蛋白的制備。

進(jìn)行擴增反應(yīng)的HBV表面抗原的模型7氨基酸表位顯示在圖3中。

將編碼HBV表面抗原的表位的合成DNA片段在載體pAMP1-HisA中進(jìn)行預(yù)擴增實驗。我們在體外DNA多聯(lián)體中獲得了>60個拷貝的表位,以及獲得了13個拷貝的體內(nèi)克隆的雜合多表位蛋白。

圖4顯示使用pAMP1-HisA載體、SapI內(nèi)切酶以及DNA連接酶的來自模型HBV表面蛋白的7氨基酸表位的體外擴增反應(yīng)的結(jié)果。

我們使用PAGE分析了擴增反應(yīng)。我們將21bp的合成DNA片段克隆至編碼HBV的7氨基酸表位的擴增載體pAMP1-HisA。用SapI內(nèi)切酶消化含有單體HBV表位的質(zhì)粒,從質(zhì)粒構(gòu)建體切除修飾的表位基因。修飾由向其添加3-nt單鏈5'粘末端組成。除擴增功能以外,在最終的聚合體雜合蛋白質(zhì)中,這些末端負(fù)責(zé)添加脯氨酸殘基,即所謂的“螺旋斷裂劑”,其分離表位單體且促進(jìn)表位獨立折疊成三級結(jié)構(gòu),從而有助于維持其天然的空間結(jié)構(gòu)。添加的“螺旋斷裂劑”的數(shù)目可通過將編碼它們的氨基酸并入合成表位的末端(在其編碼DNA的水平)任意地調(diào)節(jié)。將切除的修飾的編碼表位的DNA在體外進(jìn)行自連接。5至160分鐘的泳道顯示自連接動力學(xué)。通過電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,產(chǎn)生了一系列長度遞增的DNA區(qū)段,其為相對于無DNA連接酶(K)的對照反應(yīng)的表位基因的定向多聯(lián)體(聚合物)。將所得到的體外多聯(lián)體再克隆至pAMP1-HisA,在pAMP1-HisA中,它們能夠進(jìn)行另一擴增循環(huán)或編碼的多聚體蛋白質(zhì)的表達(dá)。

圖5顯示在第一輪擴增期間獲得的編碼多表位HBV蛋白的基因的雜合克隆分析的結(jié)果。

體外聚合合成HBV表位基因的混合物(圖4,泳道:MIX)使用下述體系:將擴增載體pAMP1-HisA/SapI內(nèi)切酶/DNA連接酶再克隆至擴增載體pAMP1-HisA,以便固定聚-HBV表位基因的變體,表達(dá)編碼的多表位蛋白以及反復(fù)進(jìn)行擴增循環(huán)。在第一輪擴增反應(yīng)中,我們獲得一系列克隆,其含有2至13個拷貝的表位(泳道1-13,PCR分析,DNA片段由于其長度漸增而使移動越來越慢,這是連接的表位拷貝的數(shù)目的直接跡象)。DNA序列的分析顯示所得到的構(gòu)建體中ORF的連續(xù)性,因此各個此類合成的多基因編碼不同的多表位HBV蛋白,這在這些合成蛋白的目標(biāo)作用方面是重要的。這是由于以下事實:它們的不同變體會誘導(dǎo)不同的免疫應(yīng)答強度以及以及溶解性不同。用SapI再切除之后,各個多聯(lián)體基因變體可以完全進(jìn)行另一擴增反應(yīng),從而在雜合構(gòu)建體內(nèi)產(chǎn)生后續(xù)的由數(shù)以百計拷貝的HBV表位基因(被脯氨酸殘基隔開)組成的多基因,維持在大腸桿菌細(xì)菌超表達(dá)系統(tǒng)中的ORF連續(xù)性。因此,各個連續(xù)的擴增循環(huán)以幾何速率增加多聯(lián)體的單體拷貝數(shù)目,導(dǎo)致在短時間內(nèi)獲得在目標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建體變體中的計劃數(shù)目的拷貝。

圖6顯示HBV表位的五聚物多聯(lián)體的第二輪擴增的結(jié)果。

使用SapI內(nèi)切酶從在第1輪擴增期間獲得的含有5個表位拷貝的多聯(lián)體的pAMP1-HisA構(gòu)建體切除DNA片段,并且再次進(jìn)行擴增。在瓊脂糖凝膠分辨率的邊緣可見的最大多聯(lián)體含有12個拷貝的五聚物,構(gòu)成了60倍定向聚合的HBV表位。較大多聯(lián)體為明顯可見的,盡管未分離成明顯的條帶。將所得到的第二輪產(chǎn)物再克隆至pAMP-HisA,并且可以進(jìn)行第三輪擴增,從而導(dǎo)致在具有連續(xù)ORF的單個重組多肽(蛋白質(zhì))中示出的數(shù)以百計或數(shù)以千計的HBV表位拷貝的產(chǎn)生。也將這些克隆進(jìn)行分析表達(dá)以便獲得多表位蛋白內(nèi)表位倍增的變體。

圖7顯示在pAMP1-HisA載體(Seq.Id.No.7,圖8)中的第一輪模型擴增(13-mer)中獲得的編碼多表位HBV蛋白的雜合基因的示例性表達(dá)分析。在變性條件和考馬斯亮藍(lán)染色下于聚丙烯酰胺凝膠中,我們進(jìn)行表達(dá)的聚HBV表位13-mer的電泳分析。泳道M,蛋白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)記(GE LMW Calibration Kit);泳道K0-3:誘導(dǎo)之前在0小時、1小時、2小時和3小時取樣的含有13-mer HBV構(gòu)建體的重組大腸桿菌培養(yǎng)物;泳道1h-16h:熱誘導(dǎo)后在1小時、2小時、3小時、4小時和16小時取樣的含有13-mer HBV構(gòu)建體的重組大腸桿菌培養(yǎng)物。紅色箭頭表示被染成紫紅色的生長的HBV 13-mer條帶。13-mer條帶的不同尋常的紫紅色染色(其濃度隨著細(xì)菌中表達(dá)誘導(dǎo)的持續(xù)而增加(連續(xù)泳道))源于著色劑在重復(fù)序列氨基酸區(qū)段上的有序排列,并且因此可以用作檢測和分離期間存在多表位蛋白的另外的測試。我們在含有13-拷貝多聯(lián)體基因的變體的克隆上使用表達(dá)分析(體內(nèi)蛋白質(zhì)合成),所述13-拷貝多聯(lián)體基因由HBV的7-氨基酸表位的擴增所獲得,其中各個表位被脯氨酸殘基隔開(表達(dá)質(zhì)粒,參見:Seq.Id.No.8,圖9)。該技術(shù)維持了ORF連續(xù)性。表達(dá)在大腸桿菌/PRλ噬菌體啟動子的系統(tǒng)中進(jìn)行,產(chǎn)生了人工的多表位HBV蛋白的過表達(dá)。

圖10ABC表示多表位蛋白示例性變體13-拷貝的多聯(lián)體基因的表達(dá)的分離程序,以及蛋白質(zhì)印跡檢測。從準(zhǔn)備的(10L)重組細(xì)菌培養(yǎng)物(具有表達(dá)13-mer HBV表位的擴增載體)以及在誘導(dǎo)和表達(dá)之后,我們離心出細(xì)菌生物質(zhì),并且對其進(jìn)行下述程序:(i)超聲波破碎且離心細(xì)胞碎片;(ii)將裂解物加熱至65℃以使宿主蛋白質(zhì)變性,且離心沉淀的蛋白質(zhì);(iii)用緩沖的聚乙烯亞胺處理制備物以便去除核酸以及酸性宿主蛋白質(zhì)且離心沉淀物;(iv)通過用硫酸銨鹽析分級分離,離心含有13-mer HBV表位的沉淀物并將其溶解在緩沖液中用于后續(xù)的分離步驟;(v)用于螯合鎳離子的在凝膠中的AKTA高效親和層析-HiTrap IMAC HP,其結(jié)合13-mer N-端處的6組氨酸殘基標(biāo)簽;(vi)在Superdex200pg中的AKTA高效分子篩層析。使用抗-6組氨酸殘基標(biāo)簽單克隆抗體,將電泳同質(zhì)的13-mer多表位蛋白的純化的制備物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡,其中使用綴合的HRP以及3,3',4,4'-四氨基聯(lián)苯四鹽酸鹽進(jìn)行顯色反應(yīng)。圖10顯示:圖A-B:來自分離13-mer HBV表位的連續(xù)步驟的樣品的變性PAGE。泳道:M-分子量標(biāo)記(GE LMW Calibration Kit);泳道1-表達(dá)13-mer的重組細(xì)菌細(xì)胞;泳道2-從超聲破碎法所得到的細(xì)胞提取物;泳道3-加熱之后的變性的蛋白質(zhì)沉淀物;泳道4-用聚乙烯亞胺處理之后的含有13-mer的上清液;泳道5和6-用硫酸銨分級分離之后的含有13-mer的上清液;泳道7-使用金屬親和層析進(jìn)行純化之后的HBV 13-mer;泳道8-分子篩層析之后的同質(zhì)的13-mer;圖C:蛋白質(zhì)印跡檢測。泳道1-分子量標(biāo)記(GE LMW Calibration Kit);泳道2-純化的HBV 13-mer制備物;泳道3-用抗-6組氨酸殘基標(biāo)簽(Merck)抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡檢測。

因為重組的宿主自身的蛋白質(zhì)不含6個組氨酸的序列,所以陽性反應(yīng)毫無疑問地證實了分離的蛋白質(zhì)為HBV的多表位13-mer。另外的證明為分離的蛋白質(zhì)與質(zhì)量標(biāo)記相比的預(yù)期大小以及與HiTrap IMAC HP凝膠的特異性結(jié)合。該程序在成功證實與6組氨酸殘基標(biāo)簽融合的且含有不同量的聚合的HBV表位的多表位蛋白的其它變體的分離中為通用的。

實施例4:在T7噬菌體的衣殼表面之上包含含有HBV表面抗原的模型7氨基酸表位的幾百個固定拷貝的多表位蛋白的高階多聚體結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。

多表位蛋白的構(gòu)建促進(jìn)單個蛋白質(zhì)分子中表位濃度的倍增,以及隨后的擴增步驟基于一個高階結(jié)構(gòu)中許多多表位蛋白分子的組合。這可以通過以下來實現(xiàn):(i)生物學(xué)上,通過編碼多表位蛋白的基因與諸如染色體、擬核、微生物質(zhì)粒、細(xì)菌、噬菌體或病毒的高階結(jié)構(gòu)載體的遺傳物質(zhì)的融合,或者(ii)通過化學(xué)手段,通過使大分子結(jié)合的因子的使用。

圖11表示具有指定引物的五聚物表位的多基因的多表位蛋白的序列,所述引物用于擴增HBV表位多基因以及引入EcoRI和HindIII的限制性位點,其用于將所述序列與噬菌體載體在基因上進(jìn)行融合。該序列用于在感染大腸桿菌的T7噬菌體衣殼的表面上設(shè)計針對多表位HBV五聚物表位蛋白質(zhì)的示例性生物固定化程序。我們使用呈利用噬菌體載體T7Select415-1b的形式的商業(yè)的Novagen噬菌體展示系統(tǒng)。所述系統(tǒng)精確地使415個多肽拷貝固定,其中長度不超過約50個氨基酸殘基,因此,在我們優(yōu)選使用五聚物HBV表位的情況下,完整的大分子結(jié)構(gòu)含有2075個拷貝的HBV表位。噬菌體衣殼表面之上多表位蛋白的固定化程序由下述步驟組成:(i)PCR擴增編碼五聚物HBV表位的片段,引入用于克隆DNA片段的載體T7Select415-1b專用的內(nèi)切酶HindIII和EcoRI的限制性位點,同時維持用于與形成T7衣殼的蛋白質(zhì)的翻譯的ORF連續(xù)性;(ii)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI消化PCR-擴增的片段;(iii)將消化的PCR片段與預(yù)先消化的T7噬菌體的HindIII和EcoRI左臂和右臂定向連接;(iv)將重組T7噬菌體進(jìn)行體外包裝并且感染大腸桿菌宿主;(v)分離重組T7噬菌體的單個克隆,擴增克隆以及用設(shè)計的序列確認(rèn)產(chǎn)生的DNA序列。

實施例4中所用的PCR產(chǎn)物的序列(其為用于產(chǎn)生噬菌體展示系統(tǒng)的插入物(編碼五聚物HBV表位的變體)的底物)如序列16所示,以及用于擴增5個HBV表位的變體的PCR引物的序列如序列17和序列18所示。

實施例5:多表位HBV蛋白的免疫學(xué)活性。

使用實施例4所示的程序,從重組細(xì)菌分離實施例2的25-mer多表位HBV蛋白。用與弗氏不完全佐劑混合的PBS緩沖液中的純化的25-mer以20ug/小鼠接種代表性的小鼠群組(各6個個體)。平行地,我們用PBS和弗氏不完全佐劑接種對照組。接種疫苗循環(huán)涵蓋以3周為間隔的3次注射。

圖12顯示實施例3中所用的純化的25-mer以及實施例4中所用的展示幾百拷貝的五聚物HBV表位的重組T7噬菌體的蛋白質(zhì)印跡。使用來自用與弗氏不完全佐劑混合的25-mer多表位HBV蛋白接種的小鼠的血清以及用PBS和弗氏不完全佐劑接種的對照小鼠的血清,將使用變性PAGE分離的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。泳道M,Page Ruler標(biāo)記;泳道1,純化的含有五聚物HBV表位的重組噬菌體。圖A左手邊的箭頭表示噬菌體T7衣殼和五聚物HBV表位的融合蛋白的位置。圖A中右手邊的箭頭顯示純化的25-mer蛋白質(zhì)的多聚體形式;泳道2:根據(jù)圖10純化至同質(zhì)性的25-mer多表位HBV蛋白。結(jié)果顯示針對在多表位蛋白以及重組噬菌體T7的衣殼上展示的多表位蛋白中均存在的7-氨基酸HBV表位的多聚體的3個最初的免疫循環(huán)之后的特異性體液免疫應(yīng)答。同時,除了重組噬菌體T7的DNA序列之外,陽性蛋白質(zhì)印跡結(jié)果確認(rèn)了實施例4克隆程序的正確性和顯示五聚物HBV表位的重組噬菌體的變體以及表明在新一代疫苗的變體中使用所述技術(shù)的可能性。所得到的多表位HBV蛋白以及賦予了多個拷貝的多表位HBV蛋白的重組T7噬菌體構(gòu)成原型抗-HBV疫苗。

序列表

<110> 生物風(fēng)險機構(gòu)有限公司

<120> Spos骲 uzyskiwania bia砶a poliepitopowego oraz wektor DNA do

realizacji tego sposobu

<130> PK/2483/RW

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-A: modu?powielaj筩y

<400> 1

atgcgctctt cacccgggcc cagaagagct aagtaagtaa g 41

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-B: modu?powielaj筩y

<400> 2

atggctcttc acccgggccc agaagagcta agtaagtaag 40

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-C: modu?powielaj筩y

<400> 3

atgccgctct tcacccgggc ccagaagagc taagtaagta ag 42

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-HisA: modu?powielaj筩y

<400> 4

atgcaccacc accaccacca cagctcttca cccgggccca gaagagctaa gtaagtaag 59

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-HisB: modu?powielaj筩y

<400> 5

atgcaccacc accaccacca cgctcttcac ccgggcccag aagagctaag taagtaag 58

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-HisC: modu?powielaj筩y

<400> 6

atgcaccacc accaccacca cccgctcttc acccgggccc agaagagcta agtaagtaag 60

<210> 7

<211> 3003

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> wektor pAMP1-HisA

<400> 7

catgcaccac caccaccacc acagctcttc acccgggccc agaagagcta agtaagtaag 60

agctcgaccc ggtcgaattt gctttcgaat ttctgccatt catccgctta ttatcactta 120

ttcaggcgta gcaccaggcg tttaagggca ccaataactg ccttaaaaaa attacgcccc 180

gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc attctgccga catggaagcc 240

atcacagacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt cgccttgcgt 300

ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg ccacgtttaa 360

atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat tctcaataaa 420

ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg aatatatgtg 480

tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg tttcagtttg 540

ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct caccgtcttt 600

cattgccata cggaattccg gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt gaataaaggc 660

cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa tatccagctg 720

aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat gttctttacg 780

atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca ttttagcttc 840

cttagctcct gaaaatctcg ataactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc ttatttcatt 900

atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc aaaagttggc 960

ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt tattctgcga agtgatcttc 1020

cgtcacaggt atttattcgg cgcaaagtgc gtcgggtgat gctgccaact tactgattta 1080

gtgtatgatg gtgtttttga ggtgctccag tggcttctgt ttctatcagc tgtccctcct 1140

gttcagctac tgacggggtg gtgcgtaacg gcaaaagcac cgccggacat cagcgctagc 1200

ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatgagggt gtcagtgaag tgcttcatgt 1260

ggcaggagaa aaaaggctgc accggtgcgt cagcagaata tgtgatacag gatatattcc 1320

gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac tgcggcgagc ggaaatggct 1380

tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga tacttaacag ggaagtgaga 1440

gggccgcggc aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc tgacaagcat cacgaaatct 1500

gacgctcaaa tcagtggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 1560

ctggcggctc cctcgtgcgc tctcctgttc ctgcctttcg gtttaccggt gtcattccgc 1620

tgttatggcc gcgtttgtct cattccacgc ctgacactca gttccgggta ggcagttcgc 1680

tccaagctgg actgtatgca cgaacccccc gttcagtccg accgctgcgc cttatccggt 1740

aactatcgtc ttgagtccaa cccggaaaga catgcaaaag caccactggc agcagccact 1800

ggtaattgat ttagaggagt tagtcttgaa gtcatgcgcc ggttaaggct aaactgaaag 1860

gacaagtttt ggtgactgcg ctcctccaag ccagttacct cggttcaaag agttggtagc 1920

tcagagaacc ttcgaaaaac cgccctgcaa ggcggttttt tcgttttcag agcaagagat 1980

tacgcgcaga ccaaaacgat ctcaagaaga tcatcttatt aatcagataa aatatttcta 2040

gatttcagtg caatttatct cttcaaatgt agcacctgaa gtcagcccca tacgatataa 2100

gttgtaattc tcatgtttga cagcatgcca tcgatcgcga tcttgctcaa ttgttatcag 2160

ctatgcgccg accagaacac cttgccgatc agccaaacgt ctcttcaggc cactgactag 2220

cgataacttt ccccacaacg gaacaactct cattgcatgg gatcattggg tactgtgggt 2280

ttagtggttg taaaaacacc tgaccgctat ccctgatcag tttcttgaag gtaaactcat 2340

cacccccaag tctggctatg cagaaatcac ctggctcaac agcctgctca gggtcaacga 2400

gaattaacat tccgtcagga aagcttggct tggagcctgt tggtgcggtc atggaattac 2460

cttcaacctc aagccagaat gcagaatcac tggctttttt ggttgtgctt acccatctct 2520

ccgcatcacc tttggtaaag gttctaagct caggtgagaa catccctgcc tgaacatgag 2580

aaaaaacagg gtactcatac tcacttctaa gtgacggctg catactaacc gcttcataca 2640

tctcgtagat ttctctggcg attgaagggc taaattcttc aacgctaact ttgagaattt 2700

ttgcaagcaa tgcggcgtta taagcattta atgcattgat gccattaaat aaagcaccaa 2760

cgcctgactg ccccatcccc atcttgtctg cgacagattc ctgggataag ccaagttcat 2820

ttttcttttt ttcataaatt gctttaaggc gacgtgcgtc ctcaagctgc tcttgtgtta 2880

atggtttctt ttttgtgctc atacgttaaa tctatcaccg caagggataa atatctaaca 2940

ccgtgcgtgt tgactatttt acctctggcg gtgataatgg ttgcatgtac taaggaggtt 3000

gtt 3003

<210> 8

<211> 3348

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> wektor pAMP1-HisA-13-epitop

<400> 8

catgcaccac caccaccacc acagctcttc acccaccaaa ccgaccgacg gtaacgggcc 60

caccaaaccg accgacggta acgggcccac caaaccgacc gacggtaacg ggcccaccaa 120

accgaccgac ggtaacgggc ccaccaaacc gaccgacggt aacgggccca ccaaaccgac 180

cgacggtaac gggcccacca aaccgaccga cggtaacggg cccaccaaac cgaccgacgg 240

taacgggccc accaaaccga ccgacggtaa cgggcccacc aaaccgaccg acggtaacgg 300

gcccaccaaa ccgaccgacg gtaacgggcc caccaaaccg accgacggta acgggcccac 360

caaaccgacc gacggtaacg ggcccagaag agctaagtaa gtaagagctc gacccggtcg 420

aatttgcttt cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc acttattcag gcgtagcacc 480

aggcgtttaa gggcaccaat aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc 540

gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg 600

atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat 660

ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa 720

actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata 780

ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa 840

atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt 900

gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa 960

ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg 1020

cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata 1080

ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat 1140

atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa 1200

tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga 1260

acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt 1320

atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta 1380

ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttactg atttagtgta tgatggtgtt 1440

tttgaggtgc tccagtggct tctgtttcta tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg 1500

gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg gacatcagcg ctagcggagt gtatactggc 1560

ttactatgtt ggcactgatg agggtgtcag tgaagtgctt catgtggcag gagaaaaaag 1620

gctgcaccgg tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat attccgcttc ctcgctcact 1680

gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg cgagcggaaa tggcttacga acggggcgga 1740

gatttcctgg aagatgccag gaagatactt aacagggaag tgagagggcc gcggcaaagc 1800

cgtttttcca taggctccgc ccccctgaca agcatcacga aatctgacgc tcaaatcagt 1860

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctggc ggctccctcg 1920

tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggttta ccggtgtcat tccgctgtta tggccgcgtt 1980

tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc gggtaggcag ttcgctccaa gctggactgt 2040

atgcacgaac cccccgttca gtccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 2100

tccaacccgg aaagacatgc aaaagcacca ctggcagcag ccactggtaa ttgatttaga 2160

ggagttagtc ttgaagtcat gcgccggtta aggctaaact gaaaggacaa gttttggtga 2220

ctgcgctcct ccaagccagt tacctcggtt caaagagttg gtagctcaga gaaccttcga 2280

aaaaccgccc tgcaaggcgg ttttttcgtt ttcagagcaa gagattacgc gcagaccaaa 2340

acgatctcaa gaagatcatc ttattaatca gataaaatat ttctagattt cagtgcaatt 2400

tatctcttca aatgtagcac ctgaagtcag ccccatacga tataagttgt aattctcatg 2460

tttgacagca tgccatcgat cgcgatcttg ctcaattgtt atcagctatg cgccgaccag 2520

aacaccttgc cgatcagcca aacgtctctt caggccactg actagcgata actttcccca 2580

caacggaaca actctcattg catgggatca ttgggtactg tgggtttagt ggttgtaaaa 2640

acacctgacc gctatccctg atcagtttct tgaaggtaaa ctcatcaccc ccaagtctgg 2700

ctatgcagaa atcacctggc tcaacagcct gctcagggtc aacgagaatt aacattccgt 2760

caggaaagct tggcttggag cctgttggtg cggtcatgga attaccttca acctcaagcc 2820

agaatgcaga atcactggct tttttggttg tgcttaccca tctctccgca tcacctttgg 2880

taaaggttct aagctcaggt gagaacatcc ctgcctgaac atgagaaaaa acagggtact 2940

catactcact tctaagtgac ggctgcatac taaccgcttc atacatctcg tagatttctc 3000

tggcgattga agggctaaat tcttcaacgc taactttgag aatttttgca agcaatgcgg 3060

cgttataagc atttaatgca ttgatgccat taaataaagc accaacgcct gactgcccca 3120

tccccatctt gtctgcgaca gattcctggg ataagccaag ttcatttttc tttttttcat 3180

aaattgcttt aaggcgacgt gcgtcctcaa gctgctcttg tgttaatggt ttcttttttg 3240

tgctcatacg ttaaatctat caccgcaagg gataaatatc taacaccgtg cgtgttgact 3300

attttacctc tggcggtgat aatggttgca tgtactaagg aggttgtt 3348

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> sekwecja koduj筩a epitop HBV

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(21)

<400> 9

acc aaa ccg acc gac ggt aac 21

Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn

1 5

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 10

Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn

1 5

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> Modu?powielaj筩y

<400> 11

gctcttcacc cgggcccaga agagc 25

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-A oligo g髍ny

<400> 12

catgcgctct tcacccgggc ccagaagagc taagtaagta ag 42

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-A oligo dolny

<400> 13

agctcttact tacttagctc ttctgggccc gggtgaagag cg 42

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-HisA oligo g髍ny

<400> 14

catgcaccac caccaccacc acagctcttc acccgggccc agaagagcta agtaagtaag 60

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> pAMP1-HisA oligo dolny

<400> 15

agctcttact tacttagctc ttctgggccc gggtgaagag ctgtggtggt ggtggtggtg 60

<210> 16

<211> 182

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> Sekwencja PCR zawieraj筩a insert (wariant 5 powt髍ze?antygenu

HBV) do Phage Display System

<400> 16

caccaccacc acaggaattc acccaccaaa ccgaccgacg gtaacgggcc caccaaaccg 60

accgacggta acgggcccac caaaccgacc gacggtaacg ggcccaccaa accgaccgac 120

ggtaacgggc ccaccaaacc gaccgacggt aactaagctt gaagagctaa gtaagtaaga 180

gc 182

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> Starter g髍ny do Phage Display System

<400> 17

caccaccacc acaggaattc acccacca 28

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> Starter dolny do Phage Display System

<400> 18

gctcttactt acttagctct tcaagcttag ttaccgtcg 39

<210> 19

<211> 220

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> sekwencja z Fig. 11

<400> 19

aggaggttgt tcatgcacca ccaccaccac cacagctctt cacccaccaa accgaccgac 60

ggtaacgggc ccaccaaacc gaccgacggt aacgggccca ccaaaccgac cgacggtaac 120

gggcccacca aaccgaccga cggtaacggg cccaccaaac cgaccgacgg taacgggccc 180

agaagagcta agtaagtaag agctcgaccc ggtcgaattt 220

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