外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)由神經(jīng)和神經(jīng)元構(gòu)成，包括外周神經(jīng)和位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)外或從大腦和脊髓延伸到CNS外的神經(jīng)節(jié)。
PNS涉及到大量遺傳或獲得性的神經(jīng)性疾病，例如腓骨肌萎縮癥、糖尿病性、感染性、毒性和藥物相關(guān)性或免疫相關(guān)性神經(jīng)病變。
對那些疾病有效的臨床干預非常有限?；虔煼ù砹薖NS疾病的一種新型治療策略。然而，有效的PNS轉(zhuǎn)基因仍然對遺傳性和獲得性周圍神經(jīng)病變的基因療法而言非常關(guān)鍵。
據(jù)報道，腺相關(guān)病毒(AAV)載體可有效轉(zhuǎn)導背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元。然而，這需要精細的顯微神經(jīng)外科技術(shù)來將AAV遞送至DRG(Glatzel等,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,442-447)
Foust等(2008,Hum.Gen.Ther.19,61-70)報道，將AAV血清型8載體系統(tǒng)性地遞送至新生小鼠時，AAV可轉(zhuǎn)導背角和后索的神經(jīng)纖維，這表明有DEG的轉(zhuǎn)導。然而，系統(tǒng)性途徑是非特異性的，且需要大量的治療性基因。
Zheng等(2010,Hum.Gen.Ther.21(1),87-97)報道了新生小鼠腹腔注射以及成年小鼠肌肉注射(后肢脛骨前肌和腓腸肌)AAV8轉(zhuǎn)導PNS的能力。在兩種情況中，脊髓白質(zhì)、DRG神經(jīng)元和外周神經(jīng)中均找到了有效、長期的轉(zhuǎn)基因。這些結(jié)果支持了AAV載體從肌肉向脊髓的逆向轉(zhuǎn)運機制，而不是穿越血腦屏障。然而，肌內(nèi)遞送需要多位點注射且效率較低。
Homs等(2011,Gene Therapy 18,622-630)報道了坐骨神經(jīng)注射不同AAV假型(pseudotype)后的趨向性和轉(zhuǎn)導效率。觀察到AAV8能特異性轉(zhuǎn)導施旺細胞，從而為外周神經(jīng)的再生提供了基因治療策略。然而，神經(jīng)的局部施用在臨床水平不可行，尤其是出于安全原因。
Bevan等(2011,Mol.Therapy 19(11),1971-80)報道了對任意年齡獼猴的CNS和外周組織靜脈注射AAV9載體的有效遞送。這為兒科疾病，如脊髓性肌肉萎縮(SMA)，提供了有前景的治療方案。為了減少外周組織的毒性，嘗試了在靜脈注射期間對肝臟進行血流阻斷。此外，它顯示了CSF(腦脊液)注射靶向于運動神經(jīng)元且限制了向CSF的基因表達。
Weismann等(2013,Mol.Therapy 21,S147-148)報道了向GM1(神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥)小鼠模型靜脈內(nèi)施用(IV注射)AAV9-βgal在CNS有酶表達且隨著性別不同而延遲了疾病的發(fā)生。
WO 2010/129021涉及了自補性(sc)AAV載體在治療神經(jīng)退行性病變中的用途，例如SMA或ALS(肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥)。實施例對腦室內(nèi)和脊髓注射進行了描述。
Wang等(2014,Human Mol.Genetics 23(3),668-81)報道了鞘內(nèi)注射AAV(AAVrh10)對ALS的有效RNAi療法。
Dehay等(2012,科技報告2(Scientific Reports 2))報道通過GFP監(jiān)測，系統(tǒng)性(IV)(施用)scAAV9從而介導了新生恒河猴的大腦轉(zhuǎn)導。Gray等(2011,分子療法(Molecular Therapy)19(6),1058-1069)比較了向成年小鼠和非人靈長類神經(jīng)元和膠質(zhì)進行的AAV9(ss和sc)靜脈遞送。WO 2009/043936公開了通過外周(例如IV或IM)施用，采用雙股自補AAV載體向運動神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、脊髓進行的基因遞送。
此外，近期的綜述(Bourdenx等，2014,Front Mol Neurosci.7:50；Murlidharan等.2014,Front Mol Neurosci.7:76；Karda等，2014,Front Mol Neurosci.7:89)列舉了采用腺病毒向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)遞送基因的所有這些選擇。系統(tǒng)性遞送，尤其是IV注射，由于它避免了侵入性大腦外科手術(shù)而顯得很有前景。此外，仍需對控制轉(zhuǎn)基因表達、細胞特異性和載體優(yōu)化進行努力。
因此，本領(lǐng)域需要對PNS和/或CNS有效、簡單、創(chuàng)傷最小化的遞送方法。本發(fā)明滿足了該待滿足的需求。
發(fā)明概述
本發(fā)明基于的觀察結(jié)果為：在犬的隱靜脈局限性輸注AAV8載體一年后，在所輸注的坐骨神經(jīng)檢測到大量的所述載體。
令人意外的是，目前為止被預見為只能通過肌肉遞送且并非用于PNS或CNS疾病的施用途徑，對PNS和/或CNS表現(xiàn)出非常有效的遞送。
定義
本文所用術(shù)語“一”和“一個”指的是一個或一個以上(例如，至少一個)文中的語法對象。例如，“一元素”指的是一個元素或一個以上的元素。
本文所用的“約”指的是一個可測值，例如量、時距等，圍繞該具體值±20％或±10％、優(yōu)選為±5％、更優(yōu)選為±1％、更為優(yōu)選的±1％的變化，該變化適用于完成所公開的方法。
范圍：全文上下，本發(fā)明的多個方面可通過范圍形式進行顯現(xiàn)。應理解，范圍形式的描述僅為方便和簡要起見，而不應當被理解為對本發(fā)明范圍不可改變的限制。因此，對范圍的描述應當被認為是具體公開了所有可能的亞范圍以及在此范圍內(nèi)個別的數(shù)值。例如，對1-6范圍的描述應當被認為是具體公開了如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等的亞范圍，以及在該范圍中的個別數(shù)值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。這無關(guān)范圍的大小而均為適用。
“分離的”指的是從自然狀態(tài)改變的或移出的。例如，在活的動物體內(nèi)天然存在的核酸或肽不是“分離的”，但從共存材料或其天然狀態(tài)中部分或完全分開的相同核酸或肽則是“分離的”。分離的核酸或蛋白可以基本純化的形式存在，或可在非天然環(huán)境中存在，例如在宿主細胞中。
在本發(fā)明的上下文中，采用了以下常見核酸堿基的簡寫。“A”指的是腺嘌呤，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鳥嘌呤，“T”指的是胸腺嘧啶，和“U”指的是尿嘧啶。
除非另行指出，“編碼氨基酸序列的核酸”包括所有互為簡并形式以及編碼相同氨基酸序列的核酸序列。短語，編碼蛋白或RNA的核酸序列還可含有內(nèi)含子，就如同編碼蛋白的某些版本核酸序列中含有一個或多個內(nèi)含子一樣。
“編碼”指的是多核苷酸中(例如基因、cDNA或mRNA)特定核苷酸序列的固有特性，用于在生物進程中合成具有特定核苷酸序列(如rRNA、tRNA和mRNA)或特定氨基酸序列并具有獲自這些序列的生物特性的其它聚合物和大分子的模板。因此，若對應于基因的mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯在細胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生了蛋白，則該基因編碼蛋白。編碼鏈(其核酸序列與mRNA序列相同，通常提供在序列表中)以及非編碼鏈(作為基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的模板)，可被稱為編碼該基因或cDNA的蛋白或其它產(chǎn)物。
如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”被定義為核苷酸鏈。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸以及多核苷酸可以互相替換。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有常識：核酸是多核苷酸，可以水解為單體“核苷酸”。單體核苷酸可以水解為核苷。如本文所用，多核苷酸包括(但不限于)，本領(lǐng)域中采用任何可用方法獲得的所有核酸序列，包括(不限于)：重組方法，如：通過普通克隆技術(shù)和PCR等從重組庫或細胞基因組獲得的核苷酸序列克?。灰约巴ㄟ^合成的方法。
如本文所用，術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白”可互換使用，均指包含了通過肽鍵共價連接的氨基酸殘基的化合物。蛋白或肽必須包含至少兩個氨基酸，蛋白或多肽序列所包含的氨基酸最大數(shù)量沒有限制。多肽(包括任何肽或蛋白)包括兩個或多個通過肽鍵互相連接的氨基酸。如本文所用，該術(shù)語指的是短鏈，通常在本領(lǐng)域中被稱為例如肽、寡肽和寡聚物；以及長鏈，通常在本領(lǐng)域中被稱為蛋白，其有多種類型?！岸嚯摹卑?，例如生物活性片段、寡肽、二聚體、異二聚體、多肽的變體、經(jīng)修飾的肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。所述多肽包括天然的肽、重組肽、合成肽或其組合。
“同源的”或“相同的”指的是兩個多肽或兩個核酸分子之間的序列相似度或序列相同性。當兩個相比較的序列的同一個位置被相同的堿基或氨基酸亞單位單體占用，例如兩個DNA分子各自的同一個位置被腺嘌呤所占，則所述分子在該位置為同源的或相同的。兩個序列之間同源性/相同性百分比的函數(shù)是兩個序列共有匹配或同源位置數(shù)除以所比較的位置數(shù)乘以100。例如，兩個序列10個位置中有6個是匹配的或同源的，則兩個序列為60％同源/相同。通常，該比較是在兩個序列對齊后獲得的最大同源性/相同性。
“載體”是一種組合物質(zhì)，包含了分離的核酸且可以用于將分離的核酸遞送至細胞內(nèi)部?，F(xiàn)有技術(shù)已知的大量載體包括，但不限于，線性多核苷酸、離子或兩性化合物相關(guān)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此，術(shù)語“載體”包括自動復制質(zhì)?；虿《尽Ｔ撔g(shù)語還應當被理解為包含了非質(zhì)粒和非病毒的化合物，其有助于將核酸轉(zhuǎn)移入細胞中，例如，如多賴氨酸化合物、脂質(zhì)體等等。病毒載體的例子包括但不限于，腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。
“表達載體”指的是包含重組多核苷酸(包含了可操作的連接于需表達的核苷酸序列的表達控制序列)的載體。表達載體包含了足夠的表達用順式作用元件；表達的其它元件可由宿主細胞或體外表達系統(tǒng)提供。表達載體包括所有現(xiàn)有技術(shù)中已知的那些，例如包含了重組多核苷酸的黏粒、質(zhì)粒(如，裸露的或包含于脂質(zhì)體內(nèi)的)以及病毒(例如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
如本文所用，術(shù)語“啟動子”被定義為經(jīng)細胞合成機制識別、或合成機制引入、多核苷酸序列特異性轉(zhuǎn)錄啟動所必須的DNA序列。
如本文所用，術(shù)語“啟動子/調(diào)節(jié)序列”指的表達與啟動子/調(diào)節(jié)序列可操作相連的基因產(chǎn)物所需要的核酸序列。在某些情況下，該序列可以是核心啟動子序列，而在另一些情況下，該序列可以包括增強子序列以及其他表達基因產(chǎn)物所需要的調(diào)節(jié)元件。所述啟動子/調(diào)節(jié)序列可以是，例如以組織特異性方式表達基因產(chǎn)物的那種。
“組成型”啟動子是一種可操作地連接于編碼或定義基因產(chǎn)物的多核苷酸的核酸序列，其在大部分或所有生理情況下均能在細胞中引起基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。
“誘導型”啟動子是一種可操作地連接于編碼或定義基因產(chǎn)物的多核苷酸的核酸序列，其基本上僅在對應于該啟動子的誘導劑存在于細胞中時才能在細胞中引起基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。
“組織特異性”啟動子是一種可操作地連接于編碼或由基因定義的多核苷酸的核酸序列，其基本上僅在細胞是對應于該啟動子組織類型的細胞時在細胞中引起基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。
當術(shù)語“異?！庇糜谏矬w、組織、細胞或其組分的上下文時，指的是與各特征表現(xiàn)“正?！?預期的)的生物體、組織、細胞或其組分在至少一個可觀察或可檢測的特征(例如，年齡、治療、當日時間等)上不同的那些生物體、組織、細胞或其組分。一個細胞或組織類型正?；蚩深A期的特征對不同細胞或組織類型而言可以是異常的。
術(shù)語“患者”、“對象”、“個體”等在本文可互換使用，指的是體外或體內(nèi)接受本文所述方法的任何動物或其細胞。在某個非限制性的實施方式中，所述患者、對象或個體是人。
“疾病”是動物的一種健康狀態(tài)，其中所述動物無法維持體內(nèi)平衡，且如果該疾病沒有改善，則所述動物的健康持續(xù)惡化。相比之下，“失調(diào)”是動物還能夠維持該動物體內(nèi)平衡的健康狀態(tài)，但該動物的健康狀體比沒有失調(diào)時更為不適。如果不加以治療，失調(diào)未必會引起動物健康狀態(tài)的進一步下降。
若疾病或失調(diào)癥狀的嚴重程度、患者所經(jīng)受該癥狀的頻率、或二者有所下降，則疾病或失調(diào)是“緩解的”。若疾病或失調(diào)癥狀的嚴重程度、患者所經(jīng)受該癥狀的頻率、或二者消失，則疾病或失調(diào)是“治愈”的。
“治療性”治療是給予表現(xiàn)出病理性體征的對象的治療方法，以便減少或消除那些體征。
如本文所述，“治療疾病或失調(diào)”指的是降低對象所經(jīng)受的至少一種疾病或失調(diào)體征或癥狀的頻率或嚴重程度。在治療的上下文中，疾病和失調(diào)可互換使用。
化合物的“有效量”是足以向施用該化合物的對象提供有益效果的化合物的量。如本文所用，短語“治療有效量”指的是足以或有效預防或治療(延緩或預防其發(fā)生、預防其進展、抑制、降低或逆轉(zhuǎn))疾病或失調(diào)或病情(包括緩解其癥狀)的量。遞送載體的“有效量”是其足以有效結(jié)合或遞送化合物的量。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及一種向?qū)ο蟮耐庵苌窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)遞送分子的策略。本文所公開的方法通過采用標記物(如GFP蛋白)提供顯像的潛能，并由此使組織可見?；蛘撸ㄟ^向組織遞送治療性分子，從而可以治療PNS和/或CNS疾病或失調(diào)。
雖然本申請揭示了向PNS進行有效的遞送，但據(jù)信會如先前報道的通過逆轉(zhuǎn)運而出現(xiàn)向CNS的遞送(Zheng等.(2010,Hum.Gen.Ther.21(1),87-97)。
在一實施方式中，本發(fā)明提供了向?qū)ο蟮耐庵苌窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)遞送分子的方法，包括通過局部或局限性注射而向所述對象施用含有所述分子的組合物。換言之，本發(fā)明涉及一種含有分子的組合物用于將所述分子向外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)遞送所述分子，其中，所述組合物通過局部或局限性注射施用。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及分子的用途，用于制備通過局部或局限性注射向PNS和/或CNS遞送分子的診斷性或治療性組合物(藥物)。
在一優(yōu)選方式中，所述組合物含有有效量的所述分子。
施用的途徑是將藥物或其它物質(zhì)攝入體內(nèi)的路徑。施用途徑通常以施用位置的部位分類(例如，口服或靜脈施用)。路徑也可根據(jù)作用靶點而分類。作用可以是外用的(局部)、腸內(nèi)的(全系統(tǒng)效果，但通過胃腸(GI)道遞送)、或胃腸外的(系統(tǒng)性作用，但經(jīng)過GI通道以外的路徑遞送)。
胃腸外施用的可用模式包括：
-靜脈內(nèi)(IV，入靜脈)或動脈內(nèi)(入動脈)，通常稱為“系統(tǒng)性施用”；
-骨內(nèi)輸注(入骨髓)，是一種間接的靜脈通路，因為骨髓直接流入靜脈系統(tǒng)；
-肌肉內(nèi)(IM)；
-進入腦實質(zhì)的腦內(nèi)；
-進入椎管的鞘內(nèi)；
-在皮膚下的皮下(sc)。
術(shù)語“注射”(或“輸注”或“輸入”)包括靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SC)以及肌肉內(nèi)(IM)施用。注射通常通過采用注射器或?qū)Ч苓M行?？焖龠M行注射，開始進行的時間，IV為15-30秒，IM為10-20分鐘，SC為15-30分鐘。血管內(nèi)注射能在很短的時間內(nèi)有普遍的分布，會增加過量和/或副作用的風險。與此相反，肌肉內(nèi)注射有較慢和局部的擴散，會有達不到靶組織或劑量不夠的風險。
根據(jù)本發(fā)明，將含有所需分子的組合物施用于隔離的肢體從而保證局性或局部(局限性)輸入或輸注。換言之，本發(fā)明包括通過壓力下血管內(nèi)施用(例如通過靜脈(經(jīng)靜脈的)或動脈)而向腿和/或手臂局部遞送所述組合物。通常這通過采用止血帶來暫時阻斷血循環(huán)而使輸注的產(chǎn)品進行局部擴散，例如，Petrov等(2011,Methods Mol Biol 709:277-86),Arruda等(2010,Blood 115(23):4678-88)和Zheng Fan等(2012,Molecular Therapy 20(2),456-461)的公開。
與“經(jīng)典的”系統(tǒng)性施用(尤其是IV)相比，當采用局限性施用時，注射物首先在注射點局部擴散，然后(撤去壓力時)進入血循環(huán)。
這種體內(nèi)向組織遞送多核苷酸的方法主要在WO 2005/060746中公開，其教導了：
a)將含有病毒載體的溶液插入到血管(輸入的或輸出的)的管腔內(nèi)；
b)提高組織內(nèi)血管的通透性；
c)將病毒載體地送到血管外的組織。
實際上，血管通透性的增加可通過注射大容量、快速注射溶液、針對血管壁提高液體靜水壓(如阻斷血管的流出)、提高滲透壓、阻斷血管的液體流動以及注射含有血管舒張劑的溶液而獲得。
該施用途徑，通常稱為局部(局限性)注射”、“隔離肢體輸注施用”或“經(jīng)靜脈高壓肢體輸注”，已經(jīng)作為基因遞送方法在肌肉萎縮癥中成功使用(Zheng等(2012,Molecular Therapy 20(2),456-461)。
根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明涉及含有診斷或治療性分子的組合物用于將所述分子向?qū)ο蟮耐庵苌窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)遞送所述分子，其中所述組合物在血管通透性提高的條件下通過血管內(nèi)路徑施用，優(yōu)選在加壓下。
在一實施方式中，所述組合物注射在該對象的肢體上。在一實施方式中，所述對象是哺乳動物，優(yōu)選為犬、非人靈長類或人。當所述對象為人時，所述肢體可以是手臂或腿。當所述對象為動物時，所述肢體可以是上肢或下肢。
根據(jù)一個實施方式，所述組合物施用于所述對象身體的下部，例如，在腹股溝或膝下。
在一實施方式中，所述組合物施用于外周靜脈，優(yōu)選為隱靜脈，更優(yōu)選為隱靜脈遠端。更普遍的說，所述組合物可注射于：
-通過：淺靜脈(如大隱或小隱靜脈)；深靜脈(如股靜脈、腘靜脈、脛前或脛后靜脈)；動脈(如股動脈、股深動脈、腘動脈、脛前或脛后動脈)向腿輸注；
-通過：淺靜脈(如指靜脈、掌靜脈、頭靜脈、貴要靜脈、前臂正中靜脈)；深靜脈(如指靜脈、掌靜脈、橈靜脈、尺靜脈、肱靜脈)；動脈(肱動脈、橈動脈和尺動脈及其分支)。
根據(jù)一優(yōu)選實施例，所述組合物通過靜脈內(nèi)注射施用。根據(jù)另一實施例，所述組合物在所述對象的肢體血管中施用。
根據(jù)一實施例，所述溶液的體積有利于提高血管的通透性。所輸注的所述組合物體積可以最高達肢體容量的50％，但可在肢體容量約5-20％的范圍內(nèi)。
犬或人的典型劑量可以在10-20ml/kg體重之間變化，特別地，該劑量被計算為15ml/kg體重。
含有感興趣分子的所述組合物優(yōu)選為生理鹽水組合物，較佳地為林格氏乳酸溶液，如0.9％的生理鹽水。
根據(jù)另一實施例，溶液注射的速度有利于提高血管的通透性。在一實施方式中，平均流速在50-150ml/min以內(nèi)，優(yōu)選在60-80ml/min以內(nèi)。
在一實施例中，所施加的壓力(止血帶壓力或最大管路壓力)低于100000Pa，優(yōu)選低于50000Pa。在一優(yōu)選實施例中，所施加的壓力約為300torr(40000Pa)。
在一實施例中，采用止血帶停止所述肢體的血循環(huán)。優(yōu)選地，所述止血帶置于注射位點之上，例如，高于手腕或高于膝蓋。
根據(jù)另一實施例，所述止血帶繃緊數(shù)分鐘，具體約為1-20分鐘，例如約15分鐘。在一優(yōu)選實施例中，在施用之前和施用期間采用止血帶，如在輸注以前約10分鐘或在輸注期間約5分鐘。更具體地，所施用的壓力持續(xù)數(shù)分鐘，具體在1-20分鐘，例如約15分鐘。在一優(yōu)選實施例中，所述壓力在施用之前和施用期間施加，例如輸注之前約10分鐘或在輸注期間約5分鐘。
根據(jù)一具體實施例，將止血帶置于腹股溝水平并調(diào)整，直至超聲無法測得股(動脈)搏動，從而暫時性阻斷血流進入目標肢體。在收緊止血帶前，在遠端放置可松緊繃帶，從而向近端方向給肢體排血。將載體懸浮于相當于20％后肢總?cè)萘?通過容積排水量測定)的林格氏乳酸溶液中，并通過置于爪部背面外周隱靜脈遠端分支內(nèi)的14G導管施用。止血帶共收緊15分鐘(輸注前10分鐘，輸注時5分鐘)。
在本發(fā)明框架內(nèi)，外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)包括位于中樞神經(jīng)(CNS)外或從大腦和脊髓CNS延伸出的神經(jīng)和神經(jīng)元。其包括外周神經(jīng)(如坐骨神經(jīng)……)、神經(jīng)節(jié)(如背根神經(jīng)節(jié)……)和髓核中的神經(jīng)元(運動神經(jīng)元)。
在本發(fā)明框架內(nèi)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)包括髓核，尤其是運動神經(jīng)元(活動神經(jīng)元)。
意外地，經(jīng)觀察通過本發(fā)明方法遞送的分子可以在單次局部注射1年后在靶組織內(nèi)檢測到。在一實施例中，本發(fā)明提供了一種向?qū)ο蟮耐庵苌窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)遞送分子的方法，其中所述分子于1天、3天、1周、2周、1個月、3個月、6個月、1年、5年或更長(時間)時可在該對象的PNS和/或CNS中檢測到。然而，即便瞬時表達/檢測亦可對于組織顯影或?qū)τ谒鑼ο蟮闹委熡杏谩?/p>
在一具體實施例中，所述方法包括單次施用所述組合物。
本發(fā)明可采用本發(fā)明公開的方法遞送任何種類或類型的分子。所述分子可以是化學分子、抗體、肽或蛋白、核酸或載體，例如病毒載體。所述分子還可以設(shè)計用于標記或顯影，或可以是治療性的分子。
在一實施例中，出于標記或診斷性目的，所述分子是采用可用的檢測或顯影技術(shù)(放射性、熒光、MRI……)能夠使目標組織可視化的，優(yōu)選為特異性或選擇性可視化的分子。這類分子非限制性的例子包括：對比試劑、熒光團、熒光標記顯像劑。
特別感興趣的是治療性分子，其能夠治療或緩解PNS和/或CNS疾病或失調(diào)。在一實施例中，所述疾病與一個或多個缺陷蛋白相關(guān)。
在本文中，所述治療性分子可以是：
-生物功能性蛋白或其活性片段。正如本領(lǐng)域所理解的那樣，活性片段是維持全長序列生物學功能的全長序列的一部分；
-編碼所述蛋白或片段的分離的核酸序列，例如，轉(zhuǎn)基因、裸露或包含在表達載體內(nèi)的。較常見的，它可以是分離的核酸，其編碼與本文公開的肽基本同源的肽。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明肽的分離核酸的核苷酸序列是“基本相同的”，即與編碼所述蛋白或片段的分離核酸的核苷酸序列約為60％相同性、更優(yōu)選約為70％相同性，更優(yōu)選約為80％相同性，更優(yōu)選為90％相同性，進一步更優(yōu)選為95％相同性，乃至更優(yōu)選為99％相同性；
-可以更正天然蛋白內(nèi)缺陷的分離的核酸序列，例如，誘導外顯子跳躍/包含或沉默基因表達的反義RNA(siRNA、shRNA)、微小RNA(miRNA)、其它RNA和DNA片段。
在一實施例中，分離的核酸序列編碼蛋白，該核酸稱為轉(zhuǎn)基因。在一具體實施例中，所述轉(zhuǎn)基因?qū)陂_放閱讀框并可能通過表達載體由本發(fā)明方法進行遞送。
在一實施例中，轉(zhuǎn)基因的序列對應于該對象中存在的天然(內(nèi)源性)序列。在一具體實施例中，所述內(nèi)源性序列是有缺陷的，例如，表現(xiàn)出一個或多個突變，會導致缺乏相應的蛋白或產(chǎn)生部分或完全失活的蛋白，或?qū)讷@得性功能的蛋白，尤其是在PNS和/或CNS中并與疾病相關(guān)。
更普遍地說，所感興趣的基因可以是治療性蛋白或上述公開蛋白的編碼序列。
其它感興趣的分子包括神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF、BDNF、NT3、CNTF、GDNF、神經(jīng)生長因子(neurturin)、persephin、artemin……)、營養(yǎng)因子(IGF1、IGF2……)、細胞凋亡或細胞死亡誘導基因(如半胱天冬氨酸酶)。
所述核酸序列可以是單鏈或雙鏈DNA、RNA或cDNA。
在一實施例中，所述核酸可以以裸核酸序列施用。為了有利于細胞轉(zhuǎn)導，可以將核酸序列與多種結(jié)構(gòu)相連，例如，膠體分散體體系(納米膠囊、微球……)或脂基系統(tǒng)(乳劑、微膠粒、脂質(zhì)體……)。
在另一實施例中，所述組合物含有質(zhì)?；蜉d體。根據(jù)一特定實施例，將分離的核酸插入到載體內(nèi)。簡而言之，天然或合成核酸的表達具體通過將核酸或其部分可操作地連接于啟動子并將該構(gòu)建物放入表達載體從而獲得。所用的載體適于在真核細胞內(nèi)復制，以及任選地進行整合。典型的載體含有轉(zhuǎn)錄或翻譯終止子、起始序列以及有助于調(diào)節(jié)所需核酸序列表達的啟動子。
在一實施例中，所述組合物含有表達載體，優(yōu)選為病毒載體。在一實施例中，所述病毒載體選自下組：桿狀病毒載體、皰疹病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、和腺相關(guān)(AAV)病毒載體，優(yōu)選為腺相關(guān)病毒載體。
根據(jù)優(yōu)選的實施例，所述組合物含有AAV載體作為遞送感興趣分子(診斷性或治療性)的運載體。
在局限性施用的情況下，所注射的劑量可在1012-1015vg/kg患者體重之間變化，優(yōu)選為1013-1014vg/kg，例如，2.5-5.1013vg/kg。
腺相關(guān)病毒(AAV)載體已經(jīng)成為治療多種病變的強大基因遞送載體。AAV載體具有很多特征使其理想應用于基因治療，包括無致病性、免疫原性極小且能以穩(wěn)定、有效的方式轉(zhuǎn)導有絲分裂后的細胞。通過選擇AAV血清型、啟動子以及遞送方式的合適組合，可以將AAV載體內(nèi)特定基因的表達特異性地靶向于一種或多種細胞內(nèi)。
在一實施方式中，核酸序列包含在AAV載體中。已知有100種以上天然存在的AAV血清型。AAV衣殼中存在許多天然變體，有助于辨別并利用具有適合PNS和/或CNS具體特性的AAV。AVV病毒可采用常規(guī)分子生物技術(shù)進行工程化，從而使這些粒子的優(yōu)化成為可能，將其用于細胞特異性地遞送核酸序列、用于使免疫原性最小化、用于調(diào)節(jié)穩(wěn)定性和粒子壽命、用于有效降解、用于向核內(nèi)精準遞送。
如上所述，AAV的使用是外源性DNA遞送的常見方式，因為它相對無毒、提供有效的基因傳遞并易于為特定目的而進行優(yōu)化。在從人或非人靈長類(NHP)分離的AAV血清型中，經(jīng)過充分表征，人血清型2是第一種開發(fā)作為轉(zhuǎn)基因載體的AAV。其它現(xiàn)在用的AAV血清型包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。此外，非天然的工程化變體和嵌合AAV也可以是有用的。
用于裝配成載體的所需AAV片段包括帽(結(jié)構(gòu))蛋白，包括vp1、vp2、vp3和高度可變區(qū)，rep蛋白，包括rep78、rep68、rep52和rep40，以及編碼這些蛋白的序列。這些片段易于在載體系統(tǒng)和宿主細胞中使用。
這些片段可以單獨使用，與其它AAV血清型序列或片段聯(lián)合使用，或與來自其它AAV或非AAV病毒序列的元件聯(lián)合使用。如本文所用，人造AAV血清型包括(不限于)具有非天然存在衣殼蛋白的AAV。這樣的人工衣殼可以通過合適的技術(shù)形成，其采用將所選擇的AAV序列(vp1衣殼蛋白片段)與獲自于所選不同的AAV血清型的異源性序列、相同AAV血清型非連續(xù)部分聯(lián)合，其來源于非AAV病毒來源，或源于非病毒來源。人工AAV血清型可以是(不限于)嵌合衣殼、重組AAV衣殼或“人源化的”AAV衣殼。因此，示例AAV或人工AAV尤其包括AAV2/8(US 7,282,199)、AAV2/5(獲自國立健康研究院)、AAV2/9(WO2005/033321)、AAV2/6(US 6,156,303)和AAVrh8(WO2003/042397)。在一實施例中，用于本文所述組合物和方法中的載體至少包括所選AAV血清型衣殼(如AAV8衣殼)或其片段的編碼序列。在另一優(yōu)選例中，有用的載體至少包括，所選AAV血清型rep蛋白(如AAV8rep蛋白)或其片段的編碼序列。任選地，這些載體可含有AAV帽狀結(jié)構(gòu)(cap)和rep蛋白。在提供有AAV rep和帽狀結(jié)構(gòu)的載體中，其中AAV rep和AAV帽狀結(jié)構(gòu)序列可以都是同一血清型來源的，例如都是AAV8來源?；蛘撸刹捎玫妮d體中，rep序列所來源的AAV血清型與提供帽狀結(jié)構(gòu)序列的不同。在一實施例中，rep和帽狀結(jié)構(gòu)序列可以由不同的來源所表達(例如不同的載體、或宿主細胞和載體)。在另一實施例中，這些rep序列與不同AAV血清型的帽狀結(jié)構(gòu)序列在同一框架下融合從而形成嵌合AAV載體，例如AAV2/8(US 7,282,199)。
在本發(fā)明中所采用的AAV載體，AAV的基因組可以是單鏈(ss)核酸或雙鏈(ds)、自補型(sc)核酸。
根據(jù)優(yōu)選的實施例，所感興趣的分子是上述定義的核酸序列。
優(yōu)選地，將感興趣的核酸序列插入到AAV載體的IRT(《末端反向重復》)序列之間。
本領(lǐng)域所知，重組病毒顆?？梢垣@自：例如通過三重轉(zhuǎn)染(tri-transfection)293HEK細胞、通過單純性皰疹病毒系統(tǒng)和通過桿狀病毒系統(tǒng)。載體滴度通常表達為病毒基因組/ml(vg/ml)。
在一實施例中，表達載體包括調(diào)節(jié)序列，尤其是啟動子序列。這種啟動子可以是天然或合成(人工)啟動子，誘導型或組成型。
在一實施例中，啟動子是泛素啟動子或具有較低的組織特異性。作為示例，表達載體可以含有磷酸甘油酸酯激酶1(PGK)、EF1、β-肌動蛋白、CMV啟動子。
在一優(yōu)選實施例中，選擇啟動子序列從而充分支配在其控制下的核酸序列在表達水平、組織特異性方面的表達。在一實施例中，表達載體含有PNS和/或CNS特異性啟動子，例如P0、NSE、SYN1、Hb9或Thy-1啟動子。
其它可能的調(diào)節(jié)序列的非窮盡性列表為：
-多腺苷酸化信號，例如，感興趣基因的聚合A、SV40或β-血紅蛋白(HBB2)的聚合A，優(yōu)選在感興趣序列的3’端；
-穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物的序列，例如血紅蛋白內(nèi)含子1(HBB2)；
-增強子序列；
-miRNA靶序列。
至今為止，已有超過40個基因與腓骨肌肉萎縮癥相關(guān)，超過15個基因與影響運動神經(jīng)元的疾病相關(guān)。其缺陷影響PNS和/或CNS病變的感興趣基因有：
-腓骨肌肉萎縮癥：PMP22、GJB1、MPZ、LITAF、EGR2、NEFL、GAN1、KIF1B、MFN2、TRPV4、GDAP1、DYNC1H1、RSAM1、GNB4、HSPB1、HSPB3、HSPB8、GARS、YARS、AARS、HARS、KARS、MTMR2、MTMR13、RAB7、SPTLC1、SPTLC2、DNM2、PDK3、SH3TC2、NDRG1、PRX、HK1、FGD4、FIG4、CTDP1、LMNA、MED25、PRPS1、FBLN5、INF2、BSCL2、DCTN1、SLC5A7、SETX、REEP1、IGHMPB2、ATP7A；
-運動神經(jīng)元疾?。篠MN1、SOD1、TARDBP、FUS、C9ORF72、SETX、VAPB.ANG、FIG 4、OPTN、VCP、alsin、spatacsin、UBQLN2、SIGMAR1、DCTN1。
作為示例，肌微管素(MTM1)基因家族包括了15個成員，2個成員(MTMR2、MTMR13)的突變與PNS疾病相關(guān)。在本文中，遞送功能性(可能是天然的)蛋白或相應基因會治療或甚至治愈這類疾病。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種治療對象的外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的方法，包括向所述對象通過上文所述的局部或局限性輸注而施用含有治療性分子的組合物。換言之，本發(fā)明涉及含有治療性分子的組合物，用于治療外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，其中所述組合物通過如上定義的局部或局限性輸注而施用。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及分子的用途，用于制備治療外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的藥物，其中所述藥物通過如上定義的局部或局限性輸注而施用。
在一優(yōu)選實施例中，所述組合物含有治療有效量的所述分子。
特別讓人感興趣的是外周神經(jīng)病變和運動神經(jīng)元疾病。包括了遺傳性和獲得性疾病。遺傳性外周神經(jīng)病變的例子有腓骨肌萎縮癥(CMT)。涉及運動神經(jīng)元(CNS)神經(jīng)肌肉失調(diào)的例子為脊髓肌肉萎縮(SMA)以及肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)。
腓骨肌萎縮癥包括：脫髓鞘型CMT(AD-CMT1和CMT4型)、軸索型CMT(AD-CMT2和AR-CMT2型)、中間型CMT(DI-CMT型)、X-相關(guān)CMT(D-CMTX和R-CMTX)、CMT“+(plus)”、dHMN(AD-HMN、R-HMN、X-HMN型)。在該名單中，A指“常染色體”，X指“X-相關(guān)”，R指“隱性”，D指“顯性”。
根據(jù)本發(fā)明，所述組合物含有至少一種活性分子，可能是不同的分子。該組合物還可以含有藥學上可接受的惰性載體?？稍O(shè)想將本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的多種賦形劑、穩(wěn)定劑以及其它合適的化合物用于所述組合物中。
由于本發(fā)明組合物通過局限性輸注施用，因此它優(yōu)選為液體形式。確定載體的濃度、所注射的量以及頻率是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)實踐的一部分。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一藥盒，其含有上述的組合物以及任何專門用于局限性注射的任何器件，優(yōu)選的是止血帶體系和/或檢測注射位點施用壓力或注射靜脈或動脈搏動的裝置(如超聲裝置)。該藥盒還可以含有注射器，例如針筒、針頭和/或?qū)Ч堋?/p>
本發(fā)明方法的實踐包括(除非另行定義)，分子生物學(包括重組技術(shù))、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規(guī)技術(shù)，均在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的范圍內(nèi)。這些技術(shù)已在文獻中有詳盡的解釋，例如，“分子克?。簩嶒炇沂謨浴保谒陌?Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Sambrook，2012)；“寡核苷酸的合成”(Oligonucleotide Synthesis，Gait，1984)；“動物細胞的培養(yǎng)”(Culture of Animal Cells，F(xiàn)reshney，2010)；“酶學方法”、“實驗免疫學手冊”(Methods in Enzymology、Handbook of Experimental Immunology，Weir，1997)；“哺乳動物的轉(zhuǎn)基因載體”(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，Miller和Calos，1987)；“精編分子生物學實驗指南”(Short Protocols in Molecular Biology，Ausubel,2002)；“聚合酶鏈反應：原理、應用和糾錯”(Polymerase Chain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting，Babar,2011)、“當代免疫學指南”(Current Protocols in Immunology，Coligan,2002)。這些技術(shù)可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸和多肽，由此可用于完成和實踐本發(fā)明。具體實施例中特別有用的技術(shù)將在下文的章節(jié)中進行描述。
應理解，無論本文在何處提供數(shù)值和范圍，這些數(shù)值和范圍包含的所有數(shù)值和范圍均包含在本發(fā)明的范圍中。此外，落在這些范圍內(nèi)的所有值，以及數(shù)值范圍的上限和下限均可通過本發(fā)明預期獲得。
以下實施例進一步描述了本發(fā)明的各方面。然而，它們并不是對本發(fā)明教導或公開內(nèi)容的限制。
實驗實施例
本發(fā)明參考以下實驗實施例對細節(jié)進行進一步描述。除非另行說明，這些實施例僅用于描述目的而非限制。
如非額外描述，應當相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用先前的描述以及以下實施例，完成并利用本發(fā)明的組合物并實踐所要求的方法。因此以下工作實施例，特別指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，而并非是以任何方法對本發(fā)明公開內(nèi)容進行的限制。
材料和方法：
動物
XLMTM犬如前所述(Beggs等,2010,Proc Natl Acad Sci USA 107(33):14697-702)。如文中所述，將受影響的雄性通過聚合酶鏈反應基因分型進行鑒定。
在犬種制備并施用rAAV8-MTM1
將含有犬肌微蛋白cDNA的重組腺相關(guān)病毒載體在桿狀病毒/Sf9系統(tǒng)中生產(chǎn)，其中，所述犬肌微蛋白cDNA經(jīng)肌間線蛋白啟動子，rAAV2/8-p肌間線蛋白-MTM1犬(命名為rAAV8-MTM1)調(diào)節(jié)。生成兩批次的桿狀病毒，一批表達rep和帽狀結(jié)構(gòu)AAV基因，第二批則承載人肌間線蛋白啟動子(pDesmin)下游犬MTM1 cDNA(XM850116,NCBI)。桿狀病毒雙倍感染了昆蟲Sf9細胞后，產(chǎn)生rAAV-MTM1載體顆粒，并采用AVB親和色譜柱(GE醫(yī)療，AVB高性能瓊脂糖)將其從總細胞內(nèi)純化。如上所述，從DNase-抗性顆粒中測得vg/mL濃度。進行rAAV載體的其它常規(guī)質(zhì)量控制實驗，包括無菌和純度實驗(Yuasa等,2007,Gene Ther 14(17):1249-60)。
肢體局部靜脈輸注
在麻醉的XLMTM犬中，根據(jù)(Petrov等2011,Methods Mol Biol 709:277-86；Arruda等2010,Blood 115(23):4678-88)所述，在止血帶加壓(300torr)下將稀釋于磷酸緩沖鹽水(PBS)的載體rAAV8-MTM1(2.5x1013vg/kg)輸注入隱靜脈遠端。簡而言之，將止血帶置于腹股溝水平并調(diào)整，直至超聲無法測得股(動脈)搏動，從而暫時性阻斷血流進入目標肢體。在收緊止血帶前，在遠端放置可松緊繃帶，從而向近端方向給肢體排血。將載體懸浮于相當于20％后肢總?cè)萘?通過容積排水量測定)的林格氏乳酸溶液中，并通過置于爪部背面外周隱靜脈遠端分支內(nèi)的14號導管施用。止血帶共收緊15分鐘(輸注前10分鐘，輸注期間5分鐘)。一側(cè)后肢輸注載體而對側(cè)后肢不輸注。
犬組織中病毒滴度的定量測定
采用7900HT熱循環(huán)儀(應用生物體系-Applied Biosystem，法國)，從80ng的總DNA中通過Taqman實時PCR定量測定每雙倍體基因組(dg)中載體基因組(vg)的數(shù)量。采用犬β-葡萄糖醛酸酶基因進行標準化。用于載體基因組(MTM1)擴增的引物為：
5′-ATAAGTTTTGGACATAAGTTTGC-3′(正向；SEQ ID NO:1)，
5′-CATTTGCCATACACAATCAA-3′(反向；SEQ ID NO:2)；和
5′-CGACGCTGACCGGTCTCCT-3′(探針；SEQ ID NO:3)。
用于擴增β-葡萄糖醛酸酶的引物和探針為：
5′-ACGCTGATTGCTCACACCAA-3′(forward；SEQ ID NO:4)，
5′-CCCCAGGTCTGCTTCATAGTTG-3′(reverse；SEQ ID NO:5)；和
5′-CCCGGCCCGTGACCTTTGTGA-3′(probe；SEQ ID NO:6)(應用生物體系)。
結(jié)果：
局部區(qū)域輸注AAV8載體導致周圍神經(jīng)的轉(zhuǎn)導提高
在9周齡的XLMTM犬左后肢的上部放置止血帶，并在加壓下經(jīng)隱靜脈注射rAAV8-Des-cMTM1載體(2.5x1013vg/kg)。
施用載體后一年，將犬進行安樂死，收集大量組織和器官用于載體生物擴散分析。
載體基因組拷貝定量測定顯示：
-輸注的后肢坐骨神經(jīng)有16拷貝；
-對側(cè)非輸注后肢的坐骨神經(jīng)有1.8拷貝。
更普遍的說，這些實驗顯示，所輸注的坐骨神經(jīng)是體內(nèi)轉(zhuǎn)導得最好的組織，其載體DNA(16vg/dg)比對側(cè)神經(jīng)(1.8vg/dg)高了約15倍。
與IV(靜脈內(nèi))注射的比較
在平行實驗中，對2條犬用相同量的rAAV8-Des-cMTM1載體(2.5x1013vg/kg)經(jīng)隱靜脈注射進行系統(tǒng)性施用。在坐骨神經(jīng)中僅檢測到1.8-5的載體拷貝。
該數(shù)據(jù)顯示局部輸注相比于系統(tǒng)性給藥在向外周神經(jīng)系統(tǒng)尤其是坐骨神經(jīng)遞送重組AAV載體中的優(yōu)勢。據(jù)此認為，CNS遞送可以通過PNS經(jīng)由逆向轉(zhuǎn)運而發(fā)生。
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