一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病包括缺血性腦病、出血性腦病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病等，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，提高這類疾病的生存率，降低致殘率，最大限度地提高患者的生活質(zhì)量，是防治此類疾病的首要任務(wù)。由于神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使得神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的治療有了新的研宄方向，神經(jīng)干細(xì)胞也成為了生物醫(yī)學(xué)工程以及體外模型研宄中所必須的種子細(xì)胞。
[0003]神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)是具有分化為神經(jīng)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新，并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞群，是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞，包括神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。1992年神經(jīng)干細(xì)胞自成年動(dòng)物腦紋狀體內(nèi)第一次被發(fā)現(xiàn)，從而打破了認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞不能再生的傳統(tǒng)理論。根據(jù)分化潛能及產(chǎn)生子細(xì)胞種類神經(jīng)干細(xì)胞可分為如下幾類:
[0004](I)神經(jīng)管上皮細(xì)胞:分裂能力最強(qiáng)，只存在胚胎時(shí)期，可以產(chǎn)生放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)母細(xì)胞。
[0005](2)放射狀膠質(zhì)神經(jīng)元:可以分裂產(chǎn)生本身并同時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或是膠質(zhì)細(xì)胞，主要作用是幼年時(shí)期神經(jīng)發(fā)育過程中產(chǎn)生投射神經(jīng)元完成大腦中皮質(zhì)及神經(jīng)核等的基本神經(jīng)組織細(xì)胞。
[0006](2)神經(jīng)母細(xì)胞:成年人體中主要存在的神經(jīng)干細(xì)胞，分裂能力可以產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元和各類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
[0007](4)神經(jīng)前體細(xì)胞:各類神經(jīng)細(xì)胞的前體細(xì)胞，比如小膠質(zhì)細(xì)胞是由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體產(chǎn)生的。
[0008]神經(jīng)干細(xì)胞作為生物醫(yī)學(xué)工程以及體外模型研宄中的種子細(xì)胞，需要將其在體外進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，而如何在體外大規(guī)模培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞便成為了醫(yī)學(xué)研宄的重點(diǎn)。現(xiàn)有的培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的常用培養(yǎng)基為GIBCO的含1% B27的Neurobasal培養(yǎng)基，使用明膠預(yù)處理過的培養(yǎng)瓶進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。但經(jīng)過該培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力較弱。因此急需提供一種可增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的培養(yǎng)基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法。該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠大大增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)能夠使得神經(jīng)干細(xì)胞在不用明膠預(yù)鋪板的情況下貼壁生長，免除了繁瑣的操作步驟簡化了生產(chǎn)流程。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0011]本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素、氫化可的松、WNT3a、Notchl和牛血清白蛋白。
[0012]作為優(yōu)選，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有10?20 ymol/mL非必需氨基酸、10?20ng/mL表皮生長因子、5?15ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10?20 μ g/mL胰島素、40?60nmol/L 氛化可的松、10 ?20nmol/L WNT3a、40 ?60nmol/L Notchl、40 ?60 μ g/mL 牛血清白蛋白。
[0013]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有ΙΟμπιοΙ/mL非必需氨基酸、15ng/mL表皮生長因子、15ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10 μ g/mL胰島素、50nmol/L 氛化可的松、20nmol/L WNT3a、40nmol/L Notchl、50 μ g/mL 牛血清白蛋白。
[0014]在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有15ymol/mL非必需氨基酸、20ng/mL表皮生長因子、5ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、15 μ g/mL胰島素、60nmol/L 氛化可的松、10nmol/L WNT3a、50nmol/L Notchl、60 μ g/mL 牛血清白蛋白。
[0015]在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有20ymol/mL非必需氨基酸、10ng/mL表皮生長因子、10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、20 μ g/mL胰島素、40nmol/L 氛化可的松、15nmol/L WNT3a、60nmol/L Notchl、40 μ g/mL 牛血清白蛋白。
[0016]作為優(yōu)選，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基還包括纖連蛋白和四型膠原蛋白。
[0017]作為優(yōu)選，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有10?20 ymol/mL非必需氨基酸、10?20ng/mL表皮生長因子、5?15ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10?20 μ g/mL胰島素、40?60nmol/L 氛化可的松、10 ?20nmol/L WNT3a、40 ?60nmol/L Notchl、40 ?60 μ g/mL 牛血清白蛋白、15?35ng/mL纖連蛋白、50?70ng/mL四型膠原蛋白。
[0018]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有10 ymol/mL非必需氨基酸、15ng/mL表皮生長因子、15ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10 μ g/mL胰島素、50nmol/L 氛化可的松、20nmol/L WNT3a、40nmol/L Notchl、50 μ g/mL 牛血清白蛋白、35ng/mL纖連蛋白、50ng/mL四型膠原蛋白。
[0019]在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有15 ymol/mL非必需氨基酸、20ng/mL表皮生長因子、5ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、15 μ g/mL胰島素、60nmol/L 氛化可的松、10nmol/L WNT3a、50nmol/L Notch 1、60 μ g/mL 牛血清白蛋白、15ng/mL纖連蛋白、60ng/mL四型膠原蛋白。
[0020]在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有20 ymol/mL非必需氨基酸、10ng/mL表皮生長因子、10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、20 μ g/mL胰島素、40nmol/L 氛化可的松、15nmol/L WNT3a、60nmol/L Notch 1、40 μ g/mL 牛血清白蛋白、25ng/mL纖連蛋白、70ng/mL四型膠原蛋白。
[0021]作為優(yōu)選，非必需氨基酸為谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸或酪氨酸中的一種或兩者以上的混合物。
[0022]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，非必需氨基酸購買于Gibco公司。
[0023]本發(fā)明還提供了一種貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，采用本發(fā)明提供的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞；
[0024]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，培養(yǎng)的條件為5% CO2,370C ο
[0025]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，培養(yǎng)的細(xì)胞密度為5 X 14?lX105/mL。
[0026]本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法。該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基包括DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素、氫化可的松、WNT3a、Notchl和牛血清白蛋白。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一:
[0027]本發(fā)明提供的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠大大增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力。流式檢測結(jié)果顯示，本發(fā)明培養(yǎng)基能夠使P6代的神經(jīng)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物Nestin+CD133+的比例能夠達(dá)到33.3%，而傳統(tǒng)培養(yǎng)基在P6代的Nestin+CD133+的比例僅為9.8%;本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在3?6天時(shí)具有明顯的對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖較快，而采用傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的生長曲線顯示細(xì)胞生長緩慢，無明顯對數(shù)增殖；
[0028]本發(fā)明培養(yǎng)基添加纖連蛋白和四型膠原蛋白，能夠使得神經(jīng)干細(xì)胞在不用明膠預(yù)鋪板的情況下貼壁生長，免除了繁瑣的操作步驟簡化了生產(chǎn)流程。
【附圖說明】
[0029]圖1示試驗(yàn)組I培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在P6代的標(biāo)志物Nestin+、⑶133+的流式檢測結(jié)果；
[0030]圖2示試驗(yàn)組2培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在P6代的標(biāo)志物Nestin+、⑶133+的流式檢測結(jié)果；
[0031]圖3示試驗(yàn)組3培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在P6代的標(biāo)志物Nestin+、⑶133+的流式檢測結(jié)果；
[0032]圖4示試驗(yàn)組I培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞生長曲線；
[0033]圖5示試驗(yàn)組2培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞生長曲線；
[0034]圖6示試驗(yàn)組3培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞生長曲線；
[0035]圖7示對比例I中傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在P6代的標(biāo)志物Nestin+、⑶133+的流式檢測結(jié)果；
[0036]圖8示對比例I中傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞生長曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明公開了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0038]本發(fā)明提供的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法中所用試劑、儀器、試驗(yàn)動(dòng)物等均可由市場購得。其中，WNT3a購自上海華雅思創(chuàng)，Notchl購自武漢福來生物；非必需氨基酸購自 Gibco，貨號(hào)為 11140，MEM Non-Essentia Amino Acids Solut1n1mM(10X) ο
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明:
[0040]實(shí)施例1培養(yǎng)基的制備
[0041]培養(yǎng)液配方成分為:DMEM/F12、10 ymol/mL非必需氨基酸、15ng/mL表皮生長因子、15ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子