實(shí)體瘤患者自體nk細(xì)胞分離、活化擴(kuò)增及活性檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明技術(shù)主要涉及一種實(shí)體瘤患者自體外周血來(lái)源NK細(xì)胞體外分離培養(yǎng)、活 化擴(kuò)增和細(xì)胞毒活性檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK)又稱天然殺傷細(xì)胞，其抗病毒感染、抗 腫瘤無(wú) MHC限制性，已作為臨床細(xì)胞免疫治療腫瘤的一個(gè)重要治療手段。NK細(xì)胞作為機(jī)體 天然免疫細(xì)胞，主要通過(guò)直接殺傷腫瘤細(xì)胞和分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞兩種途徑殺 死腫瘤細(xì)胞、病毒和清除非己細(xì)胞。Rosenberg等在應(yīng)用IL-2活化的LAK細(xì)胞治療腫瘤過(guò) 程中發(fā)現(xiàn)：其中以⑶3-0)16+細(xì)胞（natural killer cell，NK)為特征的細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤 的主要作用，NK細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞。從此，研宄者們將腫瘤免疫細(xì)胞治療的研宄重點(diǎn) 從LAK細(xì)胞轉(zhuǎn)向NK細(xì)胞，將NK細(xì)胞作為腫瘤免疫治療的一種重要手段。到目前為止，NK細(xì) 胞治療腫瘤已經(jīng)取得了很好的臨床效果，尤其是在血液腫瘤方面。同種異體NK細(xì)胞在殺傷 血液病細(xì)胞的同時(shí)，可以促進(jìn)造血干細(xì)胞植入、降低GVHD的發(fā)生以及增強(qiáng)移植物抗白血病 (GVL)效應(yīng)。同種異體NK細(xì)胞已成為臨床移植輔助治療的一種重要手段。
[0003] NK細(xì)胞治療過(guò)程主要包括三個(gè)步驟：采集分離、純化、活化擴(kuò)增。目前治療血液腫 瘤所用到的NK細(xì)胞主要通過(guò)磁珠分選的方法，這種方法不適合自體NK細(xì)胞治療實(shí)體瘤。主 要原因是：①治療血液腫瘤一般選擇健康的供者，可以提取到大量的細(xì)胞，不需要體外長(zhǎng)時(shí) 間的培養(yǎng)擴(kuò)增就已經(jīng)能夠達(dá)到治療所需要的數(shù)量，可以直接將提取出的高純度NK細(xì)胞經(jīng) 過(guò)檢測(cè)后靜脈回輸給患者，采集患者自體外周血中的NK細(xì)胞比例低，并且受到自身腫瘤細(xì) 胞的免疫耐受，分離以后需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的刺激、培養(yǎng)、擴(kuò)增的過(guò)程，達(dá)到一定數(shù)量和比例 才能給患者回輸；②由于在磁珠分選的過(guò)程中細(xì)胞的活性受到影響，不適合在體外長(zhǎng)時(shí)間 的培養(yǎng)。密度梯度離心法是利用細(xì)胞的物理特性一一血液中各種細(xì)胞的密度不同分離所需 要的細(xì)胞的方法，由于是物理的方法，對(duì)細(xì)胞的損傷比較小，不影響細(xì)胞活性。密度梯度離 心法分離過(guò)程中的試劑目前已經(jīng)由臨床級(jí)別的，這種方法分離外周血中NK細(xì)胞是一種適 合實(shí)體瘤患者自體NK細(xì)胞治療的經(jīng)濟(jì)實(shí)用方法。
[0004] NK細(xì)胞純化的方法主要包括物理方法和化學(xué)方法。物理方法有！Percoll不連續(xù) 密度梯度離心法、兩步黏附法；化學(xué)方法有：去除單核細(xì)胞、綿羊紅細(xì)胞花環(huán)法、磁珠分選 法、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒法。活化和擴(kuò)增過(guò)程主要是加入的不同刺激因子，通過(guò)這些刺激因子 促進(jìn)NK細(xì)胞的快速增殖，而降低非NK細(xì)胞增殖速度。主要刺激因子有：絲裂原、細(xì)胞因子、 飼養(yǎng)細(xì)胞等。
[0005] Grzywacz等從臍帶血提取造血干細(xì)胞，然后經(jīng)過(guò)分化和誘導(dǎo)擴(kuò)增得到大量NK細(xì) 胞，雖然臍帶血的來(lái)源比較豐富，但存在倫理問(wèn)題。Berg等使用IOOGy照射后的EB病毒轉(zhuǎn) 化的B淋巴母樣細(xì)胞（EBV-LCL)作為飼養(yǎng)細(xì)胞，與PBMC中分選的NK細(xì)胞共培養(yǎng)培養(yǎng)21d 后，可使NK細(xì)胞擴(kuò)增（490±260)倍。Imai等使用照射過(guò)的K562-mbl5-41BBL細(xì)胞株作為 飼養(yǎng)細(xì)胞，3周后可使PBMCs中⑶3-⑶56+NK細(xì)胞擴(kuò)增1000多倍。飼養(yǎng)細(xì)胞可提高NK細(xì)胞 擴(kuò)增效率、純度與殺傷活性均較高，但存在安全性問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已較少 使用飼養(yǎng)細(xì)胞，更側(cè)重于細(xì)胞因子的組合體外活化和擴(kuò)增NK細(xì)胞。臨床級(jí)磁珠分選儀隨著 干細(xì)胞的研宄已經(jīng)逐步進(jìn)入了臨床，其設(shè)備及其附屬耗材價(jià)格昂貴。自體NK細(xì)胞首先經(jīng)過(guò) 臨床級(jí)磁珠分選儀純化后，需要擴(kuò)增和增殖，這將增加治療成本，臨床病人難以接受。目前 臨床級(jí)磁珠分選儀在我國(guó)還沒(méi)有得到相關(guān)部門(mén)的認(rèn)證用于臨床。
[0006] 已知許多細(xì)胞因子單獨(dú)或組合能有效地誘導(dǎo)、刺激NK細(xì)胞增殖和促進(jìn)其分化成 熟，如 IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、Flt-3L、SCF 等，其中 IL-2 和 IL-15 的作用尤為 明顯。IL-2是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要由⑶4+T、⑶8+T細(xì)胞以及NK，LAK 細(xì)胞產(chǎn)生，在免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。IL-2能刺激NK細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷功 能，是體外NK細(xì)胞擴(kuò)增體系中最早也是最常用的細(xì)胞因子。
[0007] 目前，國(guó)內(nèi)外很多文獻(xiàn)和專利關(guān)于NK細(xì)胞分離提取和活化擴(kuò)增的方法，但是存在 一些缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用到臨床上的并不多。①細(xì)胞數(shù)量：臨床治療需要的NK細(xì)胞數(shù)量大，而采 集50ml患者自體外周血中NK細(xì)胞的含量比較少；②細(xì)胞純度：需要NK細(xì)胞純度高，而外 周血中NK細(xì)胞約占淋巴細(xì)胞的5%~10% ;③細(xì)胞來(lái)源：目前治療實(shí)體瘤NK細(xì)胞的主要來(lái) 源是有患者本人的外周血，治療血液病的NK細(xì)胞可以來(lái)源于健康志愿者（患者的父母子女 或兄弟姐妹)。同種異體NK細(xì)胞治療實(shí)體瘤還處于臨床試驗(yàn)階段；④添加因子：在培養(yǎng)的 過(guò)程中，不能加入動(dòng)物源性和其它在細(xì)胞回輸后對(duì)人體產(chǎn)生負(fù)作用的添加劑；⑤操作過(guò)程： 繁瑣的操作步驟將增加污染的幾率；⑥體外培養(yǎng)時(shí)間：免疫細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)或短 決定了回輸?shù)襟w內(nèi)免疫細(xì)胞的活性。如果培養(yǎng)時(shí)間太短，細(xì)胞還沒(méi)有擴(kuò)增到一定數(shù)量，如果 時(shí)間太長(zhǎng)，細(xì)胞量雖然較多，但細(xì)胞表現(xiàn)為復(fù)制性衰老（replicative senescence)，絕大多 數(shù)細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始凋亡，不論是從細(xì)胞總數(shù)和活性還是從細(xì)胞比例都會(huì)有下降的趨勢(shì)，而且 將這種狀態(tài)的細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)后，絕大多數(shù)細(xì)胞會(huì)死亡，這提示我們必須選擇合適的培養(yǎng) 時(shí)間；⑦成本：如果培養(yǎng)過(guò)程中使用一些非常昂貴的試劑或儀器設(shè)備，超出了一般患者所 能夠承受的經(jīng)濟(jì)范圍。NK細(xì)胞的體外分離和高效擴(kuò)增方案成為NK細(xì)胞臨床治療中需要迫 切解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。
[0008] 按照我國(guó)相關(guān)規(guī)定，在過(guò)繼免疫細(xì)胞臨床應(yīng)用前和應(yīng)用過(guò)程中，應(yīng)檢測(cè)免疫細(xì)胞 的細(xì)胞毒作用。有報(bào)道指出，由于兩種細(xì)胞混合在一起培養(yǎng)，互相之間有抑制對(duì)方生長(zhǎng)的細(xì) 胞因子的分泌，在效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，腫瘤細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞也會(huì)有抑制生長(zhǎng)和 促進(jìn)凋亡的作用。目前常用檢測(cè)凋亡的方法MTT法和LDH法只能從整體水平判斷凋亡率， 而不能從單細(xì)胞水平檢測(cè)免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并且這些方法容易受到背景信號(hào)的干 擾，因此其檢測(cè)結(jié)果廣受質(zhì)疑。51Cr釋放實(shí)驗(yàn)一直被認(rèn)為是檢測(cè)NK細(xì)胞活性的標(biāo)準(zhǔn)方法， 但作為放射性核元素，51Cr的應(yīng)用具有一定的限制性。TUNEL法能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典 型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度高，但只能標(biāo)記中晚期凋亡 細(xì)胞，并受效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞自發(fā)死亡和非特異性殺傷的存在會(huì)造成很強(qiáng)的背景信號(hào)的影 響，而且方法操作繁瑣。Annexin-V/PI流式細(xì)胞分析法是目前研宄免疫細(xì)胞細(xì)胞毒作用最 常用的流式方法，能檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞，與51Cr釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這種方法適用于一種作 用因素(化療藥或其他非細(xì)胞物質(zhì))對(duì)一種靶細(xì)胞的作用研宄。檢測(cè)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的 細(xì)胞毒作用時(shí)，兩種細(xì)胞混合在一起，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞同時(shí)都有凋亡，流式細(xì)胞儀分析時(shí) 無(wú)法區(qū)分效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，結(jié)果中包括靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞共同的凋亡率。如果效應(yīng)細(xì)胞 和靶細(xì)胞的體積相差比較大時(shí)，能通過(guò)FSC/SSC圈門(mén)將兩種細(xì)胞區(qū)分開(kāi)；當(dāng)靶細(xì)胞和效應(yīng) 細(xì)胞體積相當(dāng)時(shí)，在所分析的靶細(xì)胞區(qū)域中混有效應(yīng)細(xì)胞，最終得出的凋亡率將會(huì)受到效 應(yīng)細(xì)胞的影響。
[0009] 熒光染料CFSE是一種可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的新型染料，具有很高的熒光活 性，被激發(fā)后能產(chǎn)生綠色熒光。近年來(lái)，CFSE作為一種安全、無(wú)放射性、無(wú)污染、細(xì)胞毒性小 的細(xì)胞標(biāo)記物，應(yīng)用于淋巴細(xì)胞亞群的增殖、抗原特異性效應(yīng)與記憶淋巴細(xì)胞的體內(nèi)分布 及其活化、增殖、分化，細(xì)胞毒性檢測(cè)等方面。其特點(diǎn)主要包括：①能夠輕易穿透細(xì)胞膜但自 身不發(fā)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后熒光不受內(nèi)環(huán)境影響，對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)沒(méi)有任何影響；②可以隨細(xì) 胞分裂平均到達(dá)兩個(gè)子代細(xì)胞；③標(biāo)記的熒光時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)周；④操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。
[0010] Annexin-V是一種分子量為35-36kD的Ca依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋 亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合。正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是 完整的，在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡 的早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，Annexin-V與磷脂酰絲氨酸有高度 親和力，它通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。放線菌素 D (7-amino-actinomycin D，7-AAD)是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡研宄的染料，其可與凋亡細(xì) 胞漿內(nèi)的DNA結(jié)合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有的實(shí)體瘤患者自體NK細(xì)胞體外分離培養(yǎng)、活化擴(kuò)增和細(xì)胞 毒活性檢測(cè)方法的不足，對(duì)NK細(xì)胞采集分離、活化擴(kuò)增和細(xì)胞毒活性檢測(cè)等步驟進(jìn)行改進(jìn) 和優(yōu)化。
[0012] 由于實(shí)體瘤患者自身免疫細(xì)胞的功能被破壞或抑制，體外經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)獲得的NK 細(xì)胞比例低、數(shù)量少，并且培養(yǎng)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，培養(yǎng)所需試劑等刺激因子成本高和存在不安全 因素等缺點(diǎn)。本發(fā)明在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)改進(jìn)和優(yōu)化，總結(jié)出一種分離培養(yǎng)操作步驟簡(jiǎn) 單，經(jīng)濟(jì)高效的方法，不僅避免了由于操作繁瑣而發(fā)生污染，而且在培養(yǎng)過(guò)程中所需要的試 劑和耗材成本低，使用該方法培養(yǎng)出的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)多、純度高和活性好，此技術(shù)方法 適合應(yīng)用于臨床過(guò)繼免疫細(xì)胞治療腫瘤。
[0013] 同時(shí)建立一種了基于流式細(xì)胞染色檢測(cè)技術(shù)，三種熒光染料CFSE/ Annexin-V/7-AAD聯(lián)合標(biāo)記，分析NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。該方法避免放射性試劑，減少了 同位素的污染，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果重復(fù)性好，敏感