性和特異性高。根據(jù)研宄的不同要求和目的， CFSE可分別標(biāo)記靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，分析靶細(xì)胞對效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和分析效應(yīng)細(xì)胞 對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
[0014] 本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 一種實體瘤患者自體NK細(xì)胞分離、活化擴增方法，包括如下步驟： (1)、NK細(xì)胞的采集分離： 1. 1、外周血采集：采集實體腫瘤患者外周血40~60ml。
[0015] 1.2、NK 細(xì)胞分離： I. 2a、將采集的外周血裝入離心管中，離心條件：離心力500g，離心時間lOmin。吸出血 漿裝入另一只離心管中于56°C水浴鍋中滅活30min后離心，離心條件：離心力850g，離心時 間lOmin。離心后取上清裝入離心管中放入4°C冰箱中備用。
[0016] I. 2b、將沉淀的紅細(xì)胞層與生理鹽水按照1:1混合，緩慢加入裝有分離液的離心 管中，在移動或裝入離心機時動作要輕柔，防止血細(xì)胞層與分離液層混合，離心條件：離心 力700g，離心時間15min，離心溫度20~25°C。將上述分離后的白膜層移至另一離心管中，再 加入同等量生理鹽水，洗滌兩次，第一次洗滌時離心條件：離心力750g，離心時間5min ;第 二次洗絳時離心條件：離心力500g，離心時間5min。
[0017] (2)、NK細(xì)胞活化擴增： 2. 1、?、?6mAb (克隆號：3G8)加入裝有PBS的培養(yǎng)瓶中，使抗體終濃度為1-lOug/mL (最佳濃度為lug/mL)，將培養(yǎng)瓶放于4°C冰箱中，包被抗體至少三天以上，用PBS洗兩遍備 用。
[0018] 2. 2、將步驟（1)分離獲得的細(xì)胞洗滌后計數(shù)，加入新鮮培養(yǎng)液，該新鮮培養(yǎng)液為臨 床級無血清培養(yǎng)基，所述臨床級無血清培養(yǎng)基含IL-2和10%自體血漿，加入培養(yǎng)新鮮培養(yǎng) 液的體積根據(jù)細(xì)胞濃度而定，細(xì)胞濃度為lXl〇6/mL~2X106/mL ;轉(zhuǎn)入已包被抗體的培養(yǎng)瓶 中并加入IFN-γ ; IFN-γ濃度為100~1000U/mL，最適濃度為1000U/mL，IL-2濃度為1000U/ mL~2000U/mL，最適濃度為 2000U/mL。
[0019] 2. 3、NK細(xì)胞培養(yǎng)擴增 2. 3a、培養(yǎng)第3天觀察細(xì)胞狀態(tài)，加入等倍體積新鮮培養(yǎng)液，該新鮮培養(yǎng)液為臨床級無 血清培養(yǎng)基，所述臨床級無血清培養(yǎng)基含IL-2和10%自體血清，新鮮培養(yǎng)液中IL-2的濃度 為 1000U/mL~2000U/mL，最適濃度為 2000U/mL。
[0020] 2. 3b、第5天觀察細(xì)胞狀態(tài)，加入2倍體積新鮮培養(yǎng)液，該新鮮培養(yǎng)液為含IL-2 的臨床級無血清培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)液中IL-2的濃度為1000U/mL~2000U/mL，最適濃度為 2000U/mL〇
[0021] 2. 3c、之后，隔天加入等倍體積的新鮮培養(yǎng)液，該新鮮培養(yǎng)液為含IL-2的臨床級 無血清培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)液中IL-2的濃度為1000U/mL~2000U/mL，最適濃度為2000U/mL。
[0022] 培養(yǎng)至第17或18天，獲得處于對數(shù)生長期的NK細(xì)胞。
[0023] 在實體瘤患者自體NK細(xì)胞分離、活化擴增的基礎(chǔ)上，進行細(xì)胞殺傷活性檢測 方法使用三種熒光染料，分別是CFSE、PE-Annexin-V、7-AAD，CFSE用于標(biāo)記靶細(xì)胞， PE-Annexin-V用于檢測早期凋亡細(xì)胞，7-AAD用于檢測中晚期凋亡細(xì)胞。
[0024] (3)、NK細(xì)胞殺傷活性檢測： 3. UCFSE標(biāo)記靶細(xì)胞： 收集生長狀況良好的腫瘤細(xì)胞，加入PBS緩沖液，離心條件為離心力300g，室溫離心 5min。洗滌2次，臺盼藍(lán)計數(shù)并用PBS緩沖液重懸細(xì)胞； 將預(yù)溫好的CFSE-PBS液加入細(xì)胞團中，其中CFSE終濃度為2umol/L ;37 °C放置 5~IOmin ; 加入含10%已滅活胎牛血清（FBS)的1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)； 離心細(xì)胞，加入含10% FBS的1640培養(yǎng)基，37°C放置lOmin，PBS洗滌2次，最后用含 10% FBS的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
[0025] 3. 2、收集效應(yīng)細(xì)胞及制備效靶比梯度： 收集步驟（2)中對數(shù)期生長的效應(yīng)細(xì)胞，加入PBS緩沖液，離心條件為離心力300g，室 溫離心5min。洗滌2次，臺盼藍(lán)計數(shù)并用含10% FBS的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
[0026] 3. 3、效靶細(xì)胞共培養(yǎng)： 將處理好的效應(yīng)細(xì)胞與標(biāo)記好的靶細(xì)胞按效靶比10:1~50:1，加入24孔無菌細(xì)胞培養(yǎng) 板中； 并設(shè)只加靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞作為對照孔，用于檢測靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的自發(fā)死亡率； 用含10% FBS的1640培養(yǎng)基補齊每孔體積； 將細(xì)胞培養(yǎng)板輕輕混勻，離心條件為離心力300g室溫離心3min，以使效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì) 胞緊密接觸； 5% C02、37°C培養(yǎng)箱孵育4h。
[0027] 3. 4、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞殺傷率： 將細(xì)胞收集于流式管中，臺盼藍(lán)計數(shù)，加入PBS緩沖液，離心條件為離心力300g，室溫 離心5min ; 加入PBS緩沖液和PE-Annectin-V，避光孵育IOmin ; 加入PBS緩沖液，離心條件為離心力300g，室溫離心5min ; 離心后加入PBS緩沖液和7-AAD，4h之內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測；同時設(shè)定陰性對照管：未標(biāo) 記CFSE管、不加抗體管、只加 PE-Annectin-V管、只加7-AAD管； 所有標(biāo)本使用FACSCalibur儀檢測，用CellQuest獲取和分析數(shù)據(jù)。
[0028] 計算公式：殺傷細(xì)胞毒性（％)=(靶細(xì)胞死亡率-靶細(xì)胞自發(fā)死亡率）/ (100-靶 細(xì)胞自發(fā)死亡率）X 100%。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有的優(yōu)點如下： 1、本發(fā)明方法只需要采集實體腫瘤患者外周血40~60ml，經(jīng)過體外一系列刺激因子的 活化和擴增培養(yǎng)后，NK細(xì)胞的純度及數(shù)量能夠達(dá)到臨床治療的水平，無需特殊的儀器設(shè)備， 也不需要特殊的處理過程，操作簡便，降低了操作過程中污染發(fā)生的機率。培養(yǎng)過程中采用 一次性耗材、無血清培養(yǎng)基和臨床級藥品重組人IL-2和重組人IFN- γ，增加了 NK細(xì)胞臨床 應(yīng)用過程中的安全性。
[0030] 2、本發(fā)明方法是研宄小組將不同刺激因子和其組合對NK細(xì)胞體外擴增效果進行 大量篩選而總結(jié)出的最佳方案。若在培養(yǎng)過程中增加一種細(xì)胞因子就會增加一部分不可控 因素，若缺乏某種細(xì)胞因子，有可能細(xì)胞的數(shù)量和純度達(dá)不到要求，因此目前本發(fā)明方法的 刺激因子組合及其所用劑量為最佳組合和最佳刺激劑量。
[0031] 3、流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研宄，其可檢測到單細(xì)胞水平，因此較其 他檢測方法更為準(zhǔn)確。本發(fā)明方法中NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性的檢測方法是將流式細(xì)胞儀檢測 技術(shù)基礎(chǔ)上，聯(lián)合CFSE、Annexin-V與7-AAD三種熒光染料，根據(jù)熒光染料的特性和細(xì)胞凋 亡過程的細(xì)胞膜和細(xì)胞核的變化特點的檢測技術(shù)，采用PE-Annectin-V和7-AAD聯(lián)合染色， PE-Annectin-V會結(jié)合發(fā)生早期凋亡細(xì)胞的膜磷脂酰絲氨酸，7-AAD與核酸結(jié)合；此技術(shù)方 法不僅能從混合細(xì)胞中特異性地區(qū)分靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，而且能檢測到早期凋亡靶細(xì)胞， 即CFSE+Annexin-VI-AAT單陽性細(xì)胞為活性正常靶細(xì)胞，CFSE +Annexin-V+7-AAD^X陽性 細(xì)胞為凋亡早期靶細(xì)胞，CFSE+Annexin-V+7-AAD+三陽性細(xì)胞為凋亡晚期或已經(jīng)死亡有完整 細(xì)胞結(jié)構(gòu)的靶細(xì)胞；由于流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的優(yōu)勢，當(dāng)靶細(xì)胞數(shù)目少，其他方法無法檢測 時，亦可采用此方法進行檢測；本發(fā)明方法中采用存活的靶細(xì)胞的比較和計算(詳見計算公 式)，扣除了在細(xì)胞培養(yǎng)期間發(fā)生自然凋亡的靶細(xì)胞的信號干擾。
[0032] 本發(fā)明設(shè)計合理，在實驗過程中不斷改變思路和改進方法，經(jīng)過不斷試驗和驗證， 利用本發(fā)明方法能夠從實體瘤患者自體外周血中分離獲得高活性的淋巴細(xì)胞群，然后體外 經(jīng)過一系列細(xì)胞因子的刺激，NK細(xì)胞（CD3_CD56+)得到活化和大量擴增，達(dá)到了臨床治療腫 瘤水平。
[0033] -種基于流式細(xì)胞術(shù)的免疫細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用檢測方法--CFSE/ Annexin-V/7-AAD三聯(lián)染色法。NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性檢測方法不僅能在免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì) 胞的混合細(xì)胞群中特異性地分析效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并且能分析早期凋亡和 晚期凋亡靶細(xì)胞，避免了效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的自然凋亡與效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合培養(yǎng)過程 中靶細(xì)胞作用于效應(yīng)細(xì)胞而導(dǎo)致的效應(yīng)細(xì)胞死亡對檢測結(jié)果的干擾。其方法簡便易行、靈 敏度高，可以在單個細(xì)胞水平檢測細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，在過繼免疫細(xì)胞治療腫瘤的臨床應(yīng) 用前基礎(chǔ)研宄和臨床應(yīng)用中質(zhì)控方面具有重要意義。
【附圖說明】
[0034] 圖1表示隨著培養(yǎng)天數(shù)變化兩組細(xì)胞中NK細(xì)胞（⑶3TD56+)比例變化趨勢圖。
[0035] 圖2表示隨著培養(yǎng)天數(shù)的變化兩組細(xì)胞總數(shù)趨勢圖。
[0036] 圖3表示培養(yǎng)不同天數(shù)檢測兩組細(xì)胞中NK細(xì)胞（⑶3TD56+)的流式圖。
[0037] 圖4a表示E組中外周血NK細(xì)胞IFN- γ分泌功能流式細(xì)胞圖。
[0038] 圖4b表示E組中培養(yǎng)17天NK細(xì)胞IFN- γ分泌功能流式細(xì)胞圖。
[0039] 圖5a表示CFSE/Annexin-v/7-AAD組合染色分析E組細(xì)胞與Κ562細(xì)胞效靶比為 10:1、20:1、40:1時的殺傷結(jié)果。
[0040] 圖5b表示CFSE/Annexin-v/7-AAD組合染色分析C組細(xì)胞與K562細(xì)胞效靶比為 10:1、20:1、40:1時的殺傷結(jié)果。
[0041] 圖5c表示CFSE/Annexin-v/7-AAD組合染色分析單純效應(yīng)細(xì)胞自然凋亡結(jié)果。