為離心力300g，室溫 離心5min。加入IOOul PBS緩沖液和5ul PE-Annectin-V，避光孵育lOmin。加入PBS緩沖 液，離心條件為離心力300g，室溫離心5min。
[0074] 離心后加入IOOul PBS緩沖液和5ul 7-AAD，4h之內流式細胞儀檢測；同時設定陰 性對照管：未標記CFSE管、不加抗體管、只加 PE-Annectin-V管、只加7-AAD管。
[0075] 所有標本使用FACSCalibur儀檢測，用CellQuest獲取和分析數據。檢測過程大致 如下：FLl熒光通道檢測CFSE的熒光強度，F(xiàn)L2熒光通道檢測PE-Annectin-V的熒光強度， FL3熒光通道檢測7-AAD的熒光強度；通過陰性對照管調節(jié)電壓和補償，設立雙陰性區(qū)；檢 測實驗組先以FCS/SSC在扣除細胞碎片的前提下，圈定所有的效應細胞和靶細胞；以CFSE 陽性標記的靶細胞設門為R1，收集10000個靶細胞；在PE-Annectin-V和7-AAD雙標記的 散點圖中，進一步分析Rl門中的靶細胞，采用CFSE、PE-Annectin-V和7-AAD三標記能有效 分離各組細胞群。分析時，首先利用CFSE染色將效應細胞和靶細胞區(qū)分開，CFSE+為靶細 胞；在CFSE+細胞群中，PE-Annectin-V和7-AAD雙標記將靶細胞分為Annectin-V飛-AAD' Annectin-V+7-AAD-、Annectin_V+7-AAD +3 個組群，其中 CFSE+Annectin-VT-AAD-為正常的革巴 細胞，CFSE+Annectin-V+7-AAD_S早期凋亡的靶細胞，CFSE +Annectin-V+7-AAD+為中晚期凋 亡的靶細胞； 計算公式：殺傷細胞毒性（％)=(靶細胞死亡率-靶細胞自發(fā)死亡率）/ (100-靶細胞 自發(fā)死亡率）X 100%。
[0076] 表4 CFSE/Annexin-v/7-AAD三聯(lián)染色分析兩組細胞對K562細胞的細胞毒作用
如圖5a所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD組合染色分析E組細胞與K562細胞效靶比為 10:1、20:1、40:1時的殺傷結果。
[0077] 如圖5b所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD組合染色分析C組細胞與K562細胞效靶比 為10:1、20:1、40:1時的殺傷結果。
[0078] 如圖5c所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD組合染色分析單純效應細胞自然凋亡結果。
[0079] 如圖5d所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD組合染色分析E組細胞與K562細胞效靶比 為10:1時的殺傷結果，此組靶細胞未經過CFSE染色。
[0080] 如圖5e所示，CFSE/Annexin-v/7-AAD組合染色分析單純靶細胞自然凋亡結果。
[0081] 圖5a至圖5e，散點圖中橫坐標"FL1-H"為CFSE染色，橫坐標"2"為Annexin-v-PE 染色，縱坐標" 3 "為7-AAD染色。
[0082] 最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參 照本發(fā)明實施例進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，對本發(fā)明的技術方案 進行修改或者等同替換，都不脫離本發(fā)明的技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋本發(fā)明的 權利要求保護范圍中。
【主權項】
1. 一種實體瘤患者自體NK細胞分離、活化擴增方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 、NK細胞的采集分離： 1. 1、外周血采集：來源實體腫瘤患者自體外周血40~60ml; 1. 2、NK細胞分離： I. 2a、將采集的外周血裝入離心管中，離心條件：離心力500g，離心時間IOmin;吸出血 漿裝入另一只離心管，于56°C水浴鍋中滅活30min后離心，離心條件：離心力850g，離心時 間IOmin;離心后取上清裝入離心管中放入4°C冰箱中備用； 1. 2b、將沉淀的紅細胞層與生理鹽水按照1:1混合，緩慢加入裝有分離液的離心管中， 在移動或裝入離心機時防止血細胞層與分離液層混合，離心條件：離心力700g，離心時間 15min，離心溫度20~25°C;將上述分離后的白膜層移至另一離心管，再加入同等量生理鹽 水，洗滌兩次，第一次洗滌時離心條件：離心力750g，離心時間5min;第二次洗滌時離心條 件：離心力500g、離心時間5min; (2) 、NK細胞活化擴增： 2. 1、?、?6mAb加入裝有PBS的培養(yǎng)瓶中，使抗體終濃度為l~10ug/mL，將培養(yǎng)瓶放于 4°C冰箱中，包被抗體至少三天以上，用PBS洗兩遍備用； 2. 2、將步驟（1)分離獲得的細胞洗滌后計數，加入新鮮培養(yǎng)液，該新鮮培養(yǎng)液為臨床 級無血清培養(yǎng)基，所述臨床級無血清培養(yǎng)基含IL-2和10%自體血漿，細胞濃度為IXIO6/ mL~2XIOfVmL;轉入已包被抗體的培養(yǎng)瓶中并加入IFN-y;IFN-y濃度為100~1000U/mL， IL-2 濃度為 1000~2000U/mL; 2. 3、NK細胞培養(yǎng)擴增 2. 3a、培養(yǎng)第3天觀察細胞狀態(tài)，加入等倍體積新鮮培養(yǎng)液，該新鮮培養(yǎng)液為臨床級無 血清培養(yǎng)基，所述臨床級無血清培養(yǎng)基含IL-2和10%自體血清，新鮮培養(yǎng)液中IL-2的濃度 為 1000U/mL~2000U/mL; 2. 3b、第5天觀察細胞狀態(tài)，加入2倍體積新鮮培養(yǎng)液，該新鮮培養(yǎng)液為含IL-2的臨床 級無血清培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)液中IL-2的濃度為1000U/mL~2000U/mL; 2. 3c、之后，隔天加入等倍體積的新鮮培養(yǎng)液，該新鮮培養(yǎng)液為含IL-2的臨床級無血 清培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)液中IL-2的濃度為1000U/mL~2000U/mL; 培養(yǎng)至第17或18天，獲得處于對數生長期的NK細胞。2. 根據權利要求1所述的實體瘤患者自體NK細胞分離、活化擴增方法，其特征在于： 所述IL-2選擇rhIL-2 ;所述IFN-y選擇rhIFN-y。3. 根據權利要求1或2所述的實體瘤患者自體NK細胞分離、活化擴增方法，其特征在 于：步驟2. 1中，單克隆抗體⑶16終濃度為lug/mL。4. 根據權利要求3所述的實體瘤患者自體NK細胞分離、活化擴增方法，其特征在于： 步驟 2. 2 中，IFN-y濃度為 1000U/mL，IL-2 濃度為 2000U/mL。5. -種實體瘤患者自體NK細胞的活性檢測方法，其特征在于：包括如下步驟： (1 )、NK細胞的采集分離：如權利要求1所述的步驟（1); (2) 、NK細胞活化擴增：如權利要求1所述的步驟（2); (3) 、NK細胞殺傷活性檢測： 3.UCFSE標記靶細胞： 收集生長狀況良好的腫瘤細胞，加入PBS緩沖液，離心條件為離心力300g，室溫離心 5min;洗滌2次，臺盼藍計數并用PBS緩沖液重懸細胞； 將預溫好的CFSE-PBS液加入細胞團中，其中CFSE終濃度為2umol/L;37 °C放置 5~10min； 加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基終止反應； 離心細胞，加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基，37°C放置lOmin，PBS洗滌2次，最后用10%FBS的1640培養(yǎng)基重懸細胞； 3. 2、收集效應細胞及制備效靶比梯度： 收集步驟（2)中對數期生長的效應細胞，加入PBS緩沖液，離心條件為離心力300g，室 溫離心5min;洗滌2次，臺盼藍計數并用含10%FBS的1640培養(yǎng)基重懸細胞； 3. 3、效靶細胞共培養(yǎng)： 將處理好的效應細胞與標記好的靶細胞按效靶比10~50:1，加入24孔無菌細胞培養(yǎng)板 中； 并設只加靶細胞和效應細胞作為對照孔，用于檢測靶細胞和效應細胞的自發(fā)死亡率； 用含10%FBS的1640培養(yǎng)基補齊每孔體積； 將細胞培養(yǎng)板輕輕混勻，離心條件為離心力300g，室溫離心3min，以使效應細胞和靶 細胞緊密接觸； 5%C02、37°C培養(yǎng)箱孵育4h; 3. 4、流式細胞儀分析細胞殺傷率： 將細胞收集于流式管中，臺盼藍計數，加入PBS緩沖液，離心條件為離心力300g，室溫 離心5min; 加入PBS緩沖液和PE-Annectin-V，避光孵育IOmin; 加入PBS緩沖液，離心條件為離心力300g，室溫離心5min; 離心后加入PBS緩沖液和7-AAD，4h之內流式細胞儀檢測；同時設定陰性對照管：未標 記CFSE管、不加抗體管、只加PE-Annectin-V管、只加7-AAD管； 所有標本使用FACSCalibur儀檢測，用CellQuest獲取和分析數據； 計算公式：殺傷細胞毒性（％)=(靶細胞死亡率-靶細胞自發(fā)死亡率）/ (100-靶細胞 自發(fā)死亡率）X100%。
【專利摘要】本發(fā)明技術中的NK細胞分離、培養(yǎng)擴增方法能夠從外周血分離獲得高活性的淋巴細胞群，體外經過一系列細胞因子的刺激，NK細胞（CD3-CD56+）得到純化、活化和大量擴增，達到應用于臨床治療腫瘤的水平。本發(fā)明技術中NK細胞活性檢測方法不僅能在免疫細胞和腫瘤細胞的混合細胞液中特異性地分析效應細胞對靶細胞的殺傷率，避免了效應細胞對檢測結果的干擾，而且能分析早期凋亡和晚期凋亡靶細胞，其方法簡便易行、靈敏度高，可以在單個細胞水平檢測細胞的殺傷功能，在過繼免疫細胞治療腫瘤的臨床應用前基礎研究和臨床應用中質控方面具有重要意義。
【IPC分類】C12Q1/02, C12N5/0783
【公開號】CN104928243
【申請?zhí)枴緾N201510405098
【發(fā)明人】張俊萍, 郭繼強, 韓亞萍, 賈原, 趙晴, 李芳
【申請人】山西大醫(yī)院
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月13日