1.一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲆铮?種禽免疫抑制病原為雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒,其特征在于,所述引物核苷酸序列如下所示:
引物C1:5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ (SEQ ID NO:1),
引物C2:5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ (SEQ ID NO:2);
引物M1:5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ (SEQ ID NO:3),
引物M2:5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ (SEQ ID NO:4);
引物R1:5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ (SEQ ID NO:5),
引物R2:5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ (SEQ ID NO:6);
引物O1:5’-CGTGTAACGGTGCGACTG-3’ (SEQ ID NO:7),
引物O2:5’-CCGCTAGATAAGGCCAAT-3’ (SEQ ID NO:8);
引物B1:5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ (SEQ ID NO:9),
引物B2:5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ (SEQ ID NO:10)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物,其特征在于:
所述引物C1和C2其中一條引物的5’端被生物素化;
所述引物M1和M2其中一條引物的5’端被生物素化;
所述引物R1和R2其中一條引物的5’端被生物素化;
所述引物O1和O2其中一條引物的5’端被生物素化;
所述引物B1和B2其中一條引物的5’端被生物素化。
3.根據(jù)利要求1所述的引物,其特征在于,所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列,所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補(bǔ)配對(duì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的引物,其特征在于,所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2這5組引物對(duì)中連接的tag序列選自SEQ ID NO:11~15所示的tag序列,且該5組引物對(duì)中連接的tag序列互不相同。
5.一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?,所?種禽免疫抑制病原為雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒,其特征在于,該試劑盒中含有權(quán)利要求1~4任一所述引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、5種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒,其特征在于,所述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列,編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。
8.一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒?,所?種禽免疫抑制病原為雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒,其特征在于,包括如下步驟:
1)從樣品中提取病毒核酸;
2)以提取的病毒核酸為模板,用權(quán)利要求1~4任一所述的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增;
3)將上步擴(kuò)增產(chǎn)物、5種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行雜交;
4)雜交結(jié)束后,通過(guò)Luminex系統(tǒng)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析,確定病原的類(lèi)型;
上述方法用于非疾病的診斷和治療。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于:步驟2)中RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:
5×buffer 4μL
dNTP 0.8μL
引物混合液 2μL
酶 0.8μL
模板 1μL
ddH2O 11.4μL
Total 20μL;
步驟2)中RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 30min;94℃ 15min;94℃ 5min;94℃ 30s,60℃ 25s,72℃ 20s;循環(huán)35次;72℃ 10min,4℃ 保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于:步驟3)中所述雜交的反應(yīng)體系和程序?yàn)椋?/p>
5種熒光編碼微球 20μL
鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL
擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL
總體積 100μL;37℃孵育30min。