本發(fā)明涉及植物病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種利用分子標記快速檢測西葫蘆病毒病的方法。

背景技術(shù)：

西葫蘆是世界性大宗蔬菜之一，也是我國主要瓜類蔬菜。每年西葫蘆種植面積約在500萬畝以上，其中山東、山西、云南、西北等地區(qū)為我國重要的西葫蘆優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)。西葫蘆病毒病是一種普遍發(fā)生且危害性很大的病害。侵染西葫蘆的病毒主要有以下3種：黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)、西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)和小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)，而且在田間病毒會經(jīng)常發(fā)生復(fù)合感染。

目前檢測西葫蘆病毒病的方法有雙抗體夾心法(DAS-ELISA)和硝酸纖維素膜法(NCM-ELISA)法、血清抗原檢測等方法；但這些方法操作復(fù)雜、費用高、需要時間較長。

除此之外，現(xiàn)有技術(shù)中也有采用多重RT-PCR對其他作物同時檢測多種病毒感染情況的技術(shù)方案，但是這些方案中所采用的引物一般均為特異性引物，難以多種變種同時檢測，檢測效率低下，同時很多現(xiàn)有技術(shù)中會采用多組特異性引物，以求檢測更多的病毒，但是這樣反而會導(dǎo)致引物之間相互影響，檢測的準確率嚴重下降，可信度也大幅下降，檢測成本反而更高。

為了保證西葫蘆生產(chǎn)的產(chǎn)量和質(zhì)量，準確鑒定西葫蘆病毒病，西葫蘆生產(chǎn)上急需一種較為準確、靈敏和快速的病毒檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種利用分子標記快速檢測西葫蘆病毒病的方法，該方法運用根據(jù)3種病毒核苷酸保守區(qū)序列設(shè)計的引物進行多重RT-PCR，可檢測感病西葫蘆葉片組織中是否受到CMV、WMV和ZYMV 3種病毒的復(fù)合侵染，具有鑒定過程簡單、步驟少、設(shè)備要求低、費用少、時間短和精確性高等優(yōu)點。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

發(fā)明人首先針對三種病毒設(shè)計了三組引物對如下：

用于檢測黃瓜花葉病毒的引物對：CMV-F/CMV-R：

CMV-F如SEQ ID NO.1所示：5′-AACCYGGKTACACGTTCACATCTAT-3′，

CMV-R如SEQ ID NO.2所示：5′-GGAATKCGTTGRTGCTCG-3′，

用于檢測西瓜花葉病毒的引物對：WMV-F/WMV-R：

WMV-F如SEQ ID NO.3所示：5′-CCACGACTACAAAAGATAACAAA-3′，

WMV-R如SEQ ID NO.4所示：5′-GTGCCTCTCAGTATTTTCGG-3′，

用于檢測小西葫蘆花葉病毒的引物對：ZYMV-F/ZYMV-R：

ZYMV-F如SEQ ID NO.5所示：5′-TCAGGCACTCAGCCAACT-3′，

ZYMV-R如SEQ ID NO.6所示：5′-TCCATCAAGGCCAAACAAC-3′。

本發(fā)明所涉及的上述引物為針對西葫蘆病毒：黃瓜花葉病毒、西瓜花葉病毒和小西葫蘆黃花葉病毒專門設(shè)計的兼并引物或特異引物，與現(xiàn)有技術(shù)中單獨出現(xiàn)過的特異性引物相比，檢測范圍更大，可以檢測上述病毒的多種變種或小種，更好的反映西葫蘆的患病情況，確定是否感染的就是病毒病，從而幫助使用者確定相應(yīng)的對策；由于現(xiàn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中感染西葫蘆的病毒主要就是上述三種病毒，因此發(fā)明人主要選取了上述三組引物進行檢測，且由于上述病毒感染時一般是混合侵染，采用上述方法能夠取得最佳的檢測效果，避免了采用過多對引物檢測造成的相互影響。

在上述引物的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進一步公開了利用分子標記快速檢測西葫蘆病毒病的方法,具體步驟如下：

(1)提取感病西葫蘆葉片總RNA；

(2)反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

(3)用3對RT-PCR引物進行多重RT-PCR；

其中步驟(3)中多重RT-PCR擴增體系為25μL，其中包括1μL的模板cDNA、2μL的引物對、濃度為1.0mmol/L的dNTPs、酶活為1U的Taq DNA聚合酶和濃度為2.0mmol/L的Mg²⁺；

多重RT-PCR反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s、55℃退火復(fù)性30s、72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸5min；

(4)對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得病毒基因擴增產(chǎn)物條帶，判定西葫蘆是否感染病毒??；

步驟(4)中判定標準為：若西葫蘆葉片感染病毒病，則擴增黃瓜花葉病毒病的引物對所擴增出的核苷酸片段長度為439bp，擴增西瓜花葉病毒病的引物對所擴增出的核苷酸片段長度為615bp，擴增小西葫蘆黃花葉病毒病的引物對所擴增出的核苷酸片段長度為744bp。

步驟(1)和(2)的技術(shù)方案均采用現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)明人在此不再贅述；

綜上所述，本發(fā)明提供了一種利用分子標記快速檢測西葫蘆病毒病的方法，該方法運用根據(jù)3種病毒核苷酸保守區(qū)序列設(shè)計的特異性引物進行多重RT-PCR，可檢測感病西葫蘆葉片組織中是否受到CMV、WMV和ZYMV 3種病毒的復(fù)合侵染，具有鑒定過程簡單、步驟少、設(shè)備要求低、費用少、時間短和精確性高等優(yōu)點。

附圖說明

圖1為檢測人工接種黃瓜花葉病毒、西瓜花葉病毒、小西葫蘆花葉病毒及同時接種三種病毒病的西葫蘆凝膠電泳圖；

其中，M為Marker，1為陽性質(zhì)粒PCR對照，2為健康西葫蘆對照，3、4為人工接種ZYMV的西葫蘆樣品，5、6為人工接種WMV的西葫蘆樣品，7、8為人工接種CMV的西葫蘆樣品，9、10為同時接種CMV、WMV、ZYMV的西葫蘆樣品；

圖2為RT-PCR檢測田間發(fā)病西葫蘆凝膠電泳圖；

其中，M為Marker，1為陽性質(zhì)粒PCR對照，2為健康西葫蘆對照，3-8為田間感病西葫蘆樣品；

圖3為人工接種田間侵染三種病毒的西葫蘆凝膠電泳圖；

其中，M為Marker，1為陽性質(zhì)粒PCR對照，2為健康西葫蘆對照，3-8為感病西葫蘆樣品；

圖4為人工接種三種黃瓜花葉病毒的西葫蘆凝膠電泳圖；

其中，M為Marker，1為陽性質(zhì)粒PCR對照，2為健康西葫蘆對照，3和4為接種CMV1西葫蘆樣品，5和6為接種CMV2西葫蘆樣品，7和8為接種CMV3西葫蘆樣品。

具體實施方式

以下實施例中進一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；

實施例1

以健康植株為對照，檢測分別人工接種黃瓜花葉病毒病、西瓜花葉病毒病和小西葫蘆花葉病毒及同時接種3種病毒的西葫蘆植株(利用石英砂摩擦侵染病毒的煙草葉片，然后將帶病毒的汁液摩擦接種到西葫蘆子葉上。方法參考方榮祥院士相關(guān)文章記載)，驗證方法可靠性。

1、采取健康和人工接種病毒后的西葫蘆葉片，迅速液氮冷凍后存-80℃；

2、總RNA的提取

分別稱取樣品各0.5g放入-80℃深凍研缽中加液氮充分研磨，迅速轉(zhuǎn)入到液氮預(yù)冷的無RNase的無菌1.5mLeppendorf管中，加入1mL4℃預(yù)冷的Trizol提取液中，充分混勻后靜置5min，4℃，12,000g離心5min。上清用200μL氯仿抽提一次，4℃，12,000g離心15min。上清加入等體積異丙醇，顛倒混勻后靜置10min，于4℃，12,000g離心15min。棄上清液，沉淀用70％預(yù)冷的乙醇洗滌一次，充分干燥后溶于30μL DEPC處理的ddH₂O中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、cDNA第一鏈的合成

使用天根FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒。將模板RNA在冰上解凍，取2μg模板RNA，按照說明書基因組DNA的去除體系配置混合液，42℃孵育3min，以除去基因組DNA；按說明書加入反轉(zhuǎn)錄體系混合液，42℃孵育15min，95℃滅活3min，置冰上待用。

4、RT-PCR反應(yīng)

本實施方式中使用3對引物，分別是用于檢測黃瓜花葉病毒的引物對：CMV-F(SEQ IDNO.1)/CMV-R(SEQ ID NO.2)；用于檢測西瓜花葉病毒的引物對：WMV-F(SEQ ID NO.3)/WMV-R(SEQID NO.4)；用于檢測小西葫蘆花葉病毒的引物對：ZYMV-F(SEQ ID NO.5)/ZYMV-R(SEQ ID NO.6)。

PCR反應(yīng)體系為25μL，其中包括10×PCR Buffer 2.5μL，0.5mM dNTPs，以0.5μL上述cDNA或已知片段質(zhì)粒為模板，引物各5μM，1U Taq DNA聚合酶，無菌超純水補齊至25μL；

擴增程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃終延伸5min；PCR產(chǎn)物保存于10℃；

5、電泳檢測

取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，在0.5×TAE緩沖液環(huán)境中，110V穩(wěn)壓電泳30min，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果，分別得到感染CMV的西葫蘆擴增出439bp條帶，感染W(wǎng)MV的西葫蘆擴增出615bp條帶，感染ZYMV的西葫蘆擴增出744bp條帶及同時接種三種病毒的西葫蘆樣品擴增出三條相應(yīng)條帶，參見圖1?？梢娙斯そ臃N與檢測結(jié)果對應(yīng)。

實施例2 RT-PCR檢測田間發(fā)病西葫蘆病毒病侵染種類

1、從田間采取6個感病西葫蘆樣品葉片及健康西葫蘆葉片，迅速液氮冷凍后存-80℃；

2、總RNA的提取

分別稱取樣品各0.5g放入-80℃深凍研缽中加液氮充分研磨，迅速轉(zhuǎn)入到液氮預(yù)冷的無RNase的無菌1.5mLeppendorf管中，加入1mL4℃預(yù)冷的Trizol提取液中，充分混勻后靜置5min，4℃，12,000g離心5min。上清用200μL氯仿抽提一次，4℃，12,000g離心15min。上清加入等體積異丙醇，顛倒混勻后靜置10min，于4℃，12,000g離心15min。棄上清液，沉淀用70％預(yù)冷的乙醇洗滌一次，充分干燥后溶于30μL DEPC處理的ddH₂O中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、cDNA第一鏈的合成

使用天根FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒。將模板RNA在冰上解凍，取2μg模板RNA，按照說明書基因組DNA的去除體系配置混合液，42℃孵育3min，以除去基因組DNA；按說明書加入反轉(zhuǎn)錄體系混合液，42℃孵育15min，95℃滅活3min，置冰上待用。

4、RT-PCR反應(yīng)

本實施方式中使用3對引物，分別是用于檢測黃瓜花葉病毒的引物對：CMV-F(SEQ ID NO.1)/CMV-R(SEQ ID NO.2)；用于檢測西瓜花葉病毒的引物對：WMV-F(SEQ ID NO.3)/WMV-R(SEQ ID NO.4)；用于檢測小西葫蘆花葉病毒的引物對：ZYMV-F(SEQ ID NO.5)/ZYMV-R(SEQ ID NO.6)。

PCR反應(yīng)體系為25μL，其中包括10×PCR Buffer 2.5μL，0.5mM dNTPs，以0.5μL上述cDNA或已知片段質(zhì)粒為模板，引物各5μM，1U Taq DNA聚合酶，無菌超純水補齊至25μL；

擴增程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃終延伸5min；PCR產(chǎn)物保存于10℃；

5、電泳檢測

取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，在0.5×TAE緩沖液環(huán)境中，110V穩(wěn)壓電泳30min，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果，分別得到2條或3條特異性條帶，得到每種病毒的擴增引物條帶位置，參見說明書附圖中的圖2。

可見田間感病西葫蘆樣品均為混合侵染，本發(fā)明所提供的方法針對混合侵染的檢測效果可信度較高。

實施例3

人工接種實施例2中檢測到三種病毒的西葫蘆汁液觀察表型及電泳檢測，驗證方法準確性

1、將實施例2中檢測到三種病毒的西葫蘆病葉用石英砂研磨后，人工接種到健康的一周大的西葫蘆子葉上，兩周后統(tǒng)計發(fā)病情況。

2、采取接種后的西葫蘆葉片及健康西葫蘆葉片，按實施例2中操作檢測發(fā)病情況，電泳結(jié)果如圖3所示，均檢測到三條特異性條帶，即受三種病毒侵染。

綜上所述，與常規(guī)的接種方法檢測比較，該檢測方法準確、可靠、省時省力。

實施例4

以健康植株為對照，分別人工接種黃瓜花葉病毒病3個小種至健康西葫蘆子葉上檢測系統(tǒng)的可靠性。

1、將攜帶三種黃瓜花葉病毒小種的煙草葉片用石英砂研磨后，人工接種到健康的一周大的西葫蘆子葉上。

2、兩周后，采取接種后的西葫蘆葉片及健康西葫蘆葉片，按實施例2中操作檢測發(fā)病情況，電泳結(jié)果如圖4所示，均檢測到439bp特異性條帶，即3種黃瓜花葉病毒均可被檢測到，可見本發(fā)明所提供的引物和方法可以實現(xiàn)多種小種的檢測。

<110>李興盛

<120>一種利用分子標記快速檢測西葫蘆病毒病的方法

<160>6

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aaccyggkta cacgttcaca tctat 25

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggaatkcgtt grtgctcg 18

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ccacgactac aaaagataac aaa 23

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gtgcctctca gtattttcgg 20

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcaggcactc agccaact 18

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tccatcaagg ccaaacaac 19