一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，包括以下步驟：(1)以節(jié)瓜種子滅菌后接種于基本培養(yǎng)基中形成無菌苗，切取無菌苗莖尖，轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復繼代培養(yǎng)，擴大繁殖，建立節(jié)瓜無性繁殖系；(2)用鐮刀菌酸作為離體脅迫劑與所述節(jié)瓜不定芽分化培養(yǎng)基配制篩選培養(yǎng)基，對已建立的節(jié)瓜無性繁殖系進行抗性離體篩選，獲得具有對鐮刀菌酸抗性的無性繁殖系；(3)將具有抗性的無性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導生根，形成再生植株，即為抗性變異體。本發(fā)明不僅篩選出的變異體抗性強，而且選擇效率高，選擇效果好。
【專利說明】
一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法。
【背景技術】
[0002] 節(jié)瓜是華南地區(qū)有優(yōu)勢的特色蔬菜，節(jié)瓜枯萎病是節(jié)瓜的主要病害之一，給節(jié)瓜 生產(chǎn)造成嚴重損失。由于枯萎病菌在土壤中存活時間可達3年以上，通過輪作等栽培措施 難以從根本上消除病害的影響。選育節(jié)瓜抗枯萎病品種是解決節(jié)瓜枯萎病危害問題的根本 途徑。由于節(jié)瓜遺傳資源比較狹窄，目前節(jié)瓜種質(zhì)資源中抗枯萎病材料較為缺乏，已成為節(jié) 瓜抗枯萎病育種的瓶頸。
[0003] 節(jié)瓜枯萎病是由鐮刀菌屬病菌引起的真菌性病害。鐮刀菌侵入植物體內(nèi)，可以分 泌毒素鐮刀菌酸，對寄主植物產(chǎn)生毒害，使后者枯萎，直至死亡。常規(guī)的抗枯萎病材料篩選 的方法是田間自然篩選或苗期人工接種篩選。田間自然篩選在病害自然發(fā)生時，在田間感 病群體中選擇發(fā)病輕或未發(fā)病的個體進行繁殖，以獲得抗病材料；這種方法的缺點是依賴 于病害的自然發(fā)生，病害輕的年份無法開展工作；苗期人工接種篩選是在苗期將人工培養(yǎng) 的病菌接種到植株上，待群體發(fā)病時，從中選取未發(fā)病或發(fā)病輕的個體進行培育，繁殖，進 而獲得抗病植株；這種方法可以克服對病害自然發(fā)生的依賴，但仍會受季節(jié)限制，必須在適 宜發(fā)病的季節(jié)進行接種鑒定，選擇效率相對較低，同時如果群體較小，或群體中變異較少， 也難以達到預期的選擇效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種選擇效率高，選擇效果好的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離 體篩選方法。
[0005] 本發(fā)明的目的可通過以下的技術步驟來實現(xiàn)：
[0006] (1)以節(jié)瓜種子滅菌后接種于1/2MS基本培養(yǎng)基中形成無菌苗，切取無菌苗莖尖， 轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復 繼代培養(yǎng)，擴大繁殖，建立節(jié)瓜無性繁殖系；
[0007] (2)用鐮刀菌酸作為離體脅迫劑與所述節(jié)瓜不定芽分化培養(yǎng)基配制篩選培養(yǎng)基， 對已建立的節(jié)瓜無性繁殖系進行抗性離體篩選，獲得具有對鐮刀菌酸抗性的無性繁殖系；
[0008] (3)將具有抗性的無性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導生根，形成再生 植株，即為抗性變異體。
[0009] 本發(fā)明步驟（1)中的不定芽分化培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至 4~6mg/L，吲噪乙酸至0. 1~0. 2mg/L配制而成，無菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng) 18~22天，培養(yǎng)條件為室溫23°C~27°C，每日光照10~14小時。
[0010] 本發(fā)明步驟（2)中的篩選培養(yǎng)基是在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過濾滅菌 的鐮刀菌酸溶液，使之最終鐮刀菌酸濃度為75~100mg/L。
[0011] 本發(fā)明步驟（2)中的具體篩選過程為將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培 養(yǎng)基中，在25±2°C，每日光照10~14小時的條件下進行培養(yǎng)，15~18天后將尚存活的不 定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基上進行恢復培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無性繁殖系具 有對鐮刀菌酸的抗性。
[0012] 本發(fā)明步驟（3)中的生根培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0. 3~0. 8mg/ L而成。
[0013] 選用廣東地方品種"黑毛節(jié)瓜"無菌苗增殖的不定芽，以鐮刀菌酸濃度為75mg/ L~100mg/L篩選培養(yǎng)基篩選的變異體經(jīng)3代恢復和增殖，回接到含鐮刀菌酸濃度為50~ 100mg/L的篩選培養(yǎng)基上再次篩選，以同源的未經(jīng)篩選的細胞系為對照。表1結(jié)果表明，變 異體對鐮刀菌酸（FA)的抗性明顯增強。
[0014] 表1經(jīng)篩選的細胞系對FA抗性的提高
[0015]
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下的優(yōu)點：
[0017] 1、田間自然篩選方法應用的前提是田間必須有節(jié)瓜枯萎病發(fā)生，同時發(fā)病群體的 大小、病害發(fā)生的嚴重程度均會影響選擇效果；抗枯萎病變異體離體篩選在離體外加脅迫 的條件下進行篩選，脅迫壓力可以人工控制，不受自然氣候條件及病害是否發(fā)生的限制，并 且可以連續(xù)進行脅迫，可以更快地篩選出具有強抗性的材料。
[0018] 2、與苗期人工接種篩選方法相比，抗枯萎病變異體離體篩選在無菌條件下進行培 養(yǎng)，不僅可以節(jié)省土地，還可以避免因人工接種不慎而導致病菌污染環(huán)境。
[0019] 3、田間自然篩選方法與苗期人工接種篩選方法受季節(jié)和溫度影響，每年通常只能 在適宜節(jié)瓜生長的季節(jié)進行篩選；而抗枯萎病變異體離體篩選在人工控制光溫條件下進 行，不受季節(jié)和氣候的限制，篩選工作可以連續(xù)進行，顯著提高了選擇效率。
[0020] 4、田間自然篩選方法與苗期人工接種篩選方法均是在植株個體水平進行抗性篩 選，而抗枯萎病變異體離體篩選方法是在組織和細胞水平進行抗性篩選，選擇群體大，且與 種子形成的群體相比無性繁殖系群體的變異幅度較大，因而目標性狀出現(xiàn)的幾率較大，可 以獲得更好的選擇效果。
【具體實施方式】
[0021] 實施例一
[0022] (1)將MS基本培養(yǎng)基中的各組分的濃度減半配制得到1/2MS培養(yǎng)基；以節(jié)瓜種子 滅菌后接種于1/2MS培養(yǎng)基中形成無菌苗，切取無菌苗莖尖；
[0023] (2)在MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至5mg/L，吲哚乙酸至0· lmg/L配制成 不定芽分化培養(yǎng)基，將步驟（1)中切取的無菌苗莖尖轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢 生不定芽，無菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，培養(yǎng)條件為室溫25°C，每目光照 12小時；此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復繼代培養(yǎng)，擴大繁殖，建立節(jié)瓜無性繁 殖系；
[0024] (3)在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過濾滅菌的鐮刀菌酸溶液（Fusaric Acid， 簡稱FA)至85mg/L配成篩選培養(yǎng)基，對步驟（2)中已建立的節(jié)瓜無性繁殖系進行抗性離體 篩選，具體篩選過程為：將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培養(yǎng)基中，在25°C，每日 光照12小時的條件下進行培養(yǎng)，16天后將尚存活的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基上進行 恢復培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無性繁殖系具有對鐮刀菌酸的抗性；
[0025] (4)在MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0· 6mg/L配成生根培養(yǎng)基，將上述具有抗性 的無性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導生根，形成再生植株，即為抗性變異體。
[0026] 實施例二
[0027] (1)將MS基本培養(yǎng)基中的各組分的濃度減半配制得到1/2MS培養(yǎng)基：以節(jié)瓜種子 滅菌后接種于1/2MS培養(yǎng)基中形成無菌苗，切取無菌苗莖尖；
[0028] (2)在MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至4mg/L，吲哚乙酸至0· 2mg/L配制成 不定芽分化培養(yǎng)基，將步驟（1)中切取的無菌苗莖尖轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢 生不定芽，無菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18~22天，培養(yǎng)條件為室溫23°C，每日 光照10小時；此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復繼代培養(yǎng)，擴大繁殖，建立節(jié)瓜無 性繁殖系；
[0029] (3)在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過濾滅菌的鐮刀菌酸溶液（Fusaric Acid， 簡稱FA)至75mg/L配成篩選培養(yǎng)基，對步驟（2)中已建立的節(jié)瓜無性繁殖系進行抗性離體 篩選，具體篩選過程為：將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培養(yǎng)基中，在23°C，每日 光照10小時的條件下進行培養(yǎng)，15天后將尚存活的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基上進行 恢復培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無性繁殖系具有對鐮刀菌酸的抗性；
[0030] (4)在MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0· 3mg/L配成生根培養(yǎng)基，將上述具有抗性 的無性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導生根，形成再生植株，即為抗性變異體。
[0031] 實施三
[0032] (1)將MS基本培養(yǎng)基中的各組分的濃度減半配制得到1/2MS培養(yǎng)基：以節(jié)瓜種子 滅菌后接種于1/2MS培養(yǎng)基中形成無菌苗，切取無菌苗莖尖；
[0033] (2)在MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至6mg/L，吲哚乙酸至0· lmg/L配制成 不定芽分化培養(yǎng)基，將步驟（1)中切取的無菌苗莖尖轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢 生不定芽，無菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)22天，培養(yǎng)條件為室溫27°C，每日光照 14小時；此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復繼代培養(yǎng)，擴大繁殖，建立節(jié)瓜無性繁 殖系；
[0034] (3)在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過濾滅菌的鐮刀菌酸溶液（Fusaric Acid， 簡稱FA)至100mg/L配成篩選培養(yǎng)基，對步驟（2)中已建立的節(jié)瓜無性繁殖系進行抗性離 體篩選，具體篩選過程為：將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培養(yǎng)基中，在27°C，每 日光照14小時的條件下進行培養(yǎng)，18天后將尚存活的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基上進 行恢復培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無性繁殖系具有對鐮刀菌酸的抗性；
[0035] (4)在MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0· 8mg/L配成生根培養(yǎng)基，將上述具有抗性 的無性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導生根，形成再生植株，即為抗性變異體。
【主權項】
1. 一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 以節(jié)瓜種子滅菌后接種于1/2MS基本培養(yǎng)基中形成無菌苗，切取無菌苗莖尖，轉(zhuǎn)接 入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復繼代 培養(yǎng)，擴大繁殖，建立節(jié)瓜無性繁殖系； (2) 用鐮刀菌酸作為離體脅迫劑與所述節(jié)瓜不定芽分化培養(yǎng)基配制篩選培養(yǎng)基，對已 建立的節(jié)瓜無性繁殖系進行抗性離體篩選，獲得具有對鐮刀菌酸抗性的無性繁殖系： (3) 將具有抗性的無性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導生根，形成再生植 株，即為抗性變異體。2. 根據(jù)權利要求1所述的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于步驟（1) 中的不定芽分化培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至4~6mg/L，吲哚乙酸至 0. 1~0. 2mg/L配制而成，無菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18~22天，培養(yǎng)條件為 室溫23°C~27°C，每日光照10~14小時。3. 根據(jù)權利要求1所述的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于步驟（2) 中的篩選培養(yǎng)基是在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過濾滅菌的鐮刀菌酸溶液，使之最終 鐮刀菌酸濃度為75~100mg/L。4. 根據(jù)權利要求1所述的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于步驟（2) 中的具體篩選過程為將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培養(yǎng)基中，在25±2°C，每日 光照10~14小時的條件下進行培養(yǎng)，15~18天后將尚存活的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng) 基上進行恢復培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無性繁殖系具有對鐮刀菌酸的抗性。5. 根據(jù)權利要求1所述的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于步驟（3) 中的生根培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0. 3~0. 8mg/L而成。
【文檔編號】A01H4/00GK106063457SQ201410594699
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2014年10月21日 公開號201410594699.9, CN 106063457 A, CN 106063457A, CN 201410594699, CN-A-106063457, CN106063457 A, CN106063457A, CN201410594699, CN201410594699.9
【發(fā)明人】華生奎, 付燕
【申請人】重慶市涪陵區(qū)生奎蔬菜種植場