本發(fā)明屬于養(yǎng)殖業(yè)的病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲆铩⒃噭┖屑胺椒ā?/p>

背景技術(shù)：

免疫抑制是指由于免疫系統(tǒng)受到損害而導(dǎo)致家禽暫時性或永久性免疫應(yīng)答功能不全以及對疾病的高度易感。近年來，免疫抑制性病毒越來越受到人們的關(guān)注。禽類病毒性免疫缺陷疾病是困擾當(dāng)前養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病，雞群中存在免疫抑制性病毒的感染，會使雞群對其它病毒或細菌不僅變得更為易感，而且使其感染的癥狀、病變不典型。除此之外，還會造成雞群對某些疫苗的免疫反應(yīng)下降甚至不反應(yīng)，導(dǎo)致免疫失敗?？梢鹈庖咭种频牟《竞芏啵饕须u馬立克氏病病毒（MDV，Marek's disease virus）、雞傳染性貧血病病毒（CAV，Chicken infectious anemia virus）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒（REV，Reticuloendotheliosis virus）、雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV，Infections Bursal Disease virus）和禽呼腸孤病毒（REO，Avian reovirus），等。這類免疫缺陷的大多數(shù)病毒主要通過垂直傳播，還可通過水平傳播，在雞群中長期存在，難以凈化，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。這些病毒往往共同作用，以二重感染或多重感染的方式造成雞的免疫抑制，使疾病的診斷更加復(fù)雜。這些病毒往往共同作用，以二重感染或多重感染的方式造成雞的免疫抑制，使疾病的診斷更加復(fù)雜。

這些免疫抑制性病毒常呈持續(xù)性亞臨床感染，由于其臨床癥狀不典型，很難做出正確的診斷，其鑒別診斷通常需借助實驗室診斷技術(shù)，傳統(tǒng)的檢測方法主要包括病原分離鑒定、血清學(xué)試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等，但這些方法常受臨床病材料新鮮度、污染程度或病程等因素的限制，操作也十分繁瑣、費時，而且敏感性低，特異性差，不易檢測出混合感染，不利于疾病的及時診斷治療，從而造成重大的經(jīng)濟損失。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于這些雞傳染病的檢測，并建立了多重 PCR 檢測技術(shù)，同時檢測幾種病原，多重RT-PCR因其靈敏性、特異性和操作的簡單性被廣泛應(yīng)用于禽病的混合感，但結(jié)果判定需要電泳，費時費力，且反應(yīng)產(chǎn)物容易產(chǎn)生污染而導(dǎo)致假陽性，而多重PCR是靠片段的大小來區(qū)別的，一般到了三重以上，片段大小差別大，其每種病毒的擴增效率不一樣，造成結(jié)果存在偏差。熒光定量PCR技術(shù)融合了PCR的多種優(yōu)點，通過直接檢測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化實現(xiàn)對目的分子的定量，不需要電泳檢測，并且整個過程完全閉管式操作，污染機率降低，避免了常規(guī)PCR容易造成的假陽性問題。相對常規(guī)PCR，熒光定量PCR在敏感性、特異性與速度等方面具有優(yōu)勢，但實時熒光PCR技術(shù)受到熒光種類及儀器自身的限制，最多只能對5個靶標(biāo)進行檢測，且實驗成功的難度極大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲆铩?/p>

本發(fā)明的目的在于提供一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖小?/p>

本發(fā)明的目的在于提供一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ā?/p>

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲆?，所?種禽免疫抑制病原為雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒，所述引物核苷酸序列如下所示：

引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），

引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；

引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），

引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；

引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），

引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；

引物O1：5’-CGTGTAACGGTGCGACTG-3’ （SEQ ID NO：7），

引物O2：5’-CCGCTAGATAAGGCCAAT-3’ （SEQ ID NO：8）；

引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：9），

引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：10）。

進一步的，所述引物C1和C2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物M1和M2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物R1和R2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物O1和O2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物B1和B2其中一條引物的5’端被生物素化。

進一步的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補配對。

進一步的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2這5組引物對中連接的tag序列選自SEQ ID NO:11~15所示的tag序列，且該5組引物對中連接的tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?，所?種禽免疫抑制病原為雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒，該試劑盒中含有上述任一所述引物。

進一步的，上述試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、5種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。

進一步的，所述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補配對的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒?，所?種禽免疫抑制病原為雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒，包括如下步驟：

1）從樣品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸為模板，用上述任一所述的引物進行RT-PCR擴增；

3）將上步擴增產(chǎn)物、5種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進行雜交；

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對雜交產(chǎn)物進行檢測分析，確定病原的類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

進一步的，步驟2）中RT-PCR擴增的反應(yīng)體系為：

5×buffer 4μL

dNTP 0.8μL

引物混合液 2μL

酶 0.8μL

模板 1μL

ddH₂O 11.4μL

Total 20μL；

步驟2）中RT-PCR擴增的反應(yīng)程序為：50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循環(huán)35次；72℃ 10min，4℃ 保存。

進一步的，步驟3）中所述雜交的反應(yīng)體系和程序為：

5種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；37℃孵育30min。

本發(fā)明的有益效果是：

1）本發(fā)明方法同時對雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒、雞傳染性法氏囊病毒進行檢測時，通過PCR獲得目標(biāo)擴增片段，然后將擴增產(chǎn)物、熒光編碼微球和鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE）進行雜交，然后通過檢測儀讀取MFI值時，分辯不同類型的病原。

2）本發(fā)明方法能夠同時對雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒、雞傳染性法氏囊病毒進行準(zhǔn)確檢測，而且特異性強，靈敏度高，重復(fù)性好。與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明方法實現(xiàn)了對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行檢測，樣本用量少，操作簡單、快速，可大大降低檢測成本。本發(fā)明能保證相同的復(fù)性溫度和雜交效率，且有效避免不同檢測物標(biāo)記的微球之間交叉雜交。

附圖說明

圖1是禽免疫抑制5種病原及人工模擬的多重感染的PCR的電泳圖；

圖2是禽免疫抑制5種病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測實驗結(jié)果圖；

圖3是禽免疫抑制5種病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測特異性實驗結(jié)果圖；

圖4是禽免疫抑制5種病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測靈敏度實驗結(jié)果圖；

圖5是禽免疫抑制5種病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ㄅR床檢測實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲆铮?種禽免疫抑制病原為雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒，所述引物核苷酸序列如下所示：

引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），

引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；

引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），

引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；

引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），

引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；

引物O1：5’-CGTGTAACGGTGCGACTG-3’ （SEQ ID NO：7），

引物O2：5’-CCGCTAGATAAGGCCAAT-3’ （SEQ ID NO：8）；

引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：9），

引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：10）。

優(yōu)選的，所述引物C1和C2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物M1和M2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物R1和R2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物O1和O2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物B1和B2其中一條引物的5’端被生物素化。

優(yōu)選的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補配對。

優(yōu)選的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2這5組引物對中連接的tag序列選自SEQ ID NO:11~15所示的tag序列，且該5組引物對中連接的tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?，所?種禽免疫抑制病原為雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒，該試劑盒中含有上述任一所述引物。

優(yōu)選的，上述試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、5種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。

優(yōu)選的，所述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補配對的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒?，所?種禽免疫抑制病原為雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒，包括如下步驟：

1）從樣品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸為模板，用上述任一所述的引物進行RT-PCR擴增；

3）將上步擴增產(chǎn)物、5種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進行雜交；

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對雜交產(chǎn)物進行檢測分析，確定病原的類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

優(yōu)選的，步驟2）中RT-PCR擴增的反應(yīng)體系為：

5×buffer 4μL

dNTP 0.8μL

引物混合液 2μL

酶 0.8μL

模板 1μL

ddH₂O 11.4μL

Total 20μL；

步驟2）中RT-PCR擴增的反應(yīng)程序為：50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循環(huán)35次；72℃ 10min，4℃ 保存。

優(yōu)選的，步驟3）中所述雜交的反應(yīng)體系和程序為：

5種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；37℃孵育30min。

優(yōu)選的，步驟3）中5種編碼不同熒光色的熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補配對的anti-tag序列，5種熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1 引物設(shè)計

經(jīng)過對所設(shè)計的大量引物進行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2對多重?zé)晒馔瑫r檢測雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒和雞傳染性法氏囊病毒這5種禽免疫抑制病原的效果最好，其堿基序列如下所示。

引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），

引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；

引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），

引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；

引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），

引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；

引物O1：5’-CGTGTAACGGTGCGACTG-3’ （SEQ ID NO：7），

引物O2：5’-CCGCTAGATAAGGCCAAT-3’ （SEQ ID NO：8）；

引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：9），

引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：10）。

本發(fā)明采用多重?zé)晒夥治龅姆椒▽ι鲜?種禽免疫抑制病原進行區(qū)分，故將上述引物作進一步的修飾，以滿足相應(yīng)的操作要求。其中引物C1、M1、R1、O1和B1的5’端連接有tag序列，所連接的tag序列分別為：

引物C1的tag序列為：5’-ATACTTTACAAACAAATAACACAC-3’ （SEQ ID NO：11）；

引物M1的tag序列為：5’-TACTTAAACATACAAACTTACTCA-3’ （SEQ ID NO：12）；

引物R1的tag序列為：5’-CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-3’ （SEQ ID NO：13）；

引物O1的tag序列為：5’-ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-3’ （SEQ ID NO：14）；

引物B1的tag序列為：5’-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-3’ （SEQ ID NO：15）；

另外，引物C2、M2、R2、O2和B2的5’端還添加有生物素標(biāo)記。

實施例2 用于快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?/p>

試劑盒包括以下組分：

（1）實施例1所設(shè)計的的多重?zé)晒饷庖叻治鲆锝M；

（2）5種編碼不同熒光色的包含有anti-tag序列的熒光編碼微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與多重?zé)晒饷庖叻治鲆镏械膖ag序列互補配對；五種微球均購自luminex公司，具體的CAV、MDV、REV、REO和IBDV分別對應(yīng)的熒光編碼微球號為MTAG-A019、MTAG-A065、MTAG-A056、MTAG-A034和MTAG-015。

（3）鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物。

實施例3 5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測方法的建立

（1）五種禽呼吸道病原質(zhì)粒的構(gòu)建

用天根的核酸自動抽取儀分別提取CAV、MDV、REV、REO、IBDV病原的核酸（RNA/DNA），分別實施例1所設(shè)計的引物對C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2進行RT-PCR擴增，將擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠純化。用TaKaRa公司的試劑盒將純化后的cDNA連接至pMD-19T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細胞，挑選單克隆，進行菌落PCR鑒定，將鑒定為陽性菌的菌落進行質(zhì)粒抽提，送測序。

（2）質(zhì)粒PCR擴增

用實施例1所設(shè)計引物對C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2分別對CAV、MDV、REV、REO、IBDV引物進行單重、兩重、四重、五重PCR擴增。

上游引物混合液的制備：將C1、M1、R1、O1和B1以摩爾比1:1:1:1:1比例進行混合；下游引物混合液的制備：將C2、M2、R2、O2和B2以摩爾比1:1:1:1:1比例進行混合。利用禽免疫抑制五種病原的特異性模板，以及CAV、MDV兩重模板；CAV、MDV、REV、REO四重模板、CAV、MDV、REV、REO、IBDV五重模板，對上述五種病毒的特應(yīng)性區(qū)域進行擴增。其中兩重模板的制備：將兩兩質(zhì)粒體積比以1:1的比例進行混合，四重模板的制備：將四種質(zhì)粒以體積比1:1:1:1的比例進行混合，五重模板的制備：將五種質(zhì)粒以體積比1:1:1:1:1的比例進行混合。

PCR擴增反應(yīng)體系如下：

Premix Ex Taq 10μL

上游引物混合液 1μL

下游引物混合液 1μL

模板 1μL（＜500ng）

ddH₂O 7μL

Total 20μL；

其中上下游引物的終濃度為3μM。

擴增的反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火25s，72℃延伸20s；循環(huán)35次；72℃終延伸10min。

PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，其電泳圖如圖1所示。圖1中，M：DL2000 DNA marker，1：CAV，2：MDV，3：REV，4：REO， 5：IBDV，6：PCR blank（PCR空白對照），8：對CAV+MDV進行的二重PCR，9：對CAV+MDV+REV+REO進行的四重PCR，10：對CAV+MDV+REV+REO+IBDV進行的五重PCR。

從圖1中可以看出，CAV的擴增產(chǎn)物大小約為121bp，MDV的擴增產(chǎn)物大小約為114bp，REV的擴增產(chǎn)物大小約為153bp，REO的擴增產(chǎn)物大小約為117bp，IBDV的擴增產(chǎn)物大小約為128bp。由于這五種病毒的擴增產(chǎn)物大小相近，所以兩重、四重和五重PCR擴增產(chǎn)物的電泳條帶無法分辨。

（3）將所得PCR產(chǎn)物與熒光編碼微球工作液、鏈霉親和素藻紅蛋白（SA-PE）工作液雜交，包括以下步驟：

分別包被有特異的anti-tag序列的5種微球，其中anti-tag序列能相應(yīng)地與CAV、MDV、REV、REO和IBDV五種病毒引物上的tag序列互補配對。五種微球均購自luminex公司，具體的CAV、MDV、REV、REO和IBDV分別對應(yīng)的熒光編碼微球號為MTAG-A019、MTAG-A065、MTAG-A056、MTAG-A034和MTAG-015。

熒光編碼微球工作液的制備：將2500個/μl熒光編碼微球用1.1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到1μl約含有125個/種熒光編碼微球。

SA-PE工作液制備：將1mg/ml SA-PE用1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到10μg/μl。

充分重懸熒光編碼微球工作液，每個樣品孔和背景孔加入微球工作液20μl，樣品孔中加入5μl PCR產(chǎn)物，背景孔中加入5μl PCR blank產(chǎn)物，再加入75μl的SA-PE工作液，充分混勻，于金屬加熱器中37℃孵育30min。

依照檢測儀Luminex 200儀器的說明將雜交后的50μl上述反應(yīng)液進行檢測，結(jié)果如圖2所示，雖然兩重、四重和五重模板的擴增產(chǎn)物無法用電泳分辨，但用檢測儀Luminex 200儀器讀取MFI值時，明顯分辯不同類型的病毒。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)（注：該判斷標(biāo)準(zhǔn)僅供參考，亦可對結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)整）如下：

最低檢測閾值（cutoff值）的確定：選取10頭健康雞組織樣品（每個樣品平行重復(fù)3次），分別讀取MFI值并計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的MIF值設(shè)定其為cutoff值。本發(fā)明所獲得cutoff值為633.2，因此將本發(fā)明的cutoff值定為700。只有檢測樣品的MFI值高于700時，該實驗數(shù)據(jù)才能進行有效分析。

待測樣本的分析判斷：1）當(dāng)待測樣本的MFI值＞700時，判斷為陽性樣本；2）待測樣本的MFI值≤700時，判斷為陰性，需要進行重復(fù)實驗或采取其他檢測方法進一步驗證。

實施例4 CAV、MDV、REV、REO和IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測特異性實驗

分別用雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒、雞傳染性法氏囊病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒作為模板進行多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測。

1）從樣品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸為模板，用實施例1設(shè)計的引物對引物對C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2引物進行RT-PCR擴增；

RT-PCR擴增的反應(yīng)體系為：

5×buffer 4μL

dNTP 0.8μL

上游引物混合液 2μL

酶 0.8μL

模板 1μL

ddH₂O 11.4μL

Total 20μL；

步驟2）中RT-PCR擴增的反應(yīng)程序為：50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循環(huán)35次；72℃ 10min，4℃ 保存。

3）將上步擴增產(chǎn)物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進行雜交；

雜交的反應(yīng)體系和程序為：

4種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；37℃孵育30min。

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對雜交產(chǎn)物進行檢測分析，確定其病毒的類型。

實驗結(jié)果如圖3所示，只有雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、禽呼腸孤病毒、雞傳染性法氏囊病毒為陽性，其他的均為陰性，說明檢測體系特異性良好。

實施例5：CAV、MDV、REV、REO和IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測靈敏性實驗

將制備的質(zhì)粒進行定量，采用10倍稀釋法進行稀釋，稀釋至10¹copies/μl，用上述建立的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ㄟM行檢測。CAV、MDV、REV、REO和IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測靈敏性實驗結(jié)果如圖4所示，實驗結(jié)果表明，除了IBDV的靈敏度檢出限為10⁴copies/μl，其他的靈敏度檢出限為10³copies/μl。

實施例6：樣品的檢測

從雞場采集的脾、腎、肝等樣品，用天根核酸自動抽取儀提取RNA/DNA，使用Qiagen的RT-PCR kit進行擴增，以RNA/DNA作為模板，采用上述CAV、MDV、REV、REO和IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測方法進行檢測，擴增產(chǎn)物與熒光編碼微球和SA-PE雜交，在Luminex 200檢測儀上讀數(shù)。具體步驟參照實施例3或?qū)嵤├?，實驗結(jié)果如圖5所示。

本發(fā)明方法的檢測結(jié)果表明，樣品4F、4S、4XW和4W為陰性樣本；12為傳染性法氏囊病毒單獨感染樣品；46為禽呼腸孤病毒單獨感染樣品；26為雞傳染性貧血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒兩重混合感染樣品；11為雞傳染性貧血病病毒、馬立克病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒三重混合感染樣品；14、34、22、43、32、24、23為雞傳染性貧血病病毒與馬立克病毒兩重混合感染樣品；其他的均為雞傳染性貧血病病毒單獨感染樣品。通過測序分析，結(jié)果一致。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省實驗動物監(jiān)測所

<120> 一種快速區(qū)分5種禽免疫抑制病原的多重?zé)晒饷庖叻治鲆?、試劑盒及方?/p>

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgacatcgga ggagacag 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaagcggat agtcatagta ga 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccattccct cttctgcc 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctgagcgta aaccgtc 17

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gactgccttg tgactgct 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

actcccactg ttgtctaaat c 21

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgtgtaacgg tgcgactg 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgctagata aggccaat 18

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgcggagcc ttctga 16

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

attagccctg accctgtg 18

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atactttaca aacaaataac acac 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tacttaaaca tacaaactta ctca 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cttaaactct acttacttct aatt 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acttatttct tcactactat atca 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tacttcttta ctacaattta caac 24