本發(fā)明屬于養(yǎng)殖業(yè)的病原檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速區(qū)分雞傳染性貧血病病毒（CAV，Chicken infectious anemia virus）、雞馬立克氏病病毒（MDV，Marek's disease virus）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV，Reticuloendotheliosis virus）和傳染性法氏囊病毒（IBDV，Infections Bursal Disease virus）的多重?zé)晒饷庖叻治鲆铩⒃噭┖屑胺椒ā?/p>

背景技術(shù)：

家禽免疫系統(tǒng)的免疫反應(yīng)或功能是機(jī)體抵抗病原入侵、感染以及繁殖擴(kuò)散的主要機(jī)制，是機(jī)體防御體系的重要組成部分。雞體的免疫器官包括法氏囊、骨髓、脾臟、胸腺、盲腸扁桃體。免疫抑制病是由單一或多種致病因素共同作用，導(dǎo)致雞免疫系統(tǒng)受損，免疫功能降低的多種傳染性因素及非傳染性因素所導(dǎo)致疾病的總稱。我們最常見的臨床表現(xiàn)為雞群慢性的生產(chǎn)性能低下，直接影響雞群的經(jīng)濟(jì)性能指標(biāo)，主要因?yàn)樵诎l(fā)生免疫抑制的情況下疫苗免疫后，抗體水平不高。研究表明，病毒傳染是造成免疫抑制的主要因素。馬立克氏病病毒、雞傳染性貧血病病毒、傳染性法氏囊病毒和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生病病毒是4種可能導(dǎo)致免疫抑制性疾病的病毒,在雞群中的感染很普遍,但發(fā)病率和死亡率不一。這幾種病毒的感染都能使機(jī)體抵抗力下降,導(dǎo)致新城疫、法氏囊等疫苗的免疫失敗和大腸桿菌等的繼發(fā)感染，給養(yǎng)禽業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。

這些免疫抑制性病毒常呈持續(xù)性亞臨床感染，由于其臨床癥狀不典型，很難做出正確的診斷，其鑒別診斷通常需借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要包括病原分離鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，但這些方法常受臨床病材料新鮮度、污染程度或病程等因素的限制，操作也十分繁瑣、費(fèi)時(shí)，而且敏感性低，特異性差，不易檢測(cè)出混合感染，不利于疾病的及時(shí)診斷治療，從而造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于這些雞傳染病的檢測(cè)，并建立了多重 PCR 檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)幾種病原，多重RT-PCR因其靈敏性、特異性和操作的簡(jiǎn)單性被廣泛應(yīng)用于禽病的混合感，但結(jié)果判定需要電泳，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且反應(yīng)產(chǎn)物容易產(chǎn)生污染而導(dǎo)致假陽性，而多重PCR是靠片段的大小來區(qū)別的，一般到了三重以上，片段大小差別大，其每種病毒的擴(kuò)增效率不一樣，造成結(jié)果存在偏差。熒光定量PCR技術(shù)融合了PCR的多種優(yōu)點(diǎn)，通過直接檢測(cè)PCR反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)目的分子的定量，不需要電泳檢測(cè)，并且整個(gè)過程完全閉管式操作，污染機(jī)率降低，避免了常規(guī)PCR容易造成的假陽性問題。相對(duì)常規(guī)PCR，熒光定量PCR在敏感性、特異性與速度等方面具有優(yōu)勢(shì)，但實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)受到熒光種類及儀器自身的限制，最多只能對(duì)5個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，且實(shí)驗(yàn)成功的難度極大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鲆铩?/p>

本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖小?/p>

本發(fā)明的再一目的在于提供一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ā?/p>

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鲆铮鲆锖塑账嵝蛄腥缦滤荆?/p>

引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），

引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；

引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），

引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；

引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），

引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；

引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：7），

引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：8）。

進(jìn)一步的，所述引物C1和C2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物M1和M2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物R1和R2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物B1和B2其中一條引物的5’端被生物素化。

進(jìn)一步的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補(bǔ)配對(duì)。

進(jìn)一步的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2這4組引物對(duì)中連接的tag序列選自SEQ ID NO:9~12所示的tag序列，且該4組引物對(duì)中連接的tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?，該試劑盒中含有上述任一所述引物?/p>

進(jìn)一步的，上述試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。

進(jìn)一步的，上述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒?，包括如下步驟：

1）從樣品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸為模板，用上述任一所述的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；

3）將上步擴(kuò)增產(chǎn)物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行雜交；

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，確定其病毒的類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

進(jìn)一步的，步驟2）中RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

5×buffer 4μL

dNTP 0.8μL

引物混合液 2μL

酶 0.8μL

模板 1μL

ddH₂O 11.4μL

Total 20μL；

步驟2）中RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循環(huán)35次；72℃ 10min，4℃ 保存。

進(jìn)一步的，步驟3）中所述雜交的反應(yīng)體系和程序?yàn)椋?/p>

4種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；37℃孵育30min。

本發(fā)明的有益效果是：

1）本發(fā)明方法同時(shí)對(duì)雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和傳染性法氏囊病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過RT-PCR獲得目標(biāo)擴(kuò)增片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物、熒光編碼微球和鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE）進(jìn)行雜交，然后通過檢測(cè)儀讀取MFI值時(shí)，分辯不同類型的病原。

2）本發(fā)明方法能夠同時(shí)對(duì)雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和傳染性法氏囊病毒進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，而且特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，樣本用量少，操作簡(jiǎn)單、快速，可大大降低檢測(cè)成本。本發(fā)明能保證相同的復(fù)性溫度和雜交效率，且有效避免不同檢測(cè)物標(biāo)記的微球之間交叉雜交。

附圖說明

圖1是雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和傳染性法氏囊病毒及人工模擬的多重感染的PCR的電泳圖；

圖2是雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和傳染性法氏囊病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖3是雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和傳染性法氏囊病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測(cè)特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖4是雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和傳染性法氏囊病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖5是雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和傳染性法氏囊病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ㄅR床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鲆?，所述引物核苷酸序列如下所示?/p>

引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），

引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；

引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），

引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；

引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），

引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；

引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：7），

引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：8）。

優(yōu)選的，所述引物C1和C2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物M1和M2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物R1和R2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物B1和B2其中一條引物的5’端被生物素化。

優(yōu)選的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補(bǔ)配對(duì)。

優(yōu)選的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2這4組引物對(duì)中連接的tag序列選自SEQ ID NO:9~12所示的tag序列，且該4組引物對(duì)中連接的tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?，該試劑盒中含有上述任一所述引物?/p>

優(yōu)選的，上述試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。

優(yōu)選的，上述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒?，包括如下步驟：

1）從樣品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸為模板，用上述任一所述的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；

3）將上步擴(kuò)增產(chǎn)物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行雜交；

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，確定其病毒的類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

優(yōu)選的，步驟2）中RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

5×buffer 4μL

dNTP 0.8μL

引物混合液 2μL

酶 0.8μL

模板 1μL

ddH₂O 11.4μL

Total 20μL；

步驟2）中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循環(huán)35次；72℃ 10min，4℃ 保存。

優(yōu)選的，步驟3）中所述雜交的反應(yīng)體系和程序?yàn)椋?/p>

4種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；37℃孵育30min。

優(yōu)選的，步驟3）中4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，4種熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1 引物設(shè)計(jì)

經(jīng)過對(duì)所設(shè)計(jì)的大量引物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對(duì)C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2對(duì)多重?zé)晒馔瑫r(shí)檢測(cè)CAV、MDV、REV、IBDV的效果最好，其堿基序列如下所示。

引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），

引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；

引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），

引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；

引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），

引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；

引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：7），

引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：8）。

本發(fā)明采用多重?zé)晒夥治龅姆椒▽?duì)CAV、MDV、REV、IBDV進(jìn)行區(qū)分，故將上述引物作進(jìn)一步的修飾，以滿足相應(yīng)的操作要求。其中引物C1、M1、R1和B1的5’端連接有tag序列，所連接的tag序列分別為：

引物C1的tag序列為：5’-ATACTTTACAAACAAATAACACAC-3’ （SEQ ID NO：9）；

引物M1的tag序列為：5’-TACTTAAACATACAAACTTACTCA-3’ （SEQ ID NO：10）；

引物R1的tag序列為：5’-CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-3’ （SEQ ID NO：11）；

引物B1的tag序列為：5’-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-3’ （SEQ ID NO：12）；

另外，引物C2、M2、R2和B2的5’端還添加有生物素標(biāo)記。

實(shí)施例2 用于快速區(qū)分雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和傳染性法氏囊病毒的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?/p>

試劑盒包括以下組分：

（1）實(shí)施例1所設(shè)計(jì)的的多重?zé)晒饷庖叻治鲆锝M；

（2）4種編碼不同熒光色的包含有anti-tag序列的熒光編碼微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與多重?zé)晒夥治鲆镏械膖ag序列互補(bǔ)配對(duì)；四種微球均購自luminex公司，其中CAV、MDV、REV和IBDV分別對(duì)應(yīng)的熒光編碼微球號(hào)為MTAG-A019、MTAG-A065、MTAG-A056和MTAG-015。

（3）鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物。

實(shí)施例3 快速區(qū)分雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和傳染性法氏囊病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測(cè)方法的建立

（1）CAV、MDV、REV和IBDV質(zhì)粒的構(gòu)建

用天根的核酸自動(dòng)抽取儀分別提取CAV、MDV、REV、IBDV病原的核酸（RNA/DNA），分別用實(shí)施例1所設(shè)計(jì)引物對(duì)C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠純化。用TaKaRa公司的試劑盒將純化后的cDNA連接至pMD-19T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定為陽性菌的菌落進(jìn)行質(zhì)粒抽提，送測(cè)序。

（2）質(zhì)粒PCR擴(kuò)增

用實(shí)施例1所設(shè)計(jì)引物對(duì)C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2分別對(duì)CAV、MDV、REV、IBDV引物進(jìn)行單重、四重PCR擴(kuò)增。

上游引物混合液的制備：將C1、M1、R1和B1以摩爾比1:1:1:1比例進(jìn)行混合；下游引物混合液的制備：將C2、M2、R2和B2以摩爾比1:1:1:1比例進(jìn)行混合。利用禽免疫抑制四種病原的特異性模板，以及CAV、MDV、REV、IBDV四重模板，對(duì)上述四種病毒的特應(yīng)性區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。其中四重模板的制備：將四種質(zhì)粒以體積比1:1:1:1的比例進(jìn)行混合。

PCR擴(kuò)增應(yīng)體系如下：

Premix Ex Taq 10μL

上游引物混合液 1μL

下游引物混合液 1μL

模板 1μL

ddH₂O 7μL

Total 20μL；

其中上下游引物的終濃度為2μM。

擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火25s，72℃延伸20s；循環(huán)35次；72℃終延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，其電泳圖如圖1所示。圖1中，M：DL2000 DNA marker，1：CAV，2：MDV，3：REV，4：IBDV，5：對(duì)CAV+MDV+REV+IBDV進(jìn)行的四重PCR，6：PCR blank（PCR空白對(duì)照）。

從圖1中可以看出，CAV的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為121bp，MDV的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為114bp，REV的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為153bp，IBDV的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為128bp。由于這四種病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小相近，所以四重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶無法分辨。

（3）將所得PCR產(chǎn)物與熒光編碼微球工作液、鏈霉親和素藻紅蛋白（SA-PE）工作液雜交，包括以下步驟：

分別包被有特異的anti-tag序列的4種微球，其中anti-tag序列能相應(yīng)地與CAV、MDV、REV和IBDV四種病毒引物上的tag序列互補(bǔ)配對(duì)。4種微球均購自luminex公司，具體的CAV、MDV、REV和IBDV分別對(duì)應(yīng)的熒光編碼微球號(hào)為MTAG-A019、MTAG-A065、MTAG-A056和MTAG-015。

熒光編碼微球工作液的制備：將2500個(gè)/μl熒光編碼微球用1.1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到1μl約含有125個(gè)/種熒光編碼微球。

SA-PE工作液制備：將1mg/ml SA-PE用1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到10μg/μl。

充分重懸熒光編碼微球工作液，每個(gè)樣品孔和背景孔加入微球工作液20μl，樣品孔中加入5μl PCR產(chǎn)物，背景孔中加入5μl PCR blank產(chǎn)物，再加入75μl的SA-PE工作液，充分混勻，于金屬加熱器中37℃孵育30min。

依照檢測(cè)儀Luminex 200儀器的說明將雜交后的50μl上述反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，雖然四重的擴(kuò)增產(chǎn)物無法用電泳分辨，但用檢測(cè)儀Luminex 200儀器讀取MFI值時(shí)，明顯分辯不同類型的病毒。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)（注：該判斷標(biāo)準(zhǔn)僅供參考，亦可對(duì)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整）如下：

最低檢測(cè)閾值（cutoff值）的確定：選取10頭健康雞組織樣品（每個(gè)樣品平行重復(fù)3次），分別讀取MFI值并計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的MIF值設(shè)定其為cutoff值。本發(fā)明所獲得cutoff值為482.3，因此將本發(fā)明的cutoff值定為500。只有檢測(cè)樣品的MFI值高于500時(shí)，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才能進(jìn)行有效分析。

待測(cè)樣本的分析判斷：1）當(dāng)待測(cè)樣本的MFI值＞500時(shí)，判斷為陽性樣本；2）待測(cè)樣本的MFI值≤500時(shí)，判斷為陰性，需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)或采取其他檢測(cè)方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

實(shí)施例4 CAV、MDV、REV和IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測(cè)特異性實(shí)驗(yàn)

分別用雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、雞傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒核酸作為模板進(jìn)行多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測(cè)。

1）從樣品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸為模板，用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物對(duì)C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；

RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

5×buffer 4μL

dNTP 0.8μL

上游引物混合液 2μL

酶 0.8μL

模板 1μL

ddH₂O 11.4μL

Total 20μL；

步驟2）中RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循環(huán)35次；72℃ 10min，4℃ 保存。

3）將上步擴(kuò)增產(chǎn)物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行雜交；

雜交的反應(yīng)體系和程序?yàn)椋?/p>

4種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；37℃孵育30min。

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，確定其病毒的類型。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，只有雞傳染性貧血病病毒、雞馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、雞傳染性法氏囊病毒為陽性，其他的均為陰性，說明檢測(cè)體系特異性良好。

實(shí)施例5：CAV、MDV、REV、REO和IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測(cè)靈敏性實(shí)驗(yàn)

將制備的質(zhì)粒進(jìn)行定量，采用10倍稀釋法進(jìn)行稀釋，稀釋至10¹copies/μl，用上述建立的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ㄟM(jìn)行檢測(cè)。CAV、MDV、REV和IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測(cè)靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了IBDV的靈敏度檢出限為10⁴copies/ul，其他的靈敏度檢出限為10³copies/ul。

實(shí)施例6：樣品的檢測(cè)

從雞場(chǎng)采集的脾、腎、肝等樣品，用天根核酸自動(dòng)抽取儀提取RNA/DNA，使用Qiagen的RT-PCR kit進(jìn)行擴(kuò)增，以RNA/DNA作為模板，采用上述CAV、MDV、REV和IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光編碼微球和SA-PE雜交，在Luminex 200檢測(cè)儀上讀數(shù)。具體步驟參照實(shí)施例3或?qū)嵤├?，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

本發(fā)明方法的檢測(cè)結(jié)果表明，樣品4F、4S、4XW、4W和46為陰性樣本；12為傳染性法氏囊病毒樣品；26為雞傳染性貧血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒兩重混合感染樣品；11為雞傳染性貧血病病毒、馬立克病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒三重混合感染樣品；14、34、22、43、32、24、23為雞傳染性貧血病病毒與馬立克病毒兩重混合感染樣品；其他的均為雞傳染性貧血病病毒單獨(dú)感染樣品。通過測(cè)序分析，結(jié)果一致。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所

<120> 一種快速區(qū)分CAV、MDV、REV、IBDV的多重?zé)晒饷庖叻治鲆?、試劑盒及?/p>

法

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgacatcgga ggagacag 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaagcggat agtcatagta ga 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccattccct cttctgcc 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctgagcgta aaccgtc 17

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gactgccttg tgactgct 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

actcccactg ttgtctaaat c 21

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgcggagcc ttctga 16

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

attagccctg accctgtg 18

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atactttaca aacaaataac acac 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tacttaaaca tacaaactta ctca 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttaaactct acttacttct aatt 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tacttcttta ctacaattta caac 24