本發(fā)明涉及一種熒光探針，特別涉及一種用于活細(xì)胞中RNA成像的雙光子熒光探針。

背景技術(shù)：

目前的熒光成像技術(shù)，尤其是雙光子熒光顯微成像技術(shù)，在實時監(jiān)測活細(xì)胞中生物分子的形態(tài)、多寡等方面得到了廣泛應(yīng)用。與激光掃描共聚焦顯微鏡相比，雙光子熒光顯微鏡具有高檢測靈敏度、大的穿透深度、圖像高保真、低的光毒性和光漂白性等優(yōu)勢，是生物活體組織成像的一個重要工具，獲得了生物、生命、醫(yī)學(xué)等學(xué)科研究者們的青睞。目前，商業(yè)化的熒光探針大多為針對激光掃描共聚焦顯微鏡開發(fā)的單光子熒光探針，其雙光子吸收截面較小，所需激發(fā)光的光強偏大，易造成生物樣品熱損傷。單光子熒光探針的不匹配及雙光子熒光探針的缺乏大大限制了雙光子熒光顯微鏡的應(yīng)用推廣。為適應(yīng)當(dāng)前形勢，開發(fā)有效的適用于雙光子熒光顯微鏡的新型熒光探針十分重要，各種能夠成像活細(xì)胞內(nèi)不同靶標(biāo)的雙光子熒光探針已成為研究熱點。

在細(xì)胞內(nèi)的各種生命物質(zhì)中，核糖核酸(RNA)是重要的生物大分子，其在催化生物反應(yīng)、基因表達(dá)調(diào)控等生物學(xué)過程中扮演著極其重要的角色。RNA主要存在于細(xì)胞核的核仁區(qū)和細(xì)胞質(zhì)中，其定位、活動、多寡、形態(tài)等包含著重要的生命科學(xué)信息，這些信息與醫(yī)學(xué)診斷和治療息息相關(guān)。因此，核仁和細(xì)胞質(zhì)中的RNA成像對生物化學(xué)、生物醫(yī)藥、生命科學(xué)等具有十分重要的意義。與眾多的商業(yè)化探針(如DNA探針)相比，RNA探針非常少。目前只有分子探針公司(Molecular Probes Co.)提供一個可用RNA成像的探針“SYTO RNA-Select”，但該探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)式仍未對外公布。專利CN103265947A、CN103275699A分別提供了一種用于活細(xì)胞成像的RNA熒光探針，但該探針未能實現(xiàn)雙光子熒光成像。因此，在活細(xì)胞RNA熒光成像檢測方面，依然缺乏優(yōu)良的雙光子熒光探針，這一現(xiàn)狀亟待解決。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述不足，而提供一種RNA成像的雙光子熒光探針，該探針具有膜通透性好、顯色強、光穩(wěn)定性好的特點。

本發(fā)明的另一目的是提供該雙光子熒光探針在標(biāo)記或顯示RNA在活細(xì)胞中分布的應(yīng)用。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種RNA成像的雙光子熒光探針，結(jié)構(gòu)通式如(I)所示：

其中：R為氫、烷基、羥烷基或醚基；X為溴或碘。

上述RNA成像的雙光子熒光探針中：所述R優(yōu)選氫、C_1-12的烷基、C_1-12的羥烷基或乙醚基；進(jìn)一步優(yōu)選甲基、乙基、丁基、十二烷基或乙醚基。

所述的RNA成像的雙光子熒光探針最優(yōu)選2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(簡稱為DI)。

上述RNA成像的雙光子熒光探針的制備方法：

先鹵代反應(yīng)在2-甲基苯并咪唑氮上引入R基，并獲得苯并咪唑鹽，然后利用苯并咪唑鹽與對二甲氨基苯甲醛knoevenagel反應(yīng)得到最終產(chǎn)物。

所述的2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)的制備反應(yīng)式如圖1所示。

上述RNA成像的雙光子熒光探針在標(biāo)記或顯示RNA在活細(xì)胞中分布的應(yīng)用。

所述的細(xì)胞為HeLa細(xì)胞。

將本發(fā)明雙光子熒光探針應(yīng)用在HeLa細(xì)胞的染色，標(biāo)記后的雙光子熒光圖像顯示，在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)有明顯的熒光分布，明確提示所述探針能夠在活細(xì)胞中專一性成像細(xì)胞質(zhì)和核仁中的RNA，并在經(jīng)核糖核酸酶(RNase)消化實驗后的細(xì)胞進(jìn)行對比實驗后得到進(jìn)一步證實。SYTOX(R)藍(lán)色核酸染料(S-11348)是一種商業(yè)化成像壞死細(xì)胞核的發(fā)藍(lán)光的熒光染料，在利用本發(fā)明雙光子熒光探針與S-11348進(jìn)行對比試驗后，在沒有S-11348標(biāo)記的藍(lán)色熒光的活細(xì)胞中，本發(fā)明雙光子熒光探針發(fā)出了與S-11348熒光有明顯區(qū)別的熒光，這表明本發(fā)明所述雙光子熒光探針能成像活細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)的RNA。

用本發(fā)明雙光子熒光探針與S-11348進(jìn)行對比試驗后，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明雙光子熒光探針在活細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)域具有清晰的熒光成像，這表明本發(fā)明雙光子熒光探針具有好的膜通透性，能進(jìn)入活細(xì)胞并成像細(xì)胞質(zhì)和核仁的RNA。

本發(fā)明雙光子熒光探針染色HeLa細(xì)胞，在800納米激光持續(xù)輻照600秒后，仍能得到清晰的雙光子熒光成像照片，這表明其具有良好的雙光子光穩(wěn)定性。

本發(fā)明雙光子熒光探針是一類新型的RNA選擇性識別的雙光子熒光探針，該探針具有膜通透性好、顯色強、光穩(wěn)定性好的特點，可開發(fā)為RNA相關(guān)的生理、病理學(xué)研究用生物檢測試劑。

附圖說明

圖1為2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽的制備反應(yīng)式；

圖2為2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)的RNA雙光子熒光滴定圖；a為雙光子熒光光譜；b為最大熒光強度隨RNA與探針濃度比的變化圖；

圖3為2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)對活性Hela細(xì)胞進(jìn)行染色在800納米激光輻照下得到的雙光子熒光照片；a為雙光子熒光照片，收集熒光波長小于720納米；b為明場激光掃描的微分干涉顯微照片；c為a、b兩圖的合并圖(共定位圖)；

圖4為HeLa細(xì)胞經(jīng)核糖核酸酶(RNase)處理前后，用2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)細(xì)胞染色照片；a)為核糖核酸酶(RNase)處理前，用2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)染色HeLa細(xì)胞照片；b)為核糖核酸酶(RNase)處理前，明場激光掃描的微分干涉顯微照片；c)為核糖核酸酶(RNase)處理后，用2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)染色HeLa細(xì)胞照片；d)為核糖核酸酶(RNase)處理后，明場激光掃描的微分干涉顯微照片；

圖5為2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)與SYTOX(R)藍(lán)色核酸染料(S-11348)染色HeLa細(xì)胞的寬場熒光成像，藍(lán)光來自S-11348；a)為激發(fā)波長為510-550納米，收集的熒光波長大于 570nm得到的照片；b)為激發(fā)波長為426-450納米，收集的熒光波長為467-499納米得到的照片；c)為明場激光掃描的微分干涉顯微照片；d)為a,b和c圖的合并圖；

圖6為2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)染色HeLa細(xì)胞后，800納米激光持續(xù)輻照不同時間得到的雙光子熒光成像照片。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步說明。

實施例1：2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)的合成

將1.32g(10mmol)2-甲基苯并咪唑與2.83g(20mmol)碘甲烷溶解在50ml甲苯中，攪拌6小時，隨后回流反應(yīng)30分鐘，冷卻至室溫，過濾，乙醚洗滌，得到N-甲基-2-甲基苯并咪唑碘鹽。將0.288g(1mmol)N-甲基-2-甲基苯并咪唑碘鹽與0.149g(1mmol)對二甲氨基苯甲醛溶于20ml甲醇中，滴加3滴哌啶，回流反應(yīng)6h，無水乙醇洗滌，得到褐色粉末，產(chǎn)率77％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):7.987(d,J＝3.16Hz,2H),7.796(t,J＝6.6Hz,2H),7.721(s,1H),7.650(dd,J₁＝J₂＝3.08Hz,2H),7.213(d,J＝16.48,1H),6.822(d,J＝8.84,2H),4.107(s,6H),3.044(s,6H).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):152.79,149.60,147.58,132.46,131.06,126.40,122.19,112.99,112.15,101.18,33.29.HRMS(m/z):[M-I]⁺.Calcd for C₁₉H₂₂IN₃,292.3027；found,292.1806。

實施例2：2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二丁基-3H-苯并咪唑碘鹽的合成

將1.32g(10mmol)2-甲基苯并咪唑與3.68g(20mmol)碘丁烷溶解在50ml甲苯中，攪拌6小時，隨后回流反應(yīng)30分鐘，冷卻至室溫，過濾，乙醚洗滌，得到N-丁基-2-甲基苯并咪唑碘鹽。將0.372g(1mmol)N-丁基-2-甲基苯并咪唑碘鹽與0.149g(1mmol)對二甲氨基苯甲醛溶于20ml甲醇中，滴加3滴哌啶，回流反應(yīng)6h，無水乙醇洗滌，得到褐色粉末，產(chǎn)率70％。

實施例3：2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二乙基乙基醚-3H-苯并咪唑溴鹽的合成

將1.32g(10mmol)2-甲基苯并咪唑與3.06g(20mmol)2-溴乙基乙基醚溶解在50ml甲苯中，攪拌6小時，隨后回流反應(yīng)30分鐘，冷卻至室溫，過濾，乙醚洗滌，得到N-乙基乙基醚-2-甲基苯并咪唑溴鹽。將0.404g(1mmol)N-乙基乙基醚-2-甲基苯并咪唑溴鹽與0.149g(1mmol)對二甲氨基苯甲醛溶于20ml甲醇中，并滴加3滴哌啶，回流反應(yīng)7h，無水乙醇洗滌，得到褐色粉末，產(chǎn)率65％。

效果測試

(一)2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)的RNA雙光子熒光滴定：

固定2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)在Tris-HCl緩沖溶液(pH＝7.2，Tris和KCl 100mmol/L)中的濃度，逐漸加入RNA，在800納米激光輻照光下得到2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)的雙光子熒光滴定譜圖，如圖2所示。結(jié)果表明，隨著RNA的不斷加入，本發(fā)明所述探針的雙光子熒光強度先是急劇增大，而后增大幅度放緩。這表明本發(fā)明的探針對RNA具有明顯的熒光響應(yīng)。

(二)HeLa細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞株貼壁培養(yǎng)于內(nèi)含10％(v/v)胎牛血清和少量青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO₂(v/v)的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到對數(shù)期，接片培養(yǎng)：將蓋玻片于鉻酸洗液中浸泡30分鐘，清水、超純水洗凈，烘干，滅菌后放入一次性35mm無菌培養(yǎng)皿中；將100mL培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基小心地倒出，細(xì)胞用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4)洗2遍，用l mL 0.25％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶液消化2～3分鐘，倒掉胰蛋白酶液，加入少量新鮮培養(yǎng)基吹打均勻成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計數(shù)后，留下合適密度的細(xì)胞，將培養(yǎng)基加至所需體積吹打均勻，而后將細(xì)胞接種至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞爬片生長。24～48h后，生長至細(xì)胞密度達(dá)50％～70％，待染色。

(三)2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)對HeLa細(xì)胞的染色觀察：

將2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)配成1mM DMSO母液，染色時用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4)稀釋至5μM。將接種好的細(xì)胞在5μM的探針分子溶液中，37℃條件下孵育30min，用PBS洗去未結(jié)合的多余染液，細(xì)胞生長面朝下蓋在載玻片上；然后把樣品置于載物臺上熒光成像。結(jié)果見圖3，雙光子熒光圖像顯示在細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)有明顯的熒光分布，表明本發(fā)明的探針能夠在活細(xì)胞中專一性的成像細(xì)胞質(zhì)和核仁中的RNA。

(四)2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)探針對HeLa細(xì)胞、RNase消化處理后的HeLa細(xì)胞的染色觀察：

固定細(xì)胞制備：將培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞浸泡于4％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液30分鐘，或者用-20℃甲醇固定15分鐘，而后用0.5％Triton X-100室溫通透2分鐘，得到待染色固定細(xì)胞。

取兩組上述固定細(xì)胞，用濃度為5μM的2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)探針溶液在CO₂培養(yǎng)箱中孵化染色30分鐘。用PBS對兩組細(xì)胞沖洗2遍，向其中一組加入25mg/mL DNase-Free RNase(GE)(核糖核酸酶)，然后兩組細(xì)胞在37℃、5％CO₂條件下孵育2小時。隨后，用PBS沖洗2次，在寬場顯微鏡下觀察、記錄兩組細(xì)胞中熒光分布及亮度變化等。

結(jié)果見圖4，未經(jīng)RNase消化處理的HeLa細(xì)胞的熒光主要集中在細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)域；而經(jīng)RNase消化處理后的HeLa細(xì)胞的熒光集中到了細(xì)胞核區(qū)域，其細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)域基本沒有熒光。由于RNase僅能水解掉細(xì)胞中的RNA，因此，該實施例可以證實本發(fā)明的探針能夠選擇性成像細(xì)胞中的RNA。

(五)2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)與SYTOX(R)藍(lán)色核酸染料(S-11348)共染色HeLa細(xì)胞的觀察：

將培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞用濃度為5μM的2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)熒光探針在37℃條件下染色30分鐘。然后用PBS沖洗2遍，再用濃度為5μM的S-11348在培養(yǎng)箱中對HeLa細(xì)胞染色30分鐘。最后將細(xì)胞取出，在寬場顯微鏡下觀察、記錄細(xì)胞中熒光分布及亮度變化等。

結(jié)果見圖5，S-11348是一商業(yè)化的成像壞死細(xì)胞核的發(fā)藍(lán)光的熒光染料，在利用本發(fā)明所述熒光探針與S-11348進(jìn)行對比試驗后，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述的熒光探針在活細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)域具有清晰的熒光成像，這表明本發(fā)明所述的熒光探針具有好的膜通透性，能進(jìn)入活細(xì)胞并成像細(xì)胞質(zhì)和核仁的RNA。

(六)2-[2-(4-二甲基胺基-苯基)-乙烯基]-1,3-二甲基-3H-苯并咪唑碘鹽(DI)染色HeLa細(xì)胞雙光子光穩(wěn)定性觀察：

按照(三)得到本發(fā)明所述探針染色HeLa細(xì)胞的雙光子熒光圖像，用800納米激光持續(xù)輻照，在雙光子熒光顯微鏡下觀察、記錄細(xì)胞中熒光分布及亮度變化等。結(jié)果見圖6，本發(fā)明所述熒光探針染色HeLa細(xì)胞，在800納米激光持續(xù)輻照600秒后，仍能得到清晰的雙光子熒光成像照片，這表明本發(fā)明所述熒光探針具有良好的雙光子光穩(wěn)定性。

以上是結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的詳細(xì)介紹，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。