用于熒光顯微鏡以檢測來自多種熒光染料的光發(fā)射的系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及熒光顯微鏡，更具體地，涉及用于檢測從用至少四種預(yù)定熒光染料標(biāo)記的樣本發(fā)射的熒光的方法，其中，至少四種不同的熒光染料包括形成熒光染料對的第一熒光染料和第二熒光染料，該熒光染料對被選擇為形成第一熒光染料的Cy3熒光染料類似物和形成第二熒光染料的594熒光染料類似物，或者熒光染料對被選擇為形成第一熒光染料的425熒光染料類似物和形成第二熒光染料的488熒光染料類似物。根據(jù)本發(fā)明，通過以下來實(shí)現(xiàn)對來自至少四種預(yù)定熒光染料的熒光的檢測：選擇針對第二熒光染料的激發(fā)波長間隔以使得對第一熒光染料的激發(fā)減少；以及選擇第一熒光染料的發(fā)射波長范圍以使得對來自第二熒光染料的光發(fā)射的滲漏減少。
【專利說明】
用于黃光顯微鏡從檢測來自多種黃光染料的光發(fā)射的系統(tǒng)和 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明總體上設(shè)及巧光顯微鏡，更具體地，設(shè)及改進(jìn)用于顯微鏡系統(tǒng)的方法和相 應(yīng)的巧光顯微鏡系統(tǒng)，其用于允許分離檢測來自用多種不同的巧光染料標(biāo)記的樣本的光發(fā) 射。
【背景技術(shù)】
[0002] 巧光顯微鏡是用于通過對來自位于樣本上或位于樣本中的目標(biāo)物質(zhì)(諸如有機(jī)分 子或無機(jī)化合物）的巧光或憐光發(fā)射進(jìn)行成像來研究樣本的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的光學(xué)顯微鏡技 術(shù)。例如，可W用一種或多種不同的巧光染料(也被稱為巧光團(tuán)）來標(biāo)記樣本，當(dāng)分子吸收光 時(shí)通過各種方式隨后處置其增大的能量，運(yùn)些方式之一是發(fā)射具有更長波長的光。
[0003] 當(dāng)用紫外光、可見光、遠(yuǎn)紅光、近紅外光或紅外光照射運(yùn)樣的分子時(shí)，運(yùn)樣的分子 會(huì)經(jīng)歷分子吸收一定量的能量的電子躍遷，并且電子從其在基態(tài)下占據(jù)的軌道被激發(fā)至另 一較高能量的軌道。被照射的分子吸收光的波長光譜被稱為吸收光譜或激發(fā)光譜。大多數(shù) 激發(fā)狀態(tài)是短暫的，并且所吸收的能量的主要去向是重新發(fā)射如憐光或巧光那樣的光。被 照射的分子發(fā)射光的波長光譜被稱為發(fā)射光譜。有機(jī)染料和無機(jī)染料的巧光特性為許多分 析方法提供了基礎(chǔ)，運(yùn)些分析方法之一是巧光免疫檢驗(yàn)法（immunofluorescence )，其使用 巧光染料綴合的抗體來檢測蛋白質(zhì)和其他分子。
[0004] 通常用于運(yùn)樣的分析的示例性巧光顯微鏡包括:光源；用于將光傳送至激發(fā)光路 中的光學(xué)器件;激發(fā)濾光器，用于選擇要被傳送至對象的一種或多種激發(fā)波長帶；分色鏡 (die虹oic mirror),被配置成將激發(fā)波長帶反射至樣本、同時(shí)將來自樣本的巧光發(fā)射波長 透射至發(fā)射光路;發(fā)射濾光器，用于阻擋被透射至發(fā)射光路中的任何雜散激發(fā)光波長；W及 用于將巧光發(fā)射波長傳送至眼部或者傳送至諸如攝像裝置的圖像捕獲裝置的光學(xué)器件。
[0005] 通常，所有的現(xiàn)代顯微鏡都設(shè)置有多種可快速切換的"濾光塊(filter cube)"，每 個(gè)濾光塊專用于特定巧光染料(或一組相似的巧光染料)并且包括一組匹配的激發(fā)濾光器、 分色鏡W及發(fā)射濾光器?？蒞通過連續(xù)地、一次一個(gè)地通過匹配的濾光器組進(jìn)行切換來容 易地實(shí)現(xiàn)對不同巧光染料的分離且連續(xù)的可視化。
[0006] 對均具有分離的激發(fā)/發(fā)射波長光譜的不同巧光染料的運(yùn)樣依次的可視化可W例 如用于通過使用巧光蛋白（例如，GFP)或巧光染料標(biāo)記的抗體(所謂的巧光免疫檢驗(yàn)法)來 展現(xiàn)在組織內(nèi)的兩種（或更多種）蛋白質(zhì)的空間位置，或者通過使用巧光染料標(biāo)記的核酸 (探針)來檢測細(xì)胞中的兩種(或更多種)DNA突變。
[0007] 在運(yùn)樣的研究中，通常存在組合許多通道W獲得信息的期望。例如，在生物學(xué)研究 中，通常通過使用標(biāo)記有不同巧光染料的細(xì)胞特有的抗體來使組織樣本內(nèi)的若干不同的細(xì) 胞類型可視化。然而，因?yàn)閺牟煌那晒馊玖蠞B漏的光發(fā)射，因此當(dāng)今在同一樣本內(nèi)允許明 顯地分離僅有限數(shù)量的巧光團(tuán)?？蒞通過補(bǔ)償（即，對來自部分交疊的巧光染料光譜的信號(hào) 的添加進(jìn)行補(bǔ)償?shù)幕谟?jì)算機(jī)的計(jì)算)來解決滲漏的問題(還被稱為溢出偽影(spill-over adifact))。然而，運(yùn)在研究或?qū)嶒?yàn)室醫(yī)學(xué)中是不常規(guī)使用的復(fù)雜處理。
[0008] 因此，會(huì)期望提供一種被配置用于對來自多于四種不同的巧光染料的光發(fā)射進(jìn)行 簡化分離并且對來自多于四種不同的巧光染料的光發(fā)射進(jìn)行改進(jìn)的檢測的方法和顯微鏡 系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，W上問題是通過用于使用包括光源裝置的顯微鏡系統(tǒng)來 檢測從用多種預(yù)定巧光染料標(biāo)記的樣本發(fā)射的巧光的方法來至少部分地減輕的，其中，該 方法包括W下步驟:選擇被配置成發(fā)射在可見光譜內(nèi)的光的至少四種不同的巧光染料，至 少四種不同的巧光染料包括形成巧光染料對的第一巧光染料和第二巧光染料;選擇針對至 少四種不同的巧光染料的激發(fā)波長間隔，其中，選擇針對第二巧光染料的激發(fā)波長間隔W 使得對第一巧光染料的激發(fā)減少;將顯微鏡系統(tǒng)的濾光器裝置配置成選擇性地允許在與至 少四種不同的巧光染料的發(fā)射波長間隔匹配的發(fā)射波長間隔內(nèi)的光通過，其中，選擇針對 第一巧光染料的發(fā)射波長間隔W減少從第二巧光染料滲漏的光發(fā)射;順序地發(fā)射在所選擇 的激發(fā)波長間隔的至少一部分內(nèi)的光；W及檢測從樣本發(fā)射的透過濾光器裝置的光，其中， 巧光染料對被選擇為形成第一巧光染料的切3類巧光染料和形成第二巧光染料的594類巧 光染料，或者巧光染料對被選擇為形成第一巧光染料的425類巧光染料和形成第二巧光染 料的488類巧光染料。還可W通過使用具有不同斯托克位移的兩種巧光染料來形成巧光染 料對。斯托克位移是激發(fā)波長間隔與發(fā)射波長間隔之間的位移。W運(yùn)種方式，兩種巧光染料 可W利用相同的激發(fā)波長間隔來激活，并且通過兩種不同的發(fā)射濾光器來分離，運(yùn)兩種不 同的發(fā)射濾光器被配置成使得選擇針對第一巧光染料的發(fā)射波長間隔W減少從第二巧光 染料滲漏的光發(fā)射，W及選擇針對第二巧光染料的發(fā)射波長間隔W減少從第一巧光染料滲 漏的光發(fā)射。由于一個(gè)發(fā)光二極管(下文進(jìn)一步討論的LED)可W用于激活兩種巧光染料，因 此運(yùn)會(huì)例如當(dāng)使用Lm)來替代激發(fā)濾光器來激活巧光染料時(shí)是有益的。在優(yōu)選實(shí)施例中，可 W在巧光染料對之上添加斯托克位移大的巧光染料，從而形成巧光染料Ξ聯(lián)體(triplet)。 運(yùn)可W例如利用與425/488對組合的化rCP來實(shí)現(xiàn)。
[0010] 本發(fā)明基于W下理解:通過解決分離從用第一巧光染料和第二巧光染料標(biāo)記的樣 本發(fā)射的巧光信號(hào)的主要問題，優(yōu)點(diǎn)將如下，即減小了還使得能夠分離出自第Ξ巧光染料 和第四（不同的）巧光染料的另外的巧光信號(hào)的復(fù)雜度，運(yùn)限于W下情況:巧光染料發(fā)射在 可見光譜內(nèi)（例如，通常在400nm至640nm的范圍內(nèi)）的光并且第一巧光染料和第二巧光染料 分別是為切3類巧光染料和594類巧光染料的巧光染料組合/對，或者第一巧光染料和第二 巧光染料分別是為425類巧光染料和488類巧光染料的巧光染料組合/對。根據(jù)本發(fā)明，運(yùn)是 通過W下獲得的:選擇針對第二巧光染料的激發(fā)波長間隔W使得對第一巧光染料的激發(fā)減 少；W及選擇針對第一巧光染料的發(fā)射波長間隔W使得從第二巧光染料滲漏的光發(fā)射減 少。
[0011] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可W允許對至少四種巧光染料的信號(hào)分離。然而，每個(gè)樣本不 必一定在任何給定時(shí)間處用至少四種巧光染料來標(biāo)記。因此，借助于本發(fā)明使可W分離的 至少四種巧光染料可用，但是運(yùn)至少四種巧光染料不一定"同時(shí)"全部順序地被激發(fā)，例如， 在一些實(shí)施例中，可W激發(fā)至少四種巧光染料中的僅一種、兩種或Ξ種巧光染料，但是顯微 鏡具有分離來自至少四種巧光染料中的任何巧光染料的信號(hào)的能力。
[0012]關(guān)于W上所討論的巧光染料對之一，術(shù)語乂y3類巧光染料"和巧94類巧光染料"應(yīng) 當(dāng)在其最廣泛的意義上被解釋(參見圖6,例如關(guān)于具有類似激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的巧光染 料），包括具有類似的激發(fā)/發(fā)射光譜的任何有機(jī)或無機(jī)化合物。應(yīng)當(dāng)注意，列表是非排他性 的，并且目前和將來的另外的等同巧光染料可W被預(yù)期并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[001引關(guān)于W上所討論的巧光染料對中的另一個(gè)，術(shù)語"425類巧光染料"和"488類巧光 染料"應(yīng)當(dāng)在其最廣泛的意義上被解釋(參見圖6,例如關(guān)于具有相似激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 的巧光染料），包括具有類似激發(fā)/發(fā)射光譜的任何有機(jī)或無機(jī)化合物。
[0014] 此外，基于分子復(fù)雜性和合成方法，通用術(shù)語"巧光染料"應(yīng)當(dāng)被廣泛地解釋，包括 基于蛋白質(zhì)和膚、少量有機(jī)化合物、合成的低聚物和聚合物或者多組分體系、本領(lǐng)域公知的 表達(dá)的任何類型的巧光染料?；趹?yīng)用，所使用的巧光染料的類型可W不同。也就是說，在 非活體樣本(non-live sample)中，通常期望選擇耐光的巧光染料，而關(guān)于例如"活體成像" 應(yīng)用(包括活體樣本(live sample))，通常需要選擇具有例如無毒的特征的巧光染料。與本 發(fā)明方法有關(guān)的任何應(yīng)用會(huì)是可行的。
[0015] 分離來自至少四種巧光染料的巧光信號(hào)在巧光顯微鏡領(lǐng)域內(nèi)具有非常大的優(yōu)點(diǎn)， 具體是因?yàn)槠湓试S"篩查"少量組織樣本中的一大組蛋白質(zhì)。此外，其實(shí)現(xiàn)了先進(jìn)的共存分 析，其中，可W在同一樣本內(nèi)可視化若干蛋白質(zhì)(例如，對于多色分析）。此外，運(yùn)大大簡化了 用戶對巧光顯微鏡的使用，因?yàn)樗麄兛蒞選擇用濾光器組可W分離的巧光染料中的任何巧 光染料來標(biāo)記樣本，而無需考慮關(guān)于潛在的滲漏假象。對巧光信號(hào)的分離還可W在除顯微 鏡之外的其他巧光讀取系統(tǒng)中具有很大的進(jìn)步，其他巧光讀取系統(tǒng)為例如用于免疫印跡 (western blot)、PCR和化ISA的分光光度計(jì)。
[0016] 該方法優(yōu)選地還包括用至少四種不同的巧光染料標(biāo)記樣本的步驟。目前存在可用 的多種不同的標(biāo)記樣本的方法，標(biāo)記方法取決于樣本的類型W及期望標(biāo)記樣本的哪個(gè)部 分。相應(yīng)地W及如技術(shù)人員所理解的那樣，可W例如用巧光染料標(biāo)記的抗體、細(xì)胞膜染料、 DNA結(jié)合的巧光染料、巧光染料標(biāo)記的核酸探針、W及巧光蛋白質(zhì)來標(biāo)記樣本，W收集關(guān)于 來自人、動(dòng)物、植物和微生物的蛋白質(zhì)、DNA、細(xì)胞和組織的生物學(xué)和病理學(xué)的信息。
[0017] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，選擇了五種不同的巧光染料并且相應(yīng)地修改本方法。 因此，在運(yùn)樣的實(shí)施例中，一個(gè)巧光染料對被選擇為形成第一巧光染料的切3類巧光染料和 形成第二巧光染料的594類巧光染料，W及另一巧光染料對被選擇為形成第一巧光染料的 425類巧光染料和形成第二巧光染料的488類巧光染料。
[001引另外，還可W包括發(fā)射在遠(yuǎn)紅光光譜內(nèi)（例如，通常在640皿至680皿的范圍內(nèi)）的 光的至少一種另外附加的巧光染料，從而使得能夠分離一個(gè)另外的巧光信號(hào)。更進(jìn)一步地， 還可W包括發(fā)射在近紅外光譜內(nèi)（例如，通常大于680nm)的光的至少一種另外的巧光染料。 運(yùn)些附加的巧光染料也可W單獨(dú)地包括或者替代地分離W上所討論的兩種"可見"光譜巧 光染料對。
[0019] 在優(yōu)選實(shí)施例中，其余的巧光染料還選自：DAPI類巧光染料或BV421類巧光染料、 425類巧光染料、488類巧光染料、切3類巧光染料、594類巧光染料、647/660/680類巧光染料 或化rCP類巧光染料W及750/790類巧光染料。
[0020] 選擇具有在遠(yuǎn)紅光/近紅外光譜內(nèi)的發(fā)射的另外的巧光染料會(huì)使得可W仍使用紫 外光和可見光的照明光源(諸如，隸燈或金屬面化物燈(可能在添加用于在紅外光譜內(nèi)進(jìn)行 激發(fā)的光源的情況下））來將多達(dá)五種、六種或甚至屯種巧光信號(hào)彼此分離（即，在不包括如 上文所討論的進(jìn)一步基于計(jì)算機(jī)的處理的情況下）。在圖6中示出了針對647/660/680/700/ 750和790的遠(yuǎn)紅光/近紅外W及紅外類巧光染料的示例。
[0021] 使用發(fā)射具有高能量的、還大于620nm的光的光源(諸如氣燈或LED)使得能夠形成 發(fā)射在遠(yuǎn)紅光/近紅外光譜中的光的巧光染料對，該巧光染料對被選擇為形成第一巧光染 料的647類巧光染料和形成第二巧光染料的700類巧光染料。如W上針對可見光巧光染料對 所討論的那樣，選擇針對第二巧光染料的激發(fā)波長間隔W使得對第一巧光染料的激發(fā)減 少，W及選擇針對第一巧光染料的發(fā)射波長間隔W減少從第二巧光染料滲漏的光發(fā)射。優(yōu) 點(diǎn)將如下:減小了還使得能夠分離出自第Ξ巧光染料和第四巧光染料的另外的巧光信號(hào)的 復(fù)雜度，運(yùn)限于巧光染料發(fā)射在通常大于750nm的上紅外光譜處的光的情況。
[0022] 在優(yōu)選實(shí)施例中，使用發(fā)射在紫外、可見光、遠(yuǎn)紅光、近紅外和紅外光譜處具有高 能量的光的（多個(gè))照明源，其余的巧光染料還選自：DAPI類巧光染料或BV421類巧光染料、 425類巧光染料、488類巧光染料、切3類巧光染料、594類巧光染料、647類巧光染料、700類巧 光染料W及790類巧光染料。在運(yùn)之上可W添加具有很大的斯托克位移的巧光染料。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于分離從用多種預(yù)定巧光染料標(biāo)記的樣本 發(fā)射的巧光信號(hào)的顯微鏡系統(tǒng)，該顯微鏡系統(tǒng)包括:光源裝置，被配置成發(fā)射光;導(dǎo)光裝置， 用于將光從光源裝置引導(dǎo)至樣本W(wǎng)激發(fā)多種預(yù)定巧光染料;濾光器裝置，被配置成允許分 離由標(biāo)記樣本的多種預(yù)定巧光染料發(fā)射的巧光；W及檢測裝置，被配置用于接收透過濾光 器裝置的光，其中，顯微鏡濾光器組可W分離來自發(fā)射在可見光譜內(nèi)的光的至少四種不同 的巧光染料的信號(hào)，運(yùn)至少四種不同的巧光染料包括形成巧光染料對的第一巧光染料和第 二巧光染料，光源裝置被配置成順序地發(fā)射在至少四種不同的激發(fā)波長間隔內(nèi)的光，選擇 針對第二巧光染料的激發(fā)波長間隔W減少對第一巧光染料的激發(fā)，濾光器裝置包括至少四 個(gè)匹配的濾光器，該至少四個(gè)匹配的濾光器被配置成允許在至少四種不同的發(fā)射波長間隔 內(nèi)的光通過，選擇針對第一巧光染料的發(fā)射波長間隔W減少從第二巧光染料滲漏的光發(fā) 射，W及巧光染料對被選擇為形成第一巧光染料的切3類巧光染料和形成第二巧光染料的 594類巧光染料，或者巧光染料對被選擇為形成第一巧光染料的425類巧光染料和形成第二 巧光染料的488類巧光染料。
[0024] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，檢測裝置包括圖像捕獲裝置，該圖像捕獲裝置被配置 成捕捉樣本的巧光的圖像。運(yùn)樣的圖像捕獲裝置可W是連接至計(jì)算機(jī)的攝像裝置。在順序 地捕獲并存儲(chǔ)與由每種巧光染料發(fā)射的光相關(guān)的多個(gè)圖像時(shí)，可W將圖像"重疊"在彼此 "之上"，例如W提供對樣本的多色分析。應(yīng)當(dāng)注意，顯微鏡系統(tǒng)/攝像裝置/連接的計(jì)算機(jī)可 W被配置用于"活體成像"，其中，捕獲樣本的連續(xù)的(順序的）圖像流(例如，視頻流），即，通 過"隨著時(shí)間的推移"獲取針對每種巧光染料的不止一個(gè)圖像。
[0025] 優(yōu)選地，光源裝置包括紫外光和可見光源W及被配置成允許在至少四種不同的激 發(fā)波長間隔內(nèi)的光通過的至少四種匹配的濾光器。光源可W例如是隸燈、金屬面化物燈或 氣弧燈。其他合適的光源自然是可行的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在典型應(yīng)用中，至少四種匹 配的濾光器Γ激發(fā)濾光器"）被配置成允許在至少四種不同的激發(fā)波長間隔內(nèi)的光通過，并 且濾光器裝置包括被配置成允許在至少四種不同的發(fā)射波長間隔（"發(fā)射間隔"）內(nèi)的光通 過的至少四種匹配的濾光器，至少四種匹配的濾光器被分別布置在四個(gè)分離的"濾光塊" 中，還包括分色鏡。如果使用斯托克位移大的巧光染料，則兩種不同的巧光染料可W共享激 發(fā)間隔(或發(fā)射濾光器間隔）。因此，在運(yùn)樣的實(shí)現(xiàn)方式中，濾光器裝置可W被看作包括特別 適于使得能夠W上文討論的方式分離至少四種巧光染料的四種不同的濾光塊。此外，在運(yùn) 樣的實(shí)現(xiàn)方式中，發(fā)明構(gòu)思可用作"改造"應(yīng)用，其中，發(fā)明構(gòu)思被選擇用于修改可用的顯微 鏡系統(tǒng)，其中，設(shè)置了使得能夠執(zhí)行本發(fā)明構(gòu)思的新的"一組"濾光塊。
[0026] 然而，在替選實(shí)施例中，光源裝置可W包括多個(gè)發(fā)光二極管化ED)。在運(yùn)樣的實(shí)施 例中，由于LED可W被選擇為是窄帶的并且被配置成固有地發(fā)射在每個(gè)具體選擇的激發(fā)波 長內(nèi)的光，因此可不一定必需包括特定激發(fā)濾光器。如果使用了 LED,則其可W有益于形成 基于不同的斯托克位移的巧光染料對，其中，由一個(gè)Lm)激活在該對中的兩種巧光染料。運(yùn) 會(huì)減小激活一組巧光染料所需的L邸的數(shù)量。
[0027] 當(dāng)研究所附權(quán)利要求和W下描述時(shí)，本發(fā)明的進(jìn)一步特征和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。技 術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，可W組合本發(fā)明的不同的特征，W產(chǎn)生與 下文中所描述的實(shí)施例不同的實(shí)施例。
【附圖說明】
[0028] 根據(jù)W下詳細(xì)描述W及附圖，將容易理解本發(fā)明的各個(gè)方面，包括本發(fā)明的特定 特征和優(yōu)點(diǎn)，在附圖中：
[0029] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性顯微鏡系統(tǒng)；
[0030] 圖2a至圖2c圖示了用于顯微鏡系統(tǒng)的替選濾光器配置；
[0031] 圖3a示出了根據(jù)本發(fā)明的針對所應(yīng)用的多種不同的巧光染料的激發(fā)/發(fā)射圖，W 及圖3b至圖3d示意性地圖示了根據(jù)本發(fā)明的巧光染料類似物設(shè)置的一些變型；
[0032] 圖4a至圖4c示出了具體濾光器配置的不同示例；
[0033] 圖5是示出了根據(jù)本發(fā)明的用于檢測來自被標(biāo)記的樣本的巧光的方法步驟的流程 圖，W及
[0034] 圖6是示出具有類似的激發(fā)光譜或發(fā)射光譜的巧光染料(巧光染料類似物）的示例 的表。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 現(xiàn)在，在下文中將參照附圖更全面地描述本發(fā)明，在附圖中，示出了本發(fā)明的當(dāng)前 優(yōu)選實(shí)施例。然而，本發(fā)明可許多不同的形式實(shí)現(xiàn)并且不應(yīng)解釋為限于本文中所闡述 的實(shí)施例；而是運(yùn)些實(shí)施例是為了透徹性和完整性而提供的，并且將本發(fā)明的范圍充分地 傳達(dá)給技術(shù)人員。貫穿全文相同附圖標(biāo)記指代相同元件。
[0036] 現(xiàn)在參照附圖并且具體地參照圖1，描繪了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的顯微鏡系 統(tǒng)100。顯微鏡系統(tǒng)100在操作中用于對布置在顯微鏡臺(tái)104上的樣本102進(jìn)行成像。樣本104 被標(biāo)記有多種不同的巧光染料，運(yùn)多種不同的巧光染料吸收在激發(fā)波長處的光并且響應(yīng)于 該光而發(fā)巧光，從而發(fā)射在比激發(fā)波長長的發(fā)射波長處的光。
[0037] 發(fā)射在紫外光譜和可見光譜內(nèi)的光（即，通常在350nm至620nm的范圍的強(qiáng)發(fā)射)的 光源106(諸如隸燈或金屬面化物燈)生成在巧光染料的激發(fā)波長處的光，并且光源106禪合 至光纖108,該光纖108將激發(fā)光束110從光源106傳導(dǎo)至濾光塊112。在一些實(shí)施例中，從光 源106發(fā)射的光直接傳遞至濾光塊112而不由光纖傳導(dǎo)。在其他實(shí)施例中，激發(fā)光束110在到 達(dá)濾光塊112之前通過光學(xué)元件，諸如透鏡和光圈。激發(fā)光束110進(jìn)入被布置在顯微鏡系統(tǒng) 100的轉(zhuǎn)臺(tái)（未示出）中的濾光塊112。轉(zhuǎn)臺(tái)被設(shè)置用于使多個(gè)不同的濾光塊能夠順序地定位 在光源106與樣本102之間的光軸中。
[0038] 濾光塊112包括帶通激發(fā)濾光器114,該帶通激發(fā)濾光器114接收來自光纖108的激 發(fā)光束110并且僅傳送激發(fā)光束110的具有在用于標(biāo)記樣本102的巧光染料之一的激發(fā)波長 間隔內(nèi)的波長間隔的一部分。激發(fā)光束110透過激發(fā)濾光器114并且由分色鏡116接收，該分 色鏡116反射在巧光染料的激發(fā)波長處的光并且透射在巧光染料的發(fā)射波長處的光。從而， 激發(fā)光束110被分色鏡114反射。分色鏡114通常對角地定向在濾光塊112內(nèi)，通常W相對于 激發(fā)光束110的方向的45度角定向在濾光塊112內(nèi)，W使得激發(fā)光束110朝向樣本102反射。
[0039] 此外，激發(fā)光束110通過物鏡116并且撞擊到樣本102上，其中，激發(fā)光束110激發(fā)存 在于樣本102中的巧光染料。巧光染料發(fā)巧光，從而發(fā)射在巧光染料的發(fā)射波長處的巧光 118。巧光118被物鏡117收集并且形成發(fā)射光束120,該發(fā)射光束120進(jìn)入濾光塊112。然后， 發(fā)射光束120透過分色鏡116并且擊中濾光塊112還包括的發(fā)射濾光器122。發(fā)射濾光器122 也是帶通濾光器(或者在一些情況下是長通濾光器），該帶通濾光器透射在巧光染料的發(fā)射 波長附近的光并且反射其他光(諸如，例如來自激發(fā)光束的雜散光W及來自樣本102中的其 他巧光染料的發(fā)射光）。從而，發(fā)射光束120透過發(fā)射濾光器122并且從顯微鏡系統(tǒng)100引導(dǎo) 到與其連接的檢測裝置124。檢測裝置124可W例如是傳感器、分光光度計(jì)、CCD或CMOS攝像 裝置、或者目鏡。在一些實(shí)施例中，諸如透鏡或分束器的光學(xué)元件存在于發(fā)射濾光器122與 檢測裝置124之間，W便適當(dāng)?shù)匾龑?dǎo)發(fā)射光束120。在包括諸如CCD或CMOS攝像裝置的數(shù)字?jǐn)z 像裝置的檢測裝置124的情況下，通常包括用于對所收集的圖像進(jìn)行曝光控制的自動(dòng)快口 (如上文所討論的那樣，也可W捕獲視頻流）。當(dāng)使用多個(gè)不同的濾光塊112時(shí)，通常使用黑 白相機(jī)來分別捕獲來自每種巧光染料的發(fā)射，數(shù)字地應(yīng)用假彩色并且重疊它們，W獲得最 終圖像。
[0040] 顯微鏡系統(tǒng)100還(通常地)包括控制單元126，該控制單元126用于控制顯微鏡系 統(tǒng)100的操作，包括轉(zhuǎn)臺(tái)的位置、檢測單元124W及光源106?？刂茊卧?26可W包括通用處理 器、專用處理器、包含處理部件的電路、一組分布式處理部件、被配置用于處理的一組分布 式計(jì)算機(jī)等。處理器可W是或者包括用于進(jìn)行數(shù)據(jù)或信號(hào)處理或者用于執(zhí)行存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器 中的計(jì)算機(jī)代碼的任何數(shù)量的硬件部件。存儲(chǔ)器可W是用于存儲(chǔ)用于完成或促進(jìn)本描述中 所描述的各種方法的數(shù)據(jù)和/或計(jì)算機(jī)代碼的一個(gè)或多個(gè)裝置。存儲(chǔ)器可W包括易失性存 儲(chǔ)器或非易失性存儲(chǔ)器。存儲(chǔ)器可W包括數(shù)據(jù)庫組件、目標(biāo)代碼組件、腳本組件、或用于支 持本描述的各種活動(dòng)的任何其他類型的信息結(jié)構(gòu)。根據(jù)示例性實(shí)施例，任何分布式存儲(chǔ)器 裝置或本地存儲(chǔ)器裝置都可W與該描述的系統(tǒng)和方法一起使用。根據(jù)示例性實(shí)施例，存儲(chǔ) 器(例如，經(jīng)由電路或任何其他有線連接、無線連接或網(wǎng)絡(luò)連接)可通信地連接至處理器，并 且包括用于執(zhí)行本文所描述的一種或多種處理的計(jì)算機(jī)代碼。
[0041] 如上所述，轉(zhuǎn)臺(tái)允許對多個(gè)濾光塊112的可移除插入和位置控制。也就是說，由于 每種類型的巧光染料具有其自身獨(dú)特的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因此針對每種類型的巧光染 料使用激發(fā)濾光器114、分色鏡116和發(fā)射濾光器122的不同組合。從而，具有濾光器與反射 鏡的特定組合的濾光塊被組裝W與特定類型的巧光染料一起使用。根據(jù)存在于樣本102中 的巧光染料的類型，將具有濾光器與反射鏡的適當(dāng)組合的濾光塊112相應(yīng)地插入轉(zhuǎn)臺(tái)中。類 似地，選擇濾光塊112中的濾光器和反射鏡W與特定光源一起使用。
[0042] 上文所描述的標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)配置使用顯微鏡光學(xué)元件W在攝像裝置傳感器上直接產(chǎn) 生標(biāo)本的放大圖像W捕獲標(biāo)本的高分辨率圖像。該光學(xué)系統(tǒng)通常被稱為"寬場"顯微鏡。顯 微鏡領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可W通過各種其他光學(xué)系統(tǒng)來產(chǎn)生標(biāo)本的高分辨率圖像。
[0043] 暫時(shí)轉(zhuǎn)到圖2a至圖2c，圖2a至圖2c示出了用于實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思的濾光器和 光源裝置的替選實(shí)現(xiàn)方式。在圖2a中，W與圖1中的方式相似的方式示例化了發(fā)明構(gòu)思，然 而，替代設(shè)置單個(gè)光源(諸如隸燈(或類似物）），設(shè)置了多個(gè)LED 106'，其中，L抓106'中的 每一個(gè)均是通常發(fā)射僅在有限的波長范圍內(nèi)（例如，具有大約20nm至50nm的帶寬）的光的窄 帶LED。因此，在使用運(yùn)樣的布置時(shí)，可W不包括濾光塊112'的激發(fā)濾光器。相應(yīng)地，必須調(diào) 整LED 106'中的每一個(gè)W僅透射激發(fā)光束110的具有在用于標(biāo)記樣本102的巧光染料之一 的激發(fā)波長間隔內(nèi)的波長間隔的成分(如上文所討論的那樣）。
[0044] 替選地，可W根據(jù)所謂的"Pinker配置（圖2b)或"Sedat"(圖2c)配置來實(shí)現(xiàn)發(fā)明 構(gòu)思。Pinkel配置和Sedat配置兩者都包括多頻帶分色鏡;然而，不同之處在于所使用的激 發(fā)濾光器與發(fā)射濾光器的組合。Sedat濾光器配置使用單頻帶激發(fā)器和單頻帶發(fā)射器，而 Pinkel配置使用單頻帶激發(fā)濾光器和多頻帶發(fā)射器。雖然當(dāng)與多頻帶濾光器組相比時(shí)，在 大多數(shù)情況下，Sedat配置將給出最高的信噪比，但是當(dāng)使用Pinkel配置時(shí)獲得的S/^比可 能高于當(dāng)使用整個(gè)多頻帶配置時(shí)獲得的S/N比。與圖1中所示的濾光塊實(shí)現(xiàn)方式相比， Pinkel和/或Sedat配置可W允許對引入不同的濾光器配置的非常快速的切換。
[0045] 此外，圖1和圖2a至圖2c中所示的所有不同的實(shí)現(xiàn)方式被示為實(shí)現(xiàn)"光反射策略"， 即，光撞擊到樣本102上、然后朝向檢測裝置124反射回去。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，發(fā)明構(gòu)思還 可W通過使光透射"通過"樣本102來實(shí)現(xiàn)，例如，從而使檢測裝置124能夠布置在樣本102 "后面"或W任何其他角度布置檢測裝置124。
[0046] 現(xiàn)在轉(zhuǎn)到圖3曰，圖3a示出了根據(jù)本發(fā)明的所應(yīng)用的多種不同的巧光染料的激發(fā)/ 發(fā)射圖。在圖3a的圖示中，已用屯種不同的巧光染料標(biāo)記樣本102,從而形成被提供給檢測 裝置124的屯種不同的巧光信號(hào)。
[0047] 如上文所討論的那樣，本發(fā)明所解決的大體問題是分離來自用第一巧光染料標(biāo)記 并且同時(shí)用形成巧光染料對的第二巧光染料標(biāo)記的樣本的信號(hào)。如上文所討論的那樣，第 一巧光染料和第二巧光染料選自發(fā)射在可見光譜內(nèi)（例如，通常在400nm至640nm的范圍內(nèi)） 的光的巧光染料，W及第一巧光染料和第二巧光染料分別是為切3類巧光染料和594類巧光 染料的巧光染料組合/對，或者第一巧光染料和第二巧光染料分別是為425類巧光染料和 488類巧光染料的巧光染料組合/對。
[004引通常，運(yùn)些巧光染料是亮的并且具有光譜重疊（425與488相比，W及Cy3與594相 比）。在本發(fā)明的示例性實(shí)施例中，594激發(fā)濾光器已被移位大于590nm(例如，594/8nm或 602/13皿），運(yùn)相應(yīng)地使得可W激發(fā)594而不激發(fā)Cy3。此外，通過將切3的發(fā)射濾光器移位小 于580nm(例如，568/lOnm或572/lOnm)，意外的是可W收集切3發(fā)射信號(hào)而未收集594發(fā)射信 號(hào)。在運(yùn)些優(yōu)化的情況下，切3濾光器裝置(光部件和濾光器部件）W及594濾光器裝置使得 可W分離來自每種巧光染料的信號(hào)。重要地，在優(yōu)化的濾光器組的情況下，巧光信號(hào)保持足 夠強(qiáng)。在另一示例中，可W針對425巧光染料和488類巧光染料的組合W及針對647類巧光染 料和700類巧光染料的組合來進(jìn)行類似的調(diào)適。
[0049] 接下來，已通過減少來自組織的自發(fā)巧光來優(yōu)化488/FITC(異硫氯酸巧光素)通道 的信噪比，運(yùn)是488/FITC檢測的普遍問題。組織中的許多分子被藍(lán)光光譜內(nèi)的光激活，例如 線粒體蛋白質(zhì)、膠原蛋白和彈性蛋白，運(yùn)引起自發(fā)巧光并且發(fā)射跨寬波長間隔的光。通過將 激發(fā)濾光器移位大于490nm(500/20nm)，自發(fā)巧光的主要部分消失并且顯著地改善了信噪 比。必須注意選擇不收集任何切3發(fā)射信號(hào)的488/FITC發(fā)射濾光器(525/15nm)D488/FITC發(fā) 射濾光器的移位為在DAPI和FITC之間的附加通道給出了空間（激發(fā)大于420皿W及發(fā)射小 于495nm)。關(guān)于高的組織自發(fā)巧光，該間隔是有問題的，并且巧光染料需要足夠亮W給出可 接受的信噪比。在該間隔處僅少量巧光染料可用，并且它們中的大部分是黯淡的和/或受到 光致漂白影響。然而，發(fā)現(xiàn)Atto425是耐光的且足夠亮W覆蓋組織自發(fā)巧光。此外，核染色劑 SytoxBlue滿足了該間隔處的標(biāo)準(zhǔn)。
[0050] 最后，選擇/引入/使用近紅外巧光染料來標(biāo)記樣本102。由于隸燈或金屬面化物燈 在大于620nm的波長處是弱的，因此在獲得足夠的光能W適當(dāng)?shù)丶ぐl(fā)近紅外巧光染料時(shí)存 在困難。在測試許多染料之后，證實(shí)了化rCP及其類似物(例如，PerCP-切5.5)更優(yōu)良。？6祐口 具有較大（相比之下）斯托克位移并因而可W用高能量藍(lán)光來激活，并且通過與425類巧光 染料和488類巧光染料形成巧光染料Ξ聯(lián)體，可W容易地將化rCP的信號(hào)與設(shè)置中的其他巧 光染料分離。在所測試的具有較小(相比之下)斯托克位移的所有紅外染料中，已發(fā)現(xiàn)647類 巧光染料W及一些660類巧光染料(諸如CF660R)即使當(dāng)在波長間隔〉620nm下被激活時(shí)也給 出了合理的良好信號(hào)。從而，PerCP類巧光染料或647類巧光染料W及一些660類巧光染料可 W用于多色設(shè)置中并且由隸燈或金屬面化物燈來激活。
[0051] 因此，借助于本發(fā)明，可W分別檢測來自發(fā)射可見光譜內(nèi)的光的四種或更多種不 同的巧光染料的信號(hào)。此外，通過選擇發(fā)射在遠(yuǎn)紅光光譜內(nèi)的光的巧光染料(通常發(fā)射在 640nm與700nm之間的光）、發(fā)射在近紅外光譜內(nèi)的光的巧光染料(通常發(fā)射在700nm與750nm 之間的光)或發(fā)射在紅外光譜內(nèi)的光(通常發(fā)射大于750nm的光)的巧光染料，可W分離多達(dá) 屯種不同的巧光信號(hào)。此外，也就是說，在與在遠(yuǎn)紅光/近紅外/紅外光譜內(nèi)是活性的巧光染 料結(jié)合使用發(fā)射在可見光譜W及可見光譜W上(遠(yuǎn)紅光/近紅外/紅外）的光譜兩者內(nèi)的光 的光源(例如，例如與另外的LED結(jié)合的"常用"光源)的情況下，可W分離多于屯種不同的巧 光信號(hào)。對于紫外光譜W及針對其他光源組合而言，相同的構(gòu)思自然也是可行的。
[0052] 圖3b至圖3d示出了可W如何將巧光染料對與其他巧光染料對和其他單一巧光染 料組合W獲得根據(jù)本發(fā)明的多色設(shè)置的替選配置。例如，圖3b示出了可W由隸燈激活的多 色設(shè)置。類似地，圖3c和圖3d示出了可W由還發(fā)射在遠(yuǎn)紅光/近紅外/紅外光譜內(nèi)的強(qiáng)光的 光源裝置激活的多色設(shè)置。
[0053] W下給出了具有在其內(nèi)放置激發(fā)濾光器和發(fā)射濾光器的適當(dāng)間隔的示例性巧光 染料(或任何類似類型）的可能組合?？蒞用隸燈或金屬面化物燈來進(jìn)行該設(shè)置。
[0化4]
[0055]替選地，在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，W下組合是可行的。在該示例中，已用由紫外 光激活的巧光染料對(與DY-360化或BV421組合的DY-350化)替代DAPI通道，并且添加了遠(yuǎn) 紅光/近紅外巧光染料對(與700組合的647)。該設(shè)置優(yōu)選地需要發(fā)射在遠(yuǎn)紅光和近紅外光 譜處具有高能量的光的照明源W恰當(dāng)?shù)丶せ?00巧光染料和790巧光染料。
[0化6]
[0057]圖4a至圖4c示出了激發(fā)濾光器和發(fā)射濾光器設(shè)置及其對應(yīng)的波長/帶寬的Ξ個(gè)具 體示例。
[005引最后轉(zhuǎn)至圖5,圖5示出了圖示用于操作根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡系統(tǒng)100的方法步驟 的示例性流程圖。該過程開始于選擇包括切3類巧光染料和594類巧光染料的至少四種不同 的巧光染料(S1)。然后，將至少四種不同的巧光染料用于標(biāo)記樣本102,樣本具有上文所討 論的類型中的任一類型。
[0059] 基于被選擇用于標(biāo)記樣本102的巧光染料，選擇相應(yīng)數(shù)量(通常與所選擇的巧光染 料的數(shù)量一樣多）的激發(fā)波長間隔（S2)，其中，根據(jù)W上討論具體選擇針對第二巧光染料的 激發(fā)波長間隔W使得對第一巧光染料的激發(fā)減少。然后，選擇濾光器裝置(例如，（一個(gè)或多 個(gè)）濾光塊112的（一個(gè)或多個(gè)）發(fā)射濾光器（或替選地，根據(jù)Pinkel配置或Sedat配置）） (S3)，W允許在與至少四種不同的巧光染料的發(fā)射波長間隔匹配的不同發(fā)射波長間隔內(nèi)的 光通過。此外，此處應(yīng)當(dāng)滿足一般標(biāo)準(zhǔn)，其中，選擇針對第一巧光染料的發(fā)射波長W減小從 第二巧光染料滲漏的光發(fā)射，其中，切3類巧光染料形成第一巧光染料而594類巧光染料形 成第二巧光染料，或者425類巧光染料形成第一巧光染料而488類巧光染料形成第二巧光染 料。
[0060] 與光源106、轉(zhuǎn)臺(tái)和濾光塊112結(jié)合地使用例如控制單元126,顯微鏡系統(tǒng)100用于 順序地發(fā)射在所選擇的激發(fā)波長間隔內(nèi)的光(S4)?；诜瓷涔馀渲没蛘咄ㄟ^允許光通過樣 本102,從用于標(biāo)記樣本102的巧光染料發(fā)出的巧光例如在與數(shù)字?jǐn)z像裝置(檢測裝置124) 結(jié)合的控制單元126的控制下，一旦光已通過濾光器裝置(通常至少包括發(fā)射濾光器)就被 檢測到。
[0061] 如上文所討論的那樣，可W分別捕獲圖像，可W數(shù)字地應(yīng)用偽彩色，然后，可W將 圖像重疊在彼此之上，W允許形成多色圖像。還如上文所討論的那樣，可W對隨后收集的圖 像執(zhí)行實(shí)時(shí)收集。
[0062] 總之，本發(fā)明設(shè)及一種用于使用包括光源裝置的顯微鏡系統(tǒng)來檢測從用多種預(yù)定 巧光染料標(biāo)記的樣本發(fā)射的巧光的方法，其中，該方法包括W下步驟:選擇被配置成發(fā)射在 可見光譜內(nèi)的光的至少四種不同的巧光染料，運(yùn)至少四種不同的巧光染料包括形成巧光染 料對的第一巧光染料和第二巧光染料;選擇針對至少四種不同的巧光染料的激發(fā)波長間 隔，其中，選擇針對第二巧光染料的激發(fā)波長間隔W使得對第一巧光染料的激發(fā)減少;將顯 微鏡系統(tǒng)的濾光器裝置配置成選擇性地允許在與至少四種不同的巧光染料的發(fā)射波長間 隔匹配的發(fā)射波長間隔內(nèi)的光通過，其中，選擇針對第一巧光染料的發(fā)射波長間隔W減少 從第二巧光染料滲漏的光發(fā)射;順序地發(fā)射在所選擇的激發(fā)波長間隔的至少一部分內(nèi)的 光；W及檢測從樣本發(fā)射的透過濾光器裝置的光，其中，巧光染料對被選擇為形成第一巧光 染料的切3類巧光染料和形成第二巧光染料的594類巧光染料，或者巧光染料對被選擇為形 成第一巧光染料的425類巧光染料和形成第二巧光染料的488類巧光染料。
[0063] 本發(fā)明還設(shè)及一種用于使用包括光源裝置的顯微鏡系統(tǒng)來檢測從用多種預(yù)定巧 光染料標(biāo)記的樣本發(fā)射的巧光的方法，其中，該方法包括W下步驟:選擇被配置成發(fā)射在可 見光、遠(yuǎn)紅光W及近紅外光光譜內(nèi)的光的至少六種不同的巧光染料，至少六種不同的巧光 染料包括發(fā)射在可見光譜內(nèi)的光的形成巧光染料對的第一巧光染料和第二巧光染料、W及 發(fā)射在遠(yuǎn)紅光/近紅外光譜內(nèi)的光的形成巧光染料對的第一巧光染料和第二巧光染料;選 擇針對至少六種不同的巧光染料的激發(fā)波長間隔，其中，選擇針對第二巧光染料的激發(fā)波 長間隔W使得對第一巧光染料的激發(fā)減少;將顯微鏡系統(tǒng)的濾光器裝置配置成選擇性地允 許在與至少六種不同的巧光染料的發(fā)射波長間隔匹配的發(fā)射波長間隔內(nèi)的光通過，其中， 選擇針對第一巧光染料的發(fā)射波長間隔W減少從第二巧光染料滲漏的光發(fā)射;順序地發(fā)射 在所選擇的激發(fā)波長間隔的至少一部分內(nèi)的光；W及檢測從樣本發(fā)射的透過濾光器裝置的 光，其中，"可見"巧光染料對被選擇為形成第一巧光染料的切3類巧光染料和形成第二巧光 染料的594類巧光染料，或者巧光染料對被選擇為形成第一巧光染料的425類巧光染料和形 成第二巧光染料的488類巧光染料，W及"不可見"巧光染料對被選擇為形成第一巧光染料 的647類巧光染料和形成第二巧光染料的700類巧光染料。
[0064] 本發(fā)明基于W下理解:通過解決分離從用第一巧光染料和第二巧光染料標(biāo)記的樣 本發(fā)射的巧光信號(hào)的主要問題，優(yōu)點(diǎn)將如下，即減小了還使得能夠分離出自第Ξ巧光染料 和第四（不同的）巧光染料的在可見光譜內(nèi)的另外的巧光信號(hào)的復(fù)雜度，限于巧光染料發(fā)射 在可見光譜內(nèi)（例如，通常在400nm至640nm的范圍內(nèi)）的光的情況。此外，如果還添加在遠(yuǎn)紅 光/近紅外光譜內(nèi)（通常在640nm至750nm的范圍內(nèi)）的巧光染料對，則優(yōu)點(diǎn)將如下:減小還使 得能夠分離出自巧光染料的在紅外光譜(通常大于750nm)內(nèi)的另外的巧光信號(hào)的復(fù)雜度。 第一巧光染料和第二巧光染料分別是為切3類巧光染料和594類巧光染料的巧光染料組合/ 對，或者第一巧光染料和第二巧光染料分別是為425類巧光染料和488類巧光染料的巧光染 料組合/對，或者第一巧光染料和第二巧光染料分別是為647類巧光染料和700類巧光染料 的巧光染料組合/對。根據(jù)本發(fā)明，運(yùn)是通過W下獲得的：選擇針對第二巧光染料的激發(fā)波 長間隔W使得對第一巧光染料的激發(fā)減少；W及選擇針對第一巧光染料的發(fā)射波長W使得 從第二巧光染料滲漏的光發(fā)射減少。
[0065] 雖然附圖示出了方法步驟的具體順序，但是運(yùn)些步驟的順序可W與所描繪的順序 不同。也可W同時(shí)執(zhí)行兩個(gè)或更多個(gè)步驟或者部分地同時(shí)執(zhí)行兩個(gè)或更多個(gè)步驟。運(yùn)樣的 變型將取決于設(shè)計(jì)者的選擇。所有運(yùn)樣的變型都在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。此外，即使已參照 本發(fā)明的具體示例性實(shí)施例描述了本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，許多不同的替選、 修改等也將變得明顯。根據(jù)對附圖、本公開內(nèi)容W及所附權(quán)利要求的學(xué)習(xí)，技術(shù)人員可W在 實(shí)踐要求保護(hù)的發(fā)明時(shí)理解并實(shí)現(xiàn)對所公開的實(shí)施例的變型。此外，在權(quán)利要求中，詞語 "包括"不排除其他元件或步驟，W及不定冠詞"一個(gè)(a)"或"一個(gè)(an)"不排除復(fù)數(shù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種方法，用于使用包括光源裝置的顯微鏡系統(tǒng)來檢測從用多種預(yù)定的熒光染料標(biāo) 記的樣本發(fā)射的熒光，其中，所述方法包括以下步驟： -選擇至少四種不同的熒光染料，所述至少四種不同的熒光染料被配置成發(fā)射在可見 光光譜內(nèi)的光，所述至少四種不同的熒光染料包括形成熒光染料對的第一熒光染料和第二 熒光染料； -選擇針對所述至少四種不同的熒光染料的激發(fā)波長間隔，其中，選擇針對所述第二熒 光染料的激發(fā)波長間隔以使得所述第一熒光染料的激發(fā)減少； -將所述顯微鏡系統(tǒng)的濾光器裝置配置成選擇性地允許在與所述至少四種不同的熒光 染料的發(fā)射波長間隔匹配的發(fā)射波長間隔內(nèi)的光通過，其中，選擇針對所述第一熒光染料 的發(fā)射波長間隔以減少從所述第二熒光染料滲漏的光發(fā)射； -順序地發(fā)射在所選擇的激發(fā)波長間隔的至少一部分內(nèi)的光；以及 -檢測從所述樣本發(fā)射的透過所述濾光器裝置的光， 其中，所述熒光染料對被選擇為形成所述第一熒光染料的Cy3類熒光染料和形成所述 第二熒光染料的594類熒光染料，或者所述熒光染料對被選擇為形成所述第一熒光染料的 425類熒光染料和形成所述第二熒光染料的488類熒光染料。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括如下步驟:分離來自所述至少四種不同的熒光染 料的焚光信號(hào)。3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，還包括選擇至少五種不同的熒光染料，其 中，針對所述至少五種不同的熒光染料選擇激發(fā)波長間隔并且針對所述至少五種不同的熒 光染料配置所述濾光器裝置，所述熒光染料對被選擇為形成所述第一熒光染料的所述Cy3 類熒光染料和形成所述第二熒光染料的所述594類熒光染料，以及另外的熒光染料對被選 擇為形成所述第一熒光染料的所述425類熒光染料和形成所述第二熒光染料的所述488類 熒光染料。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，還包括:選擇至少一種另外的熒光染料，所 述至少一種另外的熒光染料被配置成發(fā)射在遠(yuǎn)紅光/近紅外光譜內(nèi)的光。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，還包括:選擇至少一種另外的熒光染料，所 述至少一種另外的熒光染料被配置成發(fā)射在紅外光譜內(nèi)的光。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，其余的熒光染料選自：DAPI類熒光染 料或BV421類熒光染料、425類熒光染料、488類熒光染料、Cy3類熒光染料、594類熒光染料、 PerCP類熒光染料或647/660/680/700類熒光染料以及725/750/790類熒光染料。7. -種顯微鏡系統(tǒng)，用于分離從用多種預(yù)定的熒光染料標(biāo)記的樣本發(fā)射的熒光信號(hào)， 所述顯微鏡系統(tǒng)包括： -光源裝置，被配置成發(fā)射光； -導(dǎo)光裝置，用于將光從所述光源裝置引導(dǎo)至所述樣本以激發(fā)所述多種預(yù)定的熒光染 料； -濾光器裝置，被配置成允許分離由標(biāo)記所述樣本的所述多種預(yù)定的熒光染料發(fā)射的 熒光，以及 -檢測裝置，被配置用于接收透過所述濾光器裝置的光， 其中， -顯微鏡濾光器設(shè)置能夠分離來自發(fā)射在可見光光譜內(nèi)的光的至少四種不同的熒光染 料的信號(hào)，所述至少四種不同的熒光染料包括形成熒光染料對的第一熒光染料和第二熒光 染料， -所述光源裝置被配置成順序地發(fā)射在至少四種不同的激發(fā)波長間隔內(nèi)的光， -選擇針對所述第二熒光染料的激發(fā)波長間隔以減少對所述第一熒光染料的激發(fā)， -所述濾光器裝置包括至少四個(gè)匹配的濾光器，所述至少四個(gè)匹配的濾光器被配置成 允許在至少四種不同的發(fā)射波長間隔內(nèi)的光通過， -選擇針對所述第一熒光染料的發(fā)射波長間隔以減少從所述第二熒光染料滲漏的光發(fā) 射，以及 -所述熒光染料對被選擇為形成所述第一熒光染料的Cy3類熒光染料和形成所述第二 熒光染料的594類熒光染料，或者所述熒光染料對被選擇為形成所述第一熒光染料的425類 熒光染料和形成所述第二熒光染料的488類熒光染料。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的顯微鏡系統(tǒng)，其中，所述檢測裝置包括圖像捕獲裝置，所述圖 像捕獲裝置被配置成捕捉所述樣本的熒光的圖像。9. 根據(jù)權(quán)利要求7至8中任一項(xiàng)所述的顯微鏡系統(tǒng)，其中，所述光源裝置包括多個(gè)窄帶 發(fā)光二極管。10. 根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的顯微鏡系統(tǒng)，其中，所述光源裝置包括發(fā)射在紫 外光譜和可見波長光譜內(nèi)的光的光源與發(fā)射在遠(yuǎn)紅光光譜、近紅外光譜或紅外光譜中的至 少一個(gè)內(nèi)的光的多個(gè)發(fā)光二極管的組合。
【文檔編號(hào)】G02B21/00GK105829944SQ201480068794
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月11日
【發(fā)明人】佩爾·福格爾斯特蘭德
【申請人】克羅姆尼貢公司