本發(fā)明屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于羅丹明的GSH水溶性熒光探針的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，由于熒光探針具有高靈敏度、高分辨率、對(duì)待測(cè)樣品無損以及可實(shí)現(xiàn)原位、實(shí)時(shí)、快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被作為生物樣品監(jiān)測(cè)以及生物體內(nèi)熒光成像的重要分析工具(Que,E.L.；Domaille,D.W.；Chang,C.J.Chem.Rev.2008,108,1517-1549)。大部分熒光探針被設(shè)計(jì)并用來檢測(cè)金屬陽離子，而幾乎很少用來檢測(cè)生物小分子(Chen,X.Q.；Pradhan,T.；Wang,F.；Kim,J.S.；Yoon,J.Y.Chem.Rev.,2012,112,1910–1956.)。谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)以及同型半胱氨酸(Hcy)統(tǒng)稱為生物硫醇，他們?cè)谏顒?dòng)中發(fā)揮著重要的作用(Shang,L.；Qin,C.J.；Wang,T.；Wang,M.；Wang,L.X.；Dong,S.J.J.Phys.Chem.C.2007,111,13414-13417)。這些硫醇在生物體內(nèi)的濃度的變化與某些生命過程正常與否息息相關(guān)(Hwang,C.；Sinskey,A.J.；Lodish,H.F.science 1992,257,1496-1502)。谷胱甘肽廣泛存在于生物體內(nèi)，其在細(xì)胞內(nèi)的含量為1.0-15mM(Meister,A.；Anderson,M.E.；Powrie,F.；Puri,R.N.Annu.Rev.Biochem.1983,52,711-760)。研究表明，GSH在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著非常重要的功能，包括維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)平衡、異型生物質(zhì)的新陳代謝、細(xì)胞內(nèi)信息傳遞以及基因表達(dá)(Kanzok,S.M.；Schirmer,R.H.；lozef,R.Becker,K.J.Biol.Chem.2000,275,40180-40186)。體內(nèi)GSH水平不正常將會(huì)導(dǎo)致癌癥、老化、心臟病以及其他的疾病(Whillier,S.；Raftos,J.E.；Kuchel,P.W.Redox Rep.2008,13,277-282)。正因?yàn)镚SH有著非常重要的生理及臨床意義，設(shè)計(jì)有效的熒光探針去精確檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量非常重要。

由于對(duì)精確檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量的需求越來越大，一些基于不同熒光團(tuán)的熒光探針已經(jīng)被合成，如香豆素類(Chen,C.Y.；Liu,W.；Xu,C.；Liu,W.S.Biosens.Bioelectron 2015,71,68-74)、芘類(Hu,Y.；Heo,C.H.；Kim,G.；Jun,E.J.；Yin,J.；Kim,H.M.；Yoon,J.Anal.Chem.2015,87,3308-3313)、熒光素類(Wang,L.；Chen,H.Y.；Wang,H.L.；Wang,F.；Kambam,S.；Wang,Y.；Zhao W.B.；Chen,X.Q.Sens.Actuators B 2014,192,708-713)、氟硼吡咯類(Wang,F.Y.；Zhou,L.；Zhao,C.C.；Wang,R.；Fei,Q.；Luo,S.H.；Guo,Z.Q.；Tiana,H.；Zhu,W.H.Chem.Sci.2015,6,2584-2589)、花青素類(Niu,L.Y.；Guan,Y.X.；Chen,Y.Z.；Wu,L.Z.；Tung,C.H.；Q.Z.Yang,Chem.Soc.Rev.2015,44,6143-6160)、萘酰亞胺類(Beija,M.；Afonso,C.A.M.；Martinho,J.M.G.Chem.Soc.Rev.2009,38,2410-2433)、螺吡喃類(Shao,N.；Jin,J.Y.；Wang,H.；Zheng,J.；Yang,R.H.；Chan,W.H.；Abliz,Z.J.Am.Chem.Soc.2010,132,725-736)以及派洛寧類(Liu,H.；Wang,H.；Shenvi,S.；Hagen,T.M.；Liu,RRR.M.Acad.Sci.2004,1019,346-349)。盡管這些熒光探針對(duì)谷胱甘肽的檢測(cè)有著重要的意義，但它們存在著以下四個(gè)缺點(diǎn)。(1)這些探針的分析波長(zhǎng)短，因此容易被生物基質(zhì)樣品的自熒光信號(hào)干擾；(2)由于谷胱甘肽與其他生物硫醇即半胱氨酸及同型半胱氨酸具有非常相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此有效的區(qū)分谷胱甘肽與半胱氨酸、同型半胱氨酸是非常困難的；(3)由于一些探針本身存在比較強(qiáng)的背景熒光或者檢測(cè)分析物時(shí)熒光增強(qiáng)的倍數(shù)很小，導(dǎo)致該類熒光探針的靈敏度很低；(4)幾乎所有這些被報(bào)道過的熒光探針僅溶于純有機(jī)溶劑或有機(jī)-水組成的混合溶劑中，這都大大限制了熒光探針在生物體內(nèi)的進(jìn)一步的應(yīng)用。熒光分子探針的主要應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測(cè),所以在純水溶液中的識(shí)別具有潛在的廣泛應(yīng)用價(jià)值。另外,許多探針分子的熒光性質(zhì)會(huì)受質(zhì)子的影響,在水溶液中可以通過緩沖溶液控制穩(wěn)定的pH值,使識(shí)別研究的結(jié)果更可靠。因此，設(shè)計(jì)和合成具有長(zhǎng)的分析波長(zhǎng)、高的選擇性和高的靈敏度并能在100％水溶液中高效的檢測(cè)谷胱甘肽類熒光探針迫在眉睫。

羅丹明衍生物是熒光探針領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的一類染料，羅丹明類熒光探針具有分析波長(zhǎng)長(zhǎng)、摩爾吸光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高以及光穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)。最為關(guān)鍵的是，羅丹明的內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)沒有熒光，破壞這種結(jié)構(gòu)后能夠引起熒光發(fā)射增強(qiáng)。由于此結(jié)構(gòu)上的優(yōu)勢(shì)，羅丹明內(nèi)酰胺類化合物是理想的OFF-ON型熒光分子探針，從而能實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物高靈敏度的熒光檢測(cè)。據(jù)我們所知，大部分羅丹明類熒光探針都用來監(jiān)測(cè)金屬陽離子(Li,D.；Li,C.Y.；Li,Y.F.；Qin,H.R.；Tan,K.Y.Sens.Actuators B 2016,223,705-712)，報(bào)道過的文獻(xiàn)很少有用來檢測(cè)谷胱甘肽。

本文利用羅丹明類熒光具有長(zhǎng)的分析波長(zhǎng)以及高的靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了一種簡(jiǎn)單的基于羅丹明的能在100％水溶液中檢測(cè)谷胱甘肽的熒光探針。一方面，用羧基修飾羅丹明結(jié)構(gòu)，能大大提高探針的水溶性；另一方面，利用分析物的SH與探針的醛基之間發(fā)生水解-加成反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽與半胱氨酸、同型半胱氨酸的區(qū)分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種基于羅丹明的GSH的水溶性熒光探針，該熒光探針具有長(zhǎng)的分析波長(zhǎng)、高靈敏度以及高選擇性的檢測(cè)GSH，并能夠應(yīng)用于活細(xì)胞的熒光成像。

本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種基于羅丹明的GSH水溶性熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明的熒光探針應(yīng)用于GSH的檢測(cè)，其特征在于探針本身處于閉環(huán)狀態(tài)沒有熒光，探針與GSH反應(yīng)后螺環(huán)打開，從而導(dǎo)致熒光改變。

所述的一種基于羅丹明的GSH水溶性熒光探針的制備方法。步驟如下：

化合物Rh1的合成:在將1,2,4-偏苯三酸酐和3-二乙氨基苯酚加入到含有N,N-二甲基甲酰胺的圓底燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，磁力攪拌回流6小時(shí)，停止反應(yīng)；反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，加入二次蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬?，用二氯甲烷進(jìn)行萃取，合并有機(jī)層并減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲烷/甲醇為6:1(體積比)的洗脫劑柱層析分離得紅色固體(化合物Rh1)。

化合物Rh2的合成：將化合物Rh1溶解在無水甲醇中，攪拌下滴加水合肼。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，磁力攪拌回流反應(yīng)混合物攪拌下回流24小時(shí)；減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲烷/甲醇為10:1(體積比)的洗脫劑柱層析分離得白色固體(化合物Rh2)。

熒光探針1的合成：將化合物Rh2和乙二醛溶解在無水甲醇中攪拌。在室溫下，磁力攪拌反應(yīng)混合物12小時(shí)；減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲烷/水為12:1(體積比)的洗脫劑柱層析分離得淡黃色固體，得到目標(biāo)產(chǎn)物。制備反應(yīng)式如下：

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的熒光探針的水溶性好，能完全溶解在100％純水溶液中。該熒光探針在GSH存在下熒光發(fā)生顯著變化，可以用于高靈敏度的檢測(cè)GSH。該熒光探針的檢測(cè)范圍為0.08to 25μM，檢測(cè)限為27nM。其次，該熒光探針的檢測(cè)環(huán)境為生理范圍內(nèi)的pH＝6-8。同時(shí)，該熒光探針對(duì)GSH的響應(yīng)迅速，響應(yīng)時(shí)間在90秒以內(nèi)。該熒光探針對(duì)GSH表現(xiàn)出很好的選擇性，不受其它生物硫醇(Cys，GSH)及其它氨基酸(Ala,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Trp,Val,Asn,Gln,Gly,Ser,Thr,Tyr,Arg,His,Lys,Asp,Glu)的影響。尤其是，該熒光探針可應(yīng)用于活細(xì)胞的熒光成像，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的GSH含量，這對(duì)于深入研究GSH在生物體內(nèi)生理和病理過程的動(dòng)力學(xué)機(jī)理具有重要意義。

附圖說明

圖1為熒光探針與不同濃度的GSH作用后的熒光光譜圖。

橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。熒光探針的濃度均為10μM，GSH濃度分別為：0,0.08,1.0,2.0,3.0,5.0,7.0,9.0,11.0,13.0,15.0,20.0,23.0,25.0μM。熒光激發(fā)波長(zhǎng)為510nm。插圖為探針對(duì)GSH濃度的線性響應(yīng)圖。

圖2為熒光探針與GSH的作用機(jī)理圖。

圖3為熒光探針與GSH作用后的紫外可見吸收光譜圖。

橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為吸光度。熒光探針的濃度均為10μM，GSH濃度為25μM。

圖4為pH對(duì)熒光探針的影響圖。

圖5為熒光探針在不同GSH濃度(1,5,11,15μM)下，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線圖。

圖6為熒光探針的選擇性圖。

橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。熒光探針的濃度均為10μM，GSH濃度為30μM，Cys、Hcy及其它19種氨基酸的濃度均為1mM。

圖7為GSH的細(xì)胞成像圖。

圖8為細(xì)胞毒性試驗(yàn)。橫坐標(biāo)為熒光探針的濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞的存活率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不限于此。

實(shí)施例1：

熒光探針的合成

化合物Rh1的合成:在含有50mL N,N-二甲基甲酰胺的100mL圓底燒瓶中加入1,2,4-偏苯三酸酐(1.92g,10mmol)和3-二乙氨基苯酚(3.30g,20mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，磁力攪拌回流6小時(shí)，停止反應(yīng)；反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，加入二次蒸餾水(200mL)，充分?jǐn)嚢韬?，用二氯甲?100mL×3)進(jìn)行萃取，合并有機(jī)層并減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲烷/甲醇為6:1(體積比)的洗脫劑柱層析分離得紅色固體Rh1(0.419g,產(chǎn)率：8.6％)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.19(d,J＝8.0Hz,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(s,1H),7.28(d,J＝8.0Hz,2H),6.98(d,J＝8.0Hz,2H),6.89(s,2H),3.64(d,J＝8.0Hz,8H),1.28(s,12H).¹³CNMR(100MHz,CD₃OD)δ164.9,160.4,157.9,134.3,132.8,132.6,131.8,131.7,116.1,115.9,98.1,47.7,13.9.MS(TOF)m/z 487.3.

化合物Rh2的合成：化合物Rh1(0.490g,1.00mmol)溶解在50.0mL無水甲醇中，攪拌下滴加水合肼(0.30ml,5.25mmol)。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，磁力攪拌回流反應(yīng)混合物攪拌下回流24小時(shí)；減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲烷/甲醇為10:1(體積比)的洗脫劑柱層析分離得白色固體(化合物Rh2)(0.193g,產(chǎn)率：38.5％)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.06(d,J＝8.0Hz,1H),7.84(d,J＝8.0Hz,1H),7.63(s,1H),6.39-6.46(m,6H),4.62(bs,2H),3.60(q,J＝8.0Hz,8H),1.17(t,J＝8.0Hz,12H).¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ163.9,153.9,152.1,149.0,130.6,129.0,127.4,121.7,108.2,103.7,98.1,64.6,44.0,11.5.MS(TOF)m/z501.4.

熒光探針1的合成：化合物Rh2(0.500g,1.00mmol)和乙二醛(0.107g,2.00mmol)溶解在25.0mL無水甲醇中攪拌。在室溫下，磁力攪拌反應(yīng)混合物12小時(shí)；減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲烷/水為12:1(體積比)的洗脫劑柱層析分離得淡黃色固體(探針1)(0.430g,產(chǎn)率：79.8％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ9.44(d,J＝8.0Hz,1H),8.19(d,J＝8.0Hz,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(s,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),6.45(d,J＝8.0Hz,4H),6.40(s,2H),6.25(d,J＝8.0Hz,2H),3.33(d,J＝8.0Hz,8H),1.17(t,J＝8.0Hz,12H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ192.7,183.1，166.0,153.0,152.7,149.3,141.3,135.0,128.6,127.5,126.6,124.1,108.3,103.9,98.2,66.1,44.4,12.6.MS(TOF)m/z 541.3.Anal.calcd.for C₃₁H₃₂N₄O₅(1):C,68.87；H,5.99；N,10.36；O,14.80.Found:C,69.73；H,6.03；N,10.61；O,14.93.結(jié)果表明，所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確。

實(shí)施例2：

熒光探針與GSH作用的溶液配制

將一定量的熒光探針溶解在水中，得到濃度為1.0×10^-4mol·L^-1探針的備用溶液。將一定量的GSH用水溶解后，轉(zhuǎn)移到500mL的容量瓶中，加水至刻度線，得到濃度為1.0×10^-2mol·L^-1的GSH。將1.0×10^-2mol·L^-1的GSH溶液用水逐漸稀釋，得到1.0×10^-3-1.0×10^-8mol·L^-1的GSH水溶液。將1.0mL探針的備用溶液和1.0mL的GSH水溶液加入到10mL的容量瓶中，用緩沖溶液定容后，得到濃度為1.0×10^-5mol·L^-1的熒光探針和1.0×10^-3-1.0×10^-8mol·L^-1的GSH混合待測(cè)溶液。

實(shí)施例3：

熒光探針與GSH作用的熒光光譜的測(cè)定

用pH值為7.4的緩沖溶液為溶劑測(cè)定了熒光探針與GSH作用的熒光光譜，結(jié)果如圖1。熒光探針的濃度為10μM，GSH的濃度依次為0,0.08,1.0,2.0,3.0,5.0,7.0,9.0,11.0,13.0,15.0,20.0,23.0,25.0μM，激發(fā)波長(zhǎng)固定為510nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為530～650nm，狹縫寬度為5.0nm/5.0nm。從圖1可以看出，加入GSH之前，熒光探針在576nm處沒有熒光發(fā)射峰。隨著GSH的加入，在576nm處發(fā)射峰大幅度的增強(qiáng)，并且隨著GSH濃度的增大，探針的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，當(dāng)加入25μM的GSH時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)至未加入GSH時(shí)的69倍。這是因?yàn)樘结樂肿拥娜┗cGSH反應(yīng)生成開環(huán)的羅丹明衍生物。如圖1的插圖所示，熒光強(qiáng)度跟GSH的濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，線性范圍是8.0×10^-9～25.0×10^-6M，檢測(cè)限是27nM。所用的熒光測(cè)定儀器為Perkin Elmer LS 55熒光分光光度計(jì)。圖2為熒光探針與GSH作用的機(jī)理圖，從圖中可以看出熒光探針與GSH發(fā)生了加成-水解反應(yīng)，使得螺環(huán)打開，從而導(dǎo)致熒光發(fā)生顯著變化。

實(shí)施例4：

熒光探針與GSH作用的紫外可見吸收光譜性質(zhì)的測(cè)定

圖3為熒光探針與GSH作用后的紫外可見吸收光譜圖，GSH的加入量為25μM。從圖4中可以看出，沒有加入GSH時(shí)，探針在560nm處有較弱的吸收峰，加入GSH之后，在該處的吸收峰大幅度增強(qiáng)。紫外可見吸收光譜測(cè)定用的儀器為Perkin Elmer Lambda 25型紫外可見分光光度計(jì)。

實(shí)施例5：

溶液pH值對(duì)熒光探針測(cè)定GSH的熒光性質(zhì)的影響

我們考察了pH值對(duì)熒光探針測(cè)定GSH的熒光強(qiáng)度的影響。我們研究的pH范圍為2.0～12.0，熒光探針的濃度為10μM，GSH的濃度為25μM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，熒光探針隨著pH的變化，熒光強(qiáng)度基本不變，說明pH對(duì)探針本身沒有很大的影響。然而，加入GSH之后，當(dāng)pH＜5，熒光探針隨著pH的降低熒光強(qiáng)度增大，這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，探針發(fā)生質(zhì)子化，使得羅丹明結(jié)構(gòu)處于開環(huán)狀態(tài)；。在pH>8范圍內(nèi)，隨pH的增大，熒光強(qiáng)度逐漸降低。pH在6～8的范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度基本不變。綜上所述，當(dāng)pH值在6.0到8.0之間時(shí)，不影響熒光探針對(duì)GSH的測(cè)定，這非常有利于該探針用于實(shí)際樣品中GSH的測(cè)定。

實(shí)施例6：

熒光探針與GSH作用的響應(yīng)時(shí)間的測(cè)定

為了研究熒光探針對(duì)GSH的響應(yīng)時(shí)間，我們考察了熒光探針在不同GSH濃度下(1,5,11,15μM)的熒光光譜的變化情況，其結(jié)果如圖5。從圖中可以看出，該探針對(duì)GSH的響應(yīng)時(shí)間不到90秒，滿足在實(shí)際樣品中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)時(shí)對(duì)響應(yīng)時(shí)間的要求。從圖5我們還可以看出，熒光強(qiáng)度一旦達(dá)到最大值后，在之后的時(shí)間里，熒光強(qiáng)度不再發(fā)生變化，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)，這表明此熒光探針光穩(wěn)定性好。

實(shí)施例7：

熒光探針對(duì)GSH測(cè)定的選擇性

在濃度為10μM的熒光探針溶液中加入Cys、Hcy及其它19種氨基酸(1mM)前后的熒光強(qiáng)度變化。從圖6中可以看出，加入其它的生物硫醇和其它17種氨基酸，熒光強(qiáng)度都沒有明顯的改變。盡管Asp和Glu有較小程度的熒光增強(qiáng)，但這個(gè)改變幾乎可以忽略。而相同的條件下加入GSH，在576nm處出現(xiàn)一個(gè)很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。這些結(jié)果表明，熒光探針對(duì)GSH有較好的選擇性。

實(shí)施例8：

熒光探針在活細(xì)胞中的應(yīng)用

一般情況下，細(xì)胞內(nèi)的GSH含量非常豐富，因此直接向細(xì)胞內(nèi)加入探針，也能檢測(cè)到強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)，如圖7a所示。但是，當(dāng)在加入探針之前加入一定量的硫醇抑制劑NEM時(shí)，如圖7b所示，細(xì)胞內(nèi)沒有熒光信號(hào)。然而當(dāng)再向此細(xì)胞中加入GSH時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)又出現(xiàn)了很強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)(圖7c)。而加入Cys與Hcy時(shí)，細(xì)胞內(nèi)沒有熒光(圖7d和7e)。因此可以說明，該探針可高選擇性的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的GSH。此外，我們還做了細(xì)胞毒性試驗(yàn)，如圖8所示，當(dāng)加入0～20μM GSH探針，20min之后，細(xì)胞的成活率均在98％以上，因此可以說明，該熒光探針可應(yīng)用于檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的GSH，并且毒性較小。