本發(fā)明涉及一種由原人參二醇生產(chǎn)人參皂苷Rh2的方法，更具體地說，涉及一種利用糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC或YojK對原人參二醇的C3位羥基糖基化以生產(chǎn)人參皂苷Rh2的方法。

背景技術(shù)：

人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2），俗稱護(hù)命素，因其具有護(hù)命延生的作用而得名。人參皂苷Rh2是人參中最主要的抗腫瘤活性物質(zhì)之一，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶的活性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的異常分化等功效，從而具有良好的抗腫瘤及防治腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的功效。在臨床上，人參皂苷Rh2與放療和化療等治療方式相結(jié)合，可以增強放療和化療在癌癥治療上的效果。此外，人參皂苷Rh2還具有抗過敏、提高免疫、抗疲勞和抗炎等一系列的生理功能。

人參皂苷Rh2是人參中含量極其稀少的一種人參皂苷，其在紅參中的含量只有十萬分之一左右，而在白參中幾乎不存在。目前，人參皂苷Rh2的生產(chǎn)有三種方式。（1）以中藥材人參中提取獲得的人參總皂苷為原料，利用酸水解、堿水解、酶法水解以及微生物發(fā)酵水解的方式對人參總皂苷進(jìn)行水解生產(chǎn)人參皂苷Rh2，由于人參生長周期長、生長條件苛刻、人參總皂苷含量低、提取工藝復(fù)雜以及人參皂苷Rh2的得率低，導(dǎo)致人參皂苷Rh2的生產(chǎn)成本極高，難以滿足其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。（2）以人參皂苷Rh2的前體物質(zhì)—原人參二醇為底物，通過化學(xué)法進(jìn)行糖基化修飾生產(chǎn)人參皂苷Rh2，化學(xué)法合成路線復(fù)雜、成本較高、轉(zhuǎn)化率低、立體選擇性差并且有大量副產(chǎn)物的生成，近年來已經(jīng)很少使用。（3）利用合成生物學(xué)技術(shù)在微生物細(xì)胞工廠中構(gòu)建人參皂苷Rh2的生物合成途徑生產(chǎn)人參皂苷Rh2（Wang, Pingping, et al. "Production of bioactive ginsenosides Rh2 and Rg3 by metabolically engineered yeasts." Metabolic engineering 29 (2015): 97-105.）；但是，人參皂苷Rh2對微生物細(xì)胞具有較高的毒性，導(dǎo)致微生物細(xì)胞工廠難以大量合成人參皂苷Rh2，同樣滿足不了工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

原人參二醇是人參皂苷Rh2的前體物質(zhì)，其價格較為廉價，且通過整合原人參二醇生物合成相關(guān)基因可以在釀酒酵母細(xì)胞工廠中大量生產(chǎn)原人參二醇（Dai, Zhubo, et al. "Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of ginsenosides." Metabolic engineering 20 (2013): 146-156.）。同時，酶促反應(yīng)具有催化效率高、專一性強、底物耐受性好、產(chǎn)物純化簡單等特點。因此，以價格較為低廉且供應(yīng)充足的原人參二醇為底物，挖掘表達(dá)量高、催化活性高、區(qū)域及立體選擇性強的糖基轉(zhuǎn)移酶在體外對原人參二醇進(jìn)行糖基化修飾可以大量地生產(chǎn)價格極其高昂的人參皂苷Rh2。

相對于植物（如：人參）中篩選獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶，從微生物中篩選獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶通常具有更寬廣的底物譜和更高的酶活，其催化糖基化的方式也更具多樣性，甚至可能獲得一些非天然的糖基化產(chǎn)物。例如，來自抗生鏈酶菌的糖基轉(zhuǎn)移酶OleD對137種不同的底物均有較高的活性，這些底物很多都是植物中的天然產(chǎn)物（Gantt R W, Goff R D, Williams G J, et al. Probing the aglycon promiscuity of an engineered glycosyltransferase[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2008, 47(46): 8889-8892）。因此，從微生物中開展糖基轉(zhuǎn)移酶的挖掘工作，可能發(fā)現(xiàn)對人參皂苷活性高以及甚至可以合成新型人參皂苷的糖基轉(zhuǎn)移酶。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

目前，人參皂苷Rh2的生產(chǎn)方法包括人參總皂苷的水解、原人參二醇的化學(xué)法催化及微生物細(xì)胞工廠的生物合成。人參總皂苷水解生產(chǎn)人參皂苷Rh2受原料稀缺、提取工藝復(fù)雜、產(chǎn)物得率低的影響導(dǎo)致Rh2的生產(chǎn)成本較高，難以滿足其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。另外，化學(xué)法對原人參二醇進(jìn)行糖基化修飾生產(chǎn)人參皂苷Rh2存在合成路線復(fù)雜、成本較高、轉(zhuǎn)化率低、立體選擇性差并且有大量副產(chǎn)物生成等技術(shù)問題。同時，由于人參皂苷Rh2對微生物細(xì)胞具有較高的毒性，難以通過合成生物學(xué)的方法在微生物細(xì)胞工廠中對其大量合成。

因此，本發(fā)明一方面是提供一種人參皂苷Rh2的生產(chǎn)方法，其與之前生產(chǎn)人參皂苷Rh2的典型方法相比更為經(jīng)濟和高效并能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。

技術(shù)解決方案

本發(fā)明的實施例提供一種人參皂苷Rh2的生產(chǎn)方法，包括：以原人參二醇為底物，以UDP-葡萄糖為糖基供體，利用新挖掘獲得的表達(dá)量高、催化活性強的糖基轉(zhuǎn)移酶對其C3位羥基糖基化生成人參皂苷Rh2；純化所述糖基化產(chǎn)物；以及結(jié)晶經(jīng)純化的糖基化產(chǎn)物。

有益效果

本發(fā)明提供一種以價格低廉且供應(yīng)充足的原人參二醇作為原料，利用新挖掘獲得的高效的糖基轉(zhuǎn)移酶在體外對原人參二醇進(jìn)行糖基化修飾生產(chǎn)人參皂苷Rh2的方法,從而避免了人參總皂苷的水解、原人參二醇的化學(xué)法催化及微生物細(xì)胞工廠的生物合成生產(chǎn)Rh2的過程中存在生產(chǎn)成本高、提取工藝復(fù)雜、產(chǎn)物得率低、副產(chǎn)物多、等問題，以更經(jīng)濟、更高效的方式生產(chǎn)人參皂苷Rh2，從而促進(jìn)其規(guī)模化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1 是人參皂苷Rh2和F12的合成方法。

圖2 是SDS-PAGE分析糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC的表達(dá)情況。

圖3 是SDS-PAGE分析糖基轉(zhuǎn)移酶YojK的表達(dá)情況。

圖4 是pH對糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC和YojK酶活性的影響。

圖5 是溫度對糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC和YojK酶活性的影響。

圖6 是金屬離子對糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC和YojK酶活性的影響。

圖7 是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例生產(chǎn)人參皂苷Rh2的工藝流程圖。

圖8 是根據(jù)本發(fā)明描繪的人參皂苷Rh2的生產(chǎn)工藝流程圖。

圖9 是原人參二醇或人參皂苷Rh2經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC或YojK的催化生產(chǎn)人參皂苷Rh2和人參皂苷F12的液相色譜圖。

圖10 是人參皂苷Rh2產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

圖11 是人參皂苷F12產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

圖12 是人參皂苷Rh2產(chǎn)物的核磁氫譜圖。

圖13 是人參皂苷Rh2產(chǎn)物的核磁碳譜圖。

圖14 是人參皂苷F12產(chǎn)物的核磁氫譜圖。

圖15 是人參皂苷F12產(chǎn)物的核磁碳譜圖。

具體實施方式

本發(fā)明的一個實施例，參照圖7，一種人參皂苷Rh2的生產(chǎn)方法，包括：（a）以原人參二醇為底物，以UDP-葡萄糖為糖基供體，利用糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC或YojK對原人參二醇的C3位羥基糖基化獲得人參皂苷Rh2；（b）純化以獲得所述糖基化產(chǎn)物；（c）對純化的糖基化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)晶。

參照圖7，本發(fā)明的另一個實施例，原人參二醇的來源包括從人參中提取獲得、水解人參皂苷獲得、利用微生物細(xì)胞工廠生物合成獲得或者這些方式組合獲得。另外，糖基化反應(yīng)所需糖基供體包括UDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖或其它核苷二磷酸葡萄糖的衍生物及其組合物。

本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因YjiC和YojK來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）或其突變體的酶，所述糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC和YojK的核苷酸編碼序列分別為SEQ ID No 1和2, 或者與SEQ ID No 1或2所示核酸序列的同源性≧85%（較佳地95%）且編碼的多肽產(chǎn)物對原人參二醇具有活性的核酸序列。所述糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC和YojK的多肽序列分別為SEQ ID No 3和4，或者與SEQ ID No 3或4的同源性≧85%（較佳地95%）且對原人參二醇具有活性的多肽序列。

其中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶可通過轉(zhuǎn)化或整合了核酸序列1或2的重組大腸桿菌異源表達(dá)獲得。另外，用于表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株還包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、畢赤酵母（Pichia pastoris）、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）或黑曲霉（Aspergillus nigar）。

因此，本發(fā)明的另一個實施例是重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28-YjiC和大腸桿菌BL21(DE3)/pET28-YojK，如圖2和圖3所示，在大腸桿菌BL21（DE3）中，YjiC和YojK均為完全可溶性表達(dá)，表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶在菌體破碎液的上清液中。

利用糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)人參皂苷Rh2可以在15℃-50℃和pH 4-pH 11的條件下進(jìn)行，優(yōu)選的在30℃-40℃以及pH 8-pH 9的條件下進(jìn)行，在此溫度和pH條件下，糖基轉(zhuǎn)移酶對原人參二醇進(jìn)行糖基化反應(yīng)，具有最快的反應(yīng)速率和最高的人參皂苷Rh2的得率。在其它溫度及pH條件下，糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC和YojK也可以以原人參二醇為底物，生產(chǎn)人參皂苷Rh2，但是催化活性較差，人參皂苷Rh2的得率也較低。

另外，參照圖4所述的pH對酶活的影響。在一定范圍內(nèi)，pH值增加時，酶活性隨之增加，然而，若酶反應(yīng)體系的pH值低于6或者超過10，酶活則急劇下降。酶反應(yīng)體系的pH值可以使用不同的緩沖液進(jìn)行配置，例如，三羥基氨基甲烷（Tris）的緩沖液可調(diào)節(jié)酶反應(yīng)的pH值至8.0-9.0。參照圖5所述的溫度對酶活的影響，30-40℃條件下糖基轉(zhuǎn)移酶對原人參二醇的轉(zhuǎn)化率最高，低于30℃或者高于40℃時，酶活均會下降。

在一個實施例中，利用糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC和YojK生產(chǎn)人參皂苷Rh2可以在金屬離子存在下進(jìn)行，金屬離子可作為糖基轉(zhuǎn)移酶的激活劑，具體的金屬離子包括Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺及能夠產(chǎn)生這些金屬離子的金屬鹽。參照圖6，酶活性受部分金屬離子的激活，其中，Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺對糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC和YojK具有顯著的激活作用。另外，金屬離子對糖基轉(zhuǎn)移酶的激活作用具有濃度依賴性，其濃度在5-10 mM的范圍內(nèi)對糖基轉(zhuǎn)移酶的激活作用最為顯著。

本發(fā)明中，可以使用所屬領(lǐng)域中已知的各種純化方法對生產(chǎn)的人參皂苷Rh2進(jìn)行純化。純化方法的實例包括有機溶劑萃取和工業(yè)制備色譜純化，但不限于此。通過有機溶劑萃取分離原人參二醇和人參皂苷Rh2是基于待分離產(chǎn)物在水相與有機相中溶解性差異進(jìn)行的，在一個實施例中，有機溶劑可以是乙酸乙酯，但不限于此。通過工業(yè)制備色譜方法分離人參皂苷Rh2是基于待分離產(chǎn)物與色譜柱吸附的差異來進(jìn)行的，在一個實施例中，工業(yè)制備色譜柱可以是C18型反向制備色譜柱，但不限于此。具體地說，色譜分離法是利用配置了制備型C18反向色譜柱的高壓色譜儀對糖基化產(chǎn)物進(jìn)行分離。

在一個實施例中，糖基化產(chǎn)物純化之前或之后，需要進(jìn)行脫鹽、脫色、脫蛋白或同時進(jìn)行這些處理。脫色可以加入0.03%3%重量（質(zhì)量/體積）的活性碳通過攪拌進(jìn)行，具體條件是在50-200 rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌1h-4h。

脫鹽和脫蛋白可以利用有機溶劑萃取的方式進(jìn)行。有機溶劑與糖基化產(chǎn)物的加入比可以是1：0.5到5：1，具體來說是1：1-2: 1。具體的有機溶劑包括乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等，但不限于此。在用有機溶劑萃取時，可通過多次萃取的方式以盡可能高效的回收所有糖基化產(chǎn)物，具體來說是萃取4-5次。同時，糖基化產(chǎn)物經(jīng)過多次萃取后，其回收率不低于95%。

進(jìn)一步對脫色、脫鹽和脫蛋白的糖基化產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，以利于后續(xù)純化過程。具體來說，可以將糖基化產(chǎn)物濃縮到30 g/L或者大于30 g/L，例如40 g/L。

可以通過緩慢冷切的方式對糖基化產(chǎn)物進(jìn)行降溫，使經(jīng)純化的人參皂苷Rh2結(jié)晶，從而達(dá)到分離的目的。具體地，可以以每小時0.5℃到3℃的速度將純化的糖基化產(chǎn)物從60℃冷切至10℃來進(jìn)行結(jié)晶。另外，還可對結(jié)晶獲得的人參皂苷Rh2進(jìn)一步脫水干燥，以利于純化獲得的人參皂苷Rh2的儲存與運輸。

參照圖8，一種人參皂苷Rh2的生產(chǎn)方法包含使用糖基轉(zhuǎn)移酶對原人參二醇進(jìn)行糖基化以獲得包含人參皂苷Rh2的糖基化產(chǎn)物；純化糖基化產(chǎn)物；濃縮純化的糖基化產(chǎn)物；結(jié)晶濃縮的糖基化產(chǎn)物以獲得人參皂苷Rh2晶體；以及通過脫水進(jìn)一步干燥人參皂苷Rh2晶體。

根據(jù)一個實施例的生產(chǎn)的人參皂苷Rh2的純度可以是90%或者大于90%，具體來說是95%或者大于95%，更具體的是98%或者大于98%。人參皂苷Rh2的純度的檢測可以是在步驟(b)之后并且在步驟（c)之前。在另一個實施例中，人參皂苷Rh2的純度的檢測的檢查可以在步驟（c）之后。

根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，在步驟（b）之后純化回收的未反應(yīng)的原人參二醇可以在加入到步驟（a）中循環(huán)以再次進(jìn)行糖基化反應(yīng)生成人參皂苷Rh2,或在步驟（c）之后與人參皂苷Rh2晶體分離的原人參二醇可以再次加入到步驟（b）中再循環(huán)，或者步驟（a）和步驟（b）都可進(jìn)行。

參照圖8，糖基化產(chǎn)物中人參皂苷Rh2和原人參二醇經(jīng)純化分離后，分離獲得的原人參二醇可再次用做步驟（a）中的糖基化反應(yīng)的底物。另外，參照圖8，晶體形式的人參皂苷Rh2與去除人參皂苷Rh2晶體的剩余進(jìn)料在結(jié)晶步驟中部分分離，結(jié)晶后剩余的進(jìn)料中還存在少量的人參皂苷Rh2，其可以再次用于純化。參照圖8，本發(fā)明同時描述了另一個實施例，其中再使用步驟（b）中分離的原人參二醇和再使用步驟（c）中去除晶體的進(jìn)料可以同時進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例以原人參二醇為底物，利用糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行糖基化獲得的產(chǎn)物可以是人參皂苷Rh2、人參皂苷F12所組成的組分中選出的至少1種糖基化產(chǎn)物。糖基化產(chǎn)物可以利用有機溶劑萃取以粗分離和濃縮，然后利用工業(yè)色譜進(jìn)行精制與分離。

一般來說，原人參二醇與其糖基化產(chǎn)物極性相差較大，可以使用制備型C18工業(yè)色譜柱通過高壓色譜儀進(jìn)行高效的分離，但不限于此。

在下文中，將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步的詳細(xì)描述。應(yīng)理解，所給出的具體實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的使用范圍。

實施例1 糖基轉(zhuǎn)移酶的制備

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）的基因組DNA，然后以提取獲得的枯草芽孢桿菌基因組DNA作為模板，按照表1中的引物序列，利用引物對YjiC-F和YjiC-R以及引物對YojK-F和YojK-R分別擴增獲得糖基轉(zhuǎn)移酶基因YjiC和YojK。PCR的擴增體系為：Q5 Buffer（5×）10 μL、dNTP (2.5 mM) 3 μL、基因組DNA模板：1 μL、引物（10 μM）各2.5 μL、Q5高保真聚合酶0.5 μL、補齊雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)的條件為98℃預(yù)變形3分鐘（1個循環(huán)）、98℃變形10秒、退火20秒（退火溫度均為56℃）、72℃延伸1分鐘（31個循環(huán)）、72℃延伸2分鐘（1個循環(huán)）。

表1 引物序列

PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過DNA回收試劑盒純化糖基轉(zhuǎn)移酶基因YjiC和YojK。然后，利用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI對糖基轉(zhuǎn)移酶基因YjiC和YojK以及pET28質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切處理。酶切完成之后，再次用DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，在T4連接酶的作用下，將糖基轉(zhuǎn)移酶基因YjiC和YojK分別連接到質(zhì)粒pET-28上，從而分別構(gòu)建重組載體pET28-YjiC和pET28-YojK。pET28-YjiC和pET28-YojK經(jīng)測序驗證正確后，分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中獲得重組菌株BL21(DE3)/pET28-YjiC和BL21(DE3)/pET28-YojK。

為了獲得糖基轉(zhuǎn)移酶，將重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28-YjiC和BL21(DE3)/pET28-YojK分別接種到含有50 μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃以及200 rpm的條件下，培養(yǎng)2.5 h-3 h。利用分光光度計在600 nm波長（OD₆₀₀）條件下檢測菌體密度，當(dāng)OD₆₀₀值達(dá)到0.6-0.8時，向LB培養(yǎng)基中加入異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖（IPTG）至終濃度為0.2 mM，并且在16℃以及200 rpm的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)16 h-20 h以誘導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示（圖2和圖3），YjiC和YojK在大腸桿菌中均為完全可溶性表達(dá)，且表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶大小約為45 kDa，與預(yù)測的糖基轉(zhuǎn)移酶分子大小一致（YjiC和YojK的理論分子量大小分別為44 kDa和45 kDa）。

為了測量大腸桿菌中表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC和YojK對原人參二醇以及人參皂苷Rh2的活性，利用以下方法制備糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。（1）取1L的培養(yǎng)細(xì)胞，在8000 rpm下離心10 min，收集大腸桿菌菌體，然后將收集獲得的細(xì)胞用100 mL的破碎緩沖液（25 mM Tris-HCl，pH 8.0）懸??；（2）利用超聲破碎或高壓勻漿破碎的方法使菌體裂解，然后在4℃以及20000 rpm的條件下對裂解的菌體進(jìn)行離心，收集離心后獲得的破碎液上清液即為糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。

實施例2 糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC用于生產(chǎn)人參皂苷Rh2和F12

糖基化反應(yīng)的體系包括25 mM/L的Tris-HCl（pH8.0），1 mM/L的原人參二醇或人參皂苷Rh2，3 mM/L的UDP-葡萄糖，10 mM/L的MgCl₂。按照5%（v/v）的比例加入糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC粗酶液至反應(yīng)液中，35℃，120 rpm，反應(yīng)4 h。

糖基化反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸乙酯萃取糖基化產(chǎn)物，并重復(fù)萃取4次。然后合并總共5次萃取的糖基化產(chǎn)物，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，然后加入色譜甲醇重新溶解萃取的糖基化產(chǎn)物，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對糖基化產(chǎn)物進(jìn)行檢測與定量。液相色譜儀為安捷倫1260型，色譜柱為月旭科技（上海）股份有限公司的C18色譜柱（型號：XDB-C18, 250×4.6 mm，5 μm），梯度洗脫條件為：0-25min，25%-85%乙腈；25-45min，85%乙腈。柱溫箱30℃，流速為1 mL/min，紫外檢測波長203 nm。質(zhì)譜條件為：正離子模式，離子源：ESI離子源。如圖9所示，以原人參二醇為底物，YjiC對原人參二醇的轉(zhuǎn)化率為85%，并可催化原人參二醇生成2種糖基化產(chǎn)物（F12和Rh2）。其中產(chǎn)物F12和Rh2的比率為1.3：1。另外，YjiC對人參皂苷Rh2也有活性，可以催化人參皂苷Rh2生成單一的人參皂苷F12產(chǎn)物，且YjiC對人參皂苷Rh2的轉(zhuǎn)化率為86%。質(zhì)譜結(jié)果顯示（圖10和圖11），F(xiàn)12和Rh12的分子量分別為785.5033 [M+H]⁺和623.4502 [M+H]⁺，從而確定兩個產(chǎn)物分別為原人參二醇糖基化后生成的帶有兩個葡萄糖分子和一個葡萄糖分子的糖基化產(chǎn)物。

實施例3 糖基轉(zhuǎn)移酶YojK催化原人參二醇生產(chǎn)人參皂苷Rh2

糖基化反應(yīng)的體系包括25 mM/L的Tris-HCl（pH8.0），1 mM/L的原人參二醇，3 mM/L的UDP-葡萄糖，10 mM/L的MgCl₂ 。按照10%（v/v）的比例加入糖基轉(zhuǎn)移酶YojK粗酶液至反應(yīng)液中，35℃，120 rpm，反應(yīng)4 h。

糖基化反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸乙酯萃取糖基化產(chǎn)物，并重復(fù)萃取4次。合并所有萃取產(chǎn)物后，將萃取的產(chǎn)物利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行干燥，然后加入色譜甲醇溶解萃取的糖基化產(chǎn)物，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對糖基化產(chǎn)物進(jìn)行檢測與定量。液相色譜儀為安捷倫1260型，色譜柱為上海月旭科技的C18色譜柱（型號：XDB-C18, 250×4.6 mm， 5 μm），梯度洗脫條件為：0-25min，25%-85%乙腈；25-45min，85%乙腈。柱溫箱30℃，流速為1 mL/min，紫外檢測波長203 nm。質(zhì)譜條件為：正離子模式，離子源：ESI離子源。如圖9所示，YojK催化原人參二醇可以生成單一的1種糖基化產(chǎn)物（Rh2），且YjiC對原人參二醇的轉(zhuǎn)化率為72%。質(zhì)譜結(jié)果顯示（圖11），該產(chǎn)物（人參皂苷Rh2）的分子量為623.4502 [M+H]⁺，從而確定該產(chǎn)物為原人參二醇連接上一個葡萄糖分子的糖基化產(chǎn)物。

實施例4 工業(yè)色譜純化糖基化產(chǎn)物

按照實施例2和3中的反應(yīng)體系配置1000 mL的反應(yīng)液。35℃條件下，分別以YjiC和YojK為糖基化反應(yīng)的催化劑，反應(yīng)12 h。反應(yīng)完成后用等體積的乙酸乙酯（1000 mL）對糖基化產(chǎn)物萃取4次，合并乙酸乙酯萃取產(chǎn)物并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮與干燥，然后，利用C18工業(yè)色譜柱對糖基化產(chǎn)物進(jìn)行純化，高壓液相色譜條件為：流速10 mL/min，流動相為蒸餾水和色譜甲醇，梯度洗脫條件為：0min-50min，50%-100%甲醇。通過色譜純化，可同時獲得原人參二醇的糖基化產(chǎn)物人參皂苷F12和人參皂苷Rh2，人參皂苷F12和人參皂苷Rh2的純度分別為95%和92%。

實施例5 人參皂苷Rh2和F12的結(jié)晶與干燥

對從實施例4中通過工業(yè)色譜分離純化獲得的人參皂苷Rh2和人參皂苷F12溶液進(jìn)行結(jié)晶。首先，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱濃縮純化的人參皂苷Rh2溶液和人參皂苷F12溶液，使人參皂苷Rh2溶液和人參皂苷F12的濃度為30 g/L，然后，以每小時0.5℃的速度使人參皂苷Rh2溶液和人參皂苷F12溶液從55℃緩慢降低至10℃使人參皂苷Rh2和人參皂苷F12分別結(jié)晶。

獲得人生皂苷Rh2和人參皂苷F12晶體后，通過離心收集晶體。然后利用流化床干燥器，在70℃條件下處理2 h，干燥人參皂苷Rh2和人參皂苷F12晶體。同時，對晶體的檢測結(jié)果表明，人參皂苷Rh2和人參皂苷F12的回收率分別為為91%和94%，且人參皂苷Rh2和人參皂苷F12的純度均為99.9%以上，從而獲得了高純的人參皂苷Rh2和人參皂苷F12產(chǎn)品。

實施例6 人參皂苷Rh2和F12的結(jié)構(gòu)鑒定

取600 μL的氘代二甲基亞砜和氘代甲醇分別溶解30 mg高燥處理的人參皂苷Rh2和人參皂苷F12粉末，在400MHz條件下，利用核磁共振儀對純化的兩種糖基化產(chǎn)物（人參皂苷Rh2和人參皂苷F12）進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，如表2所示，碳譜和氫譜的結(jié)果表明這兩個產(chǎn)物分別是人參皂苷Rh2（原人參二醇的C3位羥基糖基化產(chǎn)物）和人參皂苷F12（原人參二醇的C3位和C12羥基同時糖基化產(chǎn)物）（核磁圖譜如圖12-圖15所示）。其中，人參皂苷F12是自然界中不存在的新型人參皂苷。

表2 人參皂苷Rh2和人參皂苷F12的碳譜和氫譜

表2 人參皂苷Rh2和人參皂苷F12的碳譜和氫譜

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所

<120> 一種稀有人參皂苷Rh2的生產(chǎn)方法

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis 168）

<400> 1

atgaaaaagt accatatttc gatgatcaat atcccggcgt acggacatgt caatcctacg 60

cttgctttag tagagaagct ttgtgagaaa gggcaccgtg tcacgtacgc gacgactgag 120

gagtttgcgc ccgctgttca gcaagccggt ggagaagcat tgatctatca tacatccttg 180

aatattgatc ctaagcaaat cagggagatg atggaaaaga atgacgcgcc cctcagcctt 240

ttgaaagaat cactcagcat tctgccgcag cttgaggagt tatataagga tgatcagcct 300

gatctgatca tctatgactt tgttgcgctg gctggtaaat tgtttgctga aaagcttaat 360

gttccggtca ttaagctctg ttcgtcatat gcccaaaatg aatcctttca gttaggaaat 420

gaagacatgc tgaaaaaaat aagagaagca gaggctgaat ttaaagccta cttggagcaa 480

gagaagttgc cggctgtttc atttgaacag ttagctgtgc cggaagcatt aaatattgtc 540

tttatgccga agtcttttca gattcagcat gagacgttcg atgaccgttt ctgttttgtc 600

ggcccctctc tcggagaacg gaaggaaaaa gaaagcctgt tgattgacaa ggatgatcgc 660

ccgcttatgc tgatttcttt gggtacggcg tttaacgcat ggccggaatt ttacaagatg 720

tgcatcaagg catttcggga ttcttcatgg caagtgatca tgtcggttgg gaaaacgatt 780

gatccagaaa gcttggagga tattcctgct aactttacca ttcgccaaag tgtgccgcag 840

cttgaggtgt tagagaaagc tgatttgttc atctctcatg gcgggatgaa cagtacgatg 900

gaagcgatga acgcaggtgt gccgcttgtc gtcattccgc aaatgtatga gcaggagctc 960

actgcaaatc gggttgatga attaggcctt ggcgtttatt tgccgaaaga ggaagtgact 1020

gtttccagcc tgcaggaagc ggttcaggct gtatccagtg atcaagagct gctcagccgc 1080

gtcaagaata tgcaaaagga tgtaaaagaa gctggcggag cggagcgtgc ggcagctgag 1140

attgaagcgt ttatgaaaaa atccgctgtc ccgcagtaa 1179

<210> 2

<211> 1218

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）

<400> 2

atggctaatg tattaatgat cggtttcccc ggtgaagggc atattaatcc ctctatcggt 60

gtgatgaagg agctgaaatc ccggggagaa aacattacgt actacgcagt gaaggaatat 120

aaagaaaaaa tcacagctct tgatatagag tttcgtgagt atcatgattt cagaggagat 180

tacttcggga aaaacgcaac cggcgatgaa gaaagagatt tcacagaaat gctctgcgct 240

tttttgaaag cctgtaagga tatcgcgact catatttatg aggaagtcaa acatgaatcg 300

tatgattatg tcatatatga tcaccatctt ctcgcgggta aagtcattgc caacatgctg 360

aagctgccaa gattttcatt gtgtacaacc tttgcgatga atgaggaatt tgcgaaggaa 420

atgatgggag cgtacatgaa aggatcactt gaagattcgc ctcattatga atcataccag 480

cagcttgcag aaacgttaaa tgctgatttt caagcagaga tcaagaagcc atttgatgtt 540

tttttagctg atggtgactt gacaatcgtc tttacatcaa ggggatttca gccactggct 600

gagcaatttg gcgagcgata tgtatttgtc ggtccttcca ttacagaaag agccggaaac 660

aatgatttcc catttgatca gattgacaat gaaaacgtgc tgtttatttc aatgggaacc 720

atttttaata atcaaaagca gttttttaat caatgccttg aagtgtgtaa ggactttgac 780

ggtaaagttg tgctttccat cggcaagcat attaaaacaa gtgagttaaa cgacattccg 840

gagaatttca ttgtacgccc gtatgtccct cagcttgaga tcttgaaaag agccagctta 900

tttgtgaccc acggcggaat gaacagcaca agtgaaggtt tgtattttga aaccccgctc 960

gttgtcattc cgatgggagg cgaccaattt gttgtcgcag atcaggtaga aaaagtcggc 1020

gcaggaaaag taattaaaaa ggaagaattg tctgaaagcc tactgaaaga gacgatacaa 1080

gaagtaatga ataatcgttc gtatgctgaa aaggcaaaag aaattggaca atcactgaaa 1140

gcggcaggcg gctctaaaaa agcagccgac agcattcttg aagctgtaaa acaaaaaact 1200

caatcagcaa atgcatag 1218

<210> 3

<211> 392

<212> PRT

<213> 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）

<400> 3

Met Lys Lys Tyr His Ile Ser Met Ile Asn Ile Pro Ala Tyr Gly His

1 5 10 15

Val Asn Pro Thr Leu Ala Leu Val Glu Lys Leu Cys Glu Lys Gly His

20 25 30

Arg Val Thr Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Phe Ala Pro Ala Val Gln Gln

35 40 45

Ala Gly Gly Glu Ala Leu Ile Tyr His Thr Ser Leu Asn Ile Asp Pro

50 55 60

Lys Gln Ile Arg Glu Met Met Glu Lys Asn Asp Ala Pro Leu Ser Leu

65 70 75 80

Leu Lys Glu Ser Leu Ser Ile Leu Pro Gln Leu Glu Glu Leu Tyr Lys

85 90 95

Asp Asp Gln Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Asp Phe Val Ala Leu Ala Gly

100 105 110

Lys Leu Phe Ala Glu Lys Leu Asn Val Pro Val Ile Lys Leu Cys Ser

115 120 125

Ser Tyr Ala Gln Asn Glu Ser Phe Gln Leu Gly Asn Glu Asp Met Leu

130 135 140

Lys Lys Ile Arg Glu Ala Glu Ala Glu Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Gln

145 150 155 160

Glu Lys Leu Pro Ala Val Ser Phe Glu Gln Leu Ala Val Pro Glu Ala

165 170 175

Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Lys Ser Phe Gln Ile Gln His Glu Thr

180 185 190

Phe Asp Asp Arg Phe Cys Phe Val Gly Pro Ser Leu Gly Glu Arg Lys

195 200 205

Glu Lys Glu Ser Leu Leu Ile Asp Lys Asp Asp Arg Pro Leu Met Leu

210 215 220

Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro Glu Phe Tyr Lys Met

225 230 235 240

Cys Ile Lys Ala Phe Arg Asp Ser Ser Trp Gln Val Ile Met Ser Val

245 250 255

Gly Lys Thr Ile Asp Pro Glu Ser Leu Glu Asp Ile Pro Ala Asn Phe

260 265 270

Thr Ile Arg Gln Ser Val Pro Gln Leu Glu Val Leu Glu Lys Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Ile Ser His Gly Gly Met Asn Ser Thr Met Glu Ala Met Asn

290 295 300

Ala Gly Val Pro Leu Val Val Ile Pro Gln Met Tyr Glu Gln Glu Leu

305 310 315 320

Thr Ala Asn Arg Val Asp Glu Leu Gly Leu Gly Val Tyr Leu Pro Lys

325 330 335

Glu Glu Val Thr Val Ser Ser Leu Gln Glu Ala Val Gln Ala Val Ser

340 345 350

Ser Asp Gln Glu Leu Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Gln Lys Asp Val

355 360 365

Lys Glu Ala Gly Gly Ala Glu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Glu Ala Phe

370 375 380

Met Lys Lys Ser Ala Val Pro Gln

385 390

<210> 4

<211> 405

<212> PRT

<213> 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）

<400> 4

Met Ala Asn Val Leu Met Ile Gly Phe Pro Gly Glu Gly His Ile Asn

1 5 10 15

Pro Ser Ile Gly Val Met Lys Glu Leu Lys Ser Arg Gly Glu Asn Ile

20 25 30

Thr Tyr Tyr Ala Val Lys Glu Tyr Lys Glu Lys Ile Thr Ala Leu Asp

35 40 45

Ile Glu Phe Arg Glu Tyr His Asp Phe Arg Gly Asp Tyr Phe Gly Lys

50 55 60

Asn Ala Thr Gly Asp Glu Glu Arg Asp Phe Thr Glu Met Leu Cys Ala

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ala Cys Lys Asp Ile Ala Thr His Ile Tyr Glu Glu Val

85 90 95

Lys His Glu Ser Tyr Asp Tyr Val Ile Tyr Asp His His Leu Leu Ala

100 105 110

Gly Lys Val Ile Ala Asn Met Leu Lys Leu Pro Arg Phe Ser Leu Cys

115 120 125

Thr Thr Phe Ala Met Asn Glu Glu Phe Ala Lys Glu Met Met Gly Ala

130 135 140

Tyr Met Lys Gly Ser Leu Glu Asp Ser Pro His Tyr Glu Ser Tyr Gln

145 150 155 160

Gln Leu Ala Glu Thr Leu Asn Ala Asp Phe Gln Ala Glu Ile Lys Lys

165 170 175

Pro Phe Asp Val Phe Leu Ala Asp Gly Asp Leu Thr Ile Val Phe Thr

180 185 190

Ser Arg Gly Phe Gln Pro Leu Ala Glu Gln Phe Gly Glu Arg Tyr Val

195 200 205

Phe Val Gly Pro Ser Ile Thr Glu Arg Ala Gly Asn Asn Asp Phe Pro

210 215 220

Phe Asp Gln Ile Asp Asn Glu Asn Val Leu Phe Ile Ser Met Gly Thr

225 230 235 240

Ile Phe Asn Asn Gln Lys Gln Phe Phe Asn Gln Cys Leu Glu Val Cys

245 250 255

Lys Asp Phe Asp Gly Lys Val Val Leu Ser Ile Gly Lys His Ile Lys

260 265 270

Thr Ser Glu Leu Asn Asp Ile Pro Glu Asn Phe Ile Val Arg Pro Tyr

275 280 285

Val Pro Gln Leu Glu Ile Leu Lys Arg Ala Ser Leu Phe Val Thr His

290 295 300

Gly Gly Met Asn Ser Thr Ser Glu Gly Leu Tyr Phe Glu Thr Pro Leu

305 310 315 320

Val Val Ile Pro Met Gly Gly Asp Gln Phe Val Val Ala Asp Gln Val

325 330 335

Glu Lys Val Gly Ala Gly Lys Val Ile Lys Lys Glu Glu Leu Ser Glu

340 345 350

Ser Leu Leu Lys Glu Thr Ile Gln Glu Val Met Asn Asn Arg Ser Tyr

355 360 365

Ala Glu Lys Ala Lys Glu Ile Gly Gln Ser Leu Lys Ala Ala Gly Gly

370 375 380

Ser Lys Lys Ala Ala Asp Ser Ile Leu Glu Ala Val Lys Gln Lys Thr

385 390 395 400

Gln Ser Ala Asn Ala

405