本發(fā)明涉及生物制品制備技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種魚蛋白肽的制備方法及其得到的魚蛋白肽和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于各種意外，燙傷常有發(fā)生，燙傷不僅造成皮膚的毀損，而且還會(huì)引起嚴(yán)重的全身性反應(yīng)，尤其是大面積燙傷，全身反應(yīng)甚為劇烈，可出現(xiàn)各系統(tǒng)器官的代謝紊亂和功能失調(diào)，帶來嚴(yán)重甚至是巨大的傷害。燙傷治療存在著創(chuàng)面疼痛、進(jìn)行性壞死、易感染、瘢痕愈合等難題。治療燒燙傷的藥物亦是針對(duì)這四個(gè)問題進(jìn)行研究的，有中藥和西藥兩大類，中藥對(duì)燙傷的治療作用在于抗菌、收斂、生肌、清熱、消腫和止痛等藥用療效；西藥在于消炎、抗感染、生肌、促進(jìn)傷口愈合和促進(jìn)上皮生長(zhǎng)等。目前較多應(yīng)用抗生素類藥物來預(yù)防治療燙傷創(chuàng)面感染、消炎和抗菌。傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和受損組織的組織層被盡可能地恢復(fù)到正常狀態(tài)，而傷口攣縮是愈合過程的一部分，是指成纖維細(xì)胞遷移至受傷組織，隨后傷口區(qū)域收縮。對(duì)于傷口的快速愈合有必要為再生受損組織提供更好的條件，包括各種生長(zhǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等肽或蛋白類物質(zhì)。促進(jìn)傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜和昂貴的過程，研究促進(jìn)傷口愈合的藥物是十分必要且很有意義的課題。
肽的可溶性強(qiáng)，容易被吸收，生物效價(jià)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比游離氨基酸高，許多活性肽不僅能提供人體生長(zhǎng)、發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與能量還具有防治疾病、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的重要功能。這些功能是原料食品蛋白質(zhì)或其組成氨基酸所不具備的，這也是目前活性肽引起廣泛重視的重要原因之一。酶解法水解天然蛋白是目前制備肽的最廣泛應(yīng)用的一種方法，該法條件溫和，產(chǎn)品安全度高。海洋與淡水水產(chǎn)資源已成為獲取及制備活性肽的重要來源，一方面是水產(chǎn)蛋白肽鏈中普遍蘊(yùn)含著功能區(qū)，即氨基酸以特定序列通過肽鍵連接而成的肽段，該肽段為活性肽的前體物質(zhì)，經(jīng)釋放后可具有特殊的生物活性，另一方面是水產(chǎn)蛋白作為動(dòng)物蛋白，氨基酸組成比例平衡，必需氨基酸含量高，蛋白質(zhì)消化吸收率達(dá)85～90%。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，多肽作為治療疾病的藥物受到人們?cè)絹碓蕉嗟仃P(guān)注，因其是最符合人體生物學(xué)調(diào)節(jié)規(guī)律的治療手段，可以避免許多其他類型藥物給人體帶來的不良反應(yīng)，藥用多肽已引起人們的高度重視。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種魚蛋白肽的制備方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述方法獲得的魚蛋白肽。
本發(fā)的第三個(gè)目的是提供上述魚蛋白肽的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：
一種魚蛋白肽粉的制備方法，將魚肉糜漿加入蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解后滅酶活，再經(jīng)離心、陶瓷膜微濾即得魚蛋白肽液，干燥后即得魚蛋白肽粉；所述蛋白酶選自中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶中的一種或多種；所述蛋白酶的加入量為400IU/g～1500 IU/ g。
利用酶解技術(shù)將魚蛋白降解為分子量大小不等的多肽、低聚肽及游離氨基酸的混合液，利用離心分離除渣，經(jīng)陶瓷膜微濾分離去除大分子，并能達(dá)到澄清脫色的目的，得到多肽粗蛋白含量在90.0%以上，分子量在3000道爾頓以下的占95%以上，1000道爾頓以下的占75%以上的蛋白肽產(chǎn)品。
優(yōu)選地，酶解的溫度為50～55℃，酶解的時(shí)間為3～5小時(shí)。
優(yōu)選地，所述陶瓷膜的孔徑為50nm～200nm。
優(yōu)選地，所述魚肉糜漿是將去除內(nèi)臟、去鰓、清洗、切塊并絞碎后的魚肉糜與水混合制得，所述魚肉糜與水的質(zhì)量比為1∶1～1∶2.5。
優(yōu)選地，所述滅酶活的操作是酶解結(jié)束后將酶解液升溫至90℃～95℃，滅酶10分鐘～15分鐘。
本發(fā)明還提供所述方法獲得的魚蛋白肽。
本發(fā)明還提供所述魚蛋白肽在促進(jìn)燙傷皮膚床上愈合中的應(yīng)用，具體地，是將魚蛋白肽粉加水拌成糊狀，涂抹于創(chuàng)傷皮膚表面。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明提供了一種魚蛋白肽粉的制備方法，將魚肉糜漿加入蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解后滅酶活，再經(jīng)離心、陶瓷膜微濾即得魚蛋白肽液，干燥后即得魚蛋白肽粉；所述蛋白酶選自中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶中的一種或多種；所述蛋白酶的加入量為400IU/g～1500 IU/ g，該方法過程簡(jiǎn)單，操作容易，利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；生產(chǎn)獲得的魚蛋白肽，涂抹給藥，在劑量為每個(gè)創(chuàng)面50～150mg時(shí)對(duì)燙傷皮膚有促進(jìn)愈合的作用。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若無特別說明，實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法和技術(shù)，試劑或材料均為通過商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1
一、魚蛋白肽的制備
取4kg已處理好的羅非魚肉糜，放入30L酶解罐中，按料液比為1：2.5（重量比）的比例加入自來水，攪拌均勻，待物料水溶液溫度達(dá)到50℃，同時(shí)加入中性蛋白酶（500 IU /g）和木瓜蛋白酶（425 IU /g），酶解5小時(shí)后，升溫至95℃滅酶10分鐘，酶解液冷卻后，采用三足式離心機(jī)離心（轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘）去渣，采用膜孔徑為200nm的無機(jī)管式陶瓷膜對(duì)離心后的酶解液進(jìn)行循環(huán)式微濾，當(dāng)殘留液體積約為進(jìn)料液的10%時(shí)，停止操作，得到透過液，透過液經(jīng)真空濃縮至固形物含量20%以上，經(jīng)噴霧干燥制備成干粉即為魚蛋白肽粉。
獲得的蛋白肽粗蛋白含量為91.92%，灰分4.53%，脂肪0.7%；分子量在3000道爾頓以下的多肽占98.64%，1000道爾頓以下的占76.37%。
二、魚蛋白肽對(duì)新西蘭兔燙傷創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)
新西蘭兔，體重1608～2367 g，普通級(jí)，雌雄各半，共48只。新西蘭兔肌注速眠新（約0.5mL/只）和靜注戊巴比妥鈉（約0.6mL/kg））進(jìn)行聯(lián)合麻醉。兔背部脫毛區(qū)皮膚以75%乙醇消毒后，使用超級(jí)控溫燙傷儀在新西蘭兔背部?jī)蓚?cè)各制備一個(gè)深Ⅱ度/Ⅲ度燙傷創(chuàng)面，創(chuàng)面面積為4cm2，設(shè)模型對(duì)照組，陽性對(duì)照組（采用濕潤(rùn)燒傷膏，汕頭市美寶制藥有限公司），魚蛋白肽組，每組16只新西蘭兔；
模型對(duì)照組：造模后不進(jìn)行給藥。
陽性對(duì)照組：造模當(dāng)天開始，燙傷創(chuàng)面以潤(rùn)濕燙傷膏進(jìn)行涂抹治療，每個(gè)創(chuàng)面涂抹軟膏約1.0 mL，每天涂抹一次，連續(xù)涂抹28 d。
魚蛋白肽組：用適量滅菌注射用水溶解攪拌魚蛋白肽成糊狀，灌裝于50 mL注射器中用于皮膚給藥。每個(gè)創(chuàng)面涂抹約150 mg，每天涂抹一次，給藥后以無刺激醫(yī)用膠布包扎固定4 h，連續(xù)涂抹28 d。
給藥第11天，模型對(duì)照組動(dòng)物燙傷創(chuàng)面開始縮小，創(chuàng)面愈合率為8.7%；陽性對(duì)照組動(dòng)物燙傷創(chuàng)面愈合率高于模型對(duì)照組，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。魚蛋白肽組動(dòng)物燙傷創(chuàng)面可見顯著縮小，創(chuàng)面愈合率為42.3%，顯著高于模型對(duì)照組和陽性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥第18、21、25天，與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和魚蛋白肽組動(dòng)物燙傷創(chuàng)面愈合均優(yōu)于模型對(duì)照組，創(chuàng)面愈合率均顯著高于模型對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），（見表1）。
給藥第7天，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、魚蛋白肽組創(chuàng)面新生表皮部分覆蓋分別為2例、2例、1例，各治療組新西蘭兔燙傷部位皮膚病理損傷修復(fù)與模型對(duì)照組基本相同。（見表2）。
給藥第14天，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、魚蛋白肽組創(chuàng)面新生表皮完全覆蓋分別為2例、0例、6例，提示魚蛋白肽組新西蘭兔燙傷部位皮膚病理損傷修復(fù)優(yōu)于模型對(duì)照組。（見表2）。
給藥第21天，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、魚蛋白肽組創(chuàng)面新生表皮完全覆蓋分別為5例、6例、7例，表皮成熟度（+++）分別為2例、6例、7例，提示陽性對(duì)照組、魚蛋白肽組新西蘭兔燙傷部位皮膚病理損傷修復(fù)優(yōu)于模型對(duì)照組。（見表3）。
給藥第28天，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、魚蛋白肽K組、魚蛋白肽T組、魚蛋白肽TP組、貝蛋白肽P組創(chuàng)面新生表皮完全覆蓋分別為6例、7例、6例，表皮成熟度（+++）分別為2例、6例、6例，提示陽性對(duì)照組、魚蛋白肽組新西蘭兔燙傷部位皮膚病理損傷修復(fù)優(yōu)于模型對(duì)照組。（見表3）。
綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，魚蛋白肽對(duì)兔燙傷皮膚具有促進(jìn)愈合作用。